Documenti di Didattica
Documenti di Professioni
Documenti di Cultura
LABORATORIO 5
Caracterizacin fenotpica de microorganismos: pruebas bioqumicas
Lecitinasa
En esta prueba se investiga la presencia de lecitinasa (un factor de virulencia) que
acta sobre la lecitina (fosfatidil colina) de la membrana citoplasmtica. Para la prueba
se utilizan medios slidos a los cuales se les agrega yema de huevo (que contiene
lecitina). Las colonias con actividad lecitinsica formarn un halo opaco a su alrededor.
Para el caso de Bacillus cereus, se utilizar el medio de Mossel al cual se le habr
agregado una suspensin de yema de huevo al 50% en NaCl 0,85%, a razn de 1ml de
suspensin por cada 9 ml de medio.
Hemlisis
Esta prueba est relacionada con la presencia de factores de virulencia llamados
citolisinas que son capaces de formar poros en la membrana citoplasmtica de
diferentes clulas eucariticas. Un sistema indicador adecuado lo constituyen los
glbulos rojos ya que la lisis de stos (hemlisis) es fcilmente demostrable. Para la
realizacin de la prueba, se incorpora sangre de oveja o carnero al 5% en un medio
nutritivo slido estril, fundido y templado (55 C aproximadamente). Las placas se
secan a 37C y se siembra el microorganismo en estudio.
Interpretacin:
a) hemlisis: destruccin parcial de los glbulos rojos acompaada por una
coloracin verdosa o parduzca.
b) hemlisis: destruccin total de los glbulos rojos que se observa como una zona
transparente alrededor de la colonia.
c) ausencia de hemlisis: no hay cambios visibles.
1
Microbiologa General - 2011
Facultad de Ciencias Exactas - UNLP
El medio se envasa de forma tal que la zona inferior sea recta y la superior en pico de
flauta.
Los monosacridos en el pico de flauta son catabolizados por la va de la gliclisis hasta
cido pirvico y posteriormente es degradado por medio del ciclo de Krebs para dar CO 2,
H2O y energa. La regeneracin del NAD+ se realiza mediante la cadena respiratoria con
O2 como ltimo aceptor de electrones.
En la zona recta del medio de cultivo, que posee baja concentracin de O 2, los
monosacridos tambin son metabolizados por la va de la gliclisis hasta cido pirvico
pero luego son convertidos en diversos productos finales estables como cido lctico y/u
otros cidos orgnicos, aldehdos, alcoholes, CO2, H2 y energa.
Para una correcta interpretacin de esta prueba es muy importante realizar la lectura
luego de 18 a 24 hs. Lecturas prematuras o demoradas podrn conducir a
interpretaciones errneas.
2
Microbiologa General - 2011
Facultad de Ciencias Exactas - UNLP
Interpretacin:
Luego de la incubacin pueden observarse:
Para obtener un resultado vlido deber realizarse una primera lectura a las 24 hs y una
segunda luego de 2 a 5 das de incubacin a 37C.
Revelado:
Sobre una alcuota del medio desarrollado agregar unas gotas de indicador Rojo de
Metilo.
Interpretacin:
3
Microbiologa General - 2011
Facultad de Ciencias Exactas - UNLP
El rojo de metilo conserva su color rojo a valores bajos de pH ( 4,2) indicando que se
han producido cidos estables capaces de vencer la capacidad buffer del medio. Si el
indicador vira al amarillo la prueba de RM es negativa (pH 6).
Prueba de Voges-Proskauer
Esta prueba permite determinar la capacidad de algunos microorganismos de producir
un compuesto neutro, el acetilmetilcarbinol, a partir de la fermentacin de la glucosa.
La reaccin de VP se basa en la deteccin del acetilmetilcarbinol (acetona). En presencia
de O2 (atm) y lcali los productos finales neutros acetona y 2,3-butanodiol son oxidados
a diacetilo, que es el reactante para el color producido en la reaccin. El diacetilo
reacciona con el ncleo guanidinio de la arginina presente en la peptona, en medio
alcalino, dando un color rojizo en la superficie del medio.
La velocidad de desarrollo de color depende de la concentracin de acetona, por lo
general el color se produce de los 2 a 5 minutos, obtenindose la mxima intensidad de
color luego de una hora.
El medio de cultivo utilizado es el de Clark y Lubs, el cual se siembra y se incuba a 37C
durante 24 hs.
Revelado:
Primero: Sobre una alcuota del medio desarrollado agregar 6gotas de una solucin
alcohlica de -naftol al 5% (acta como catalizador en la oxidacin de la acetona a
diacetilo). Debe adicionarse antes del lcali.
Segundo: Luego se agregan 2 gotas de una solucin de KOH o NaOH al 40%. Se agita el
tubo suavemente favoreciendo la oxidacin de la acetona por el O2 atmosfrico.
Interpretacin:
Reaccin positiva: la aparicin de color rojo-rub en la superficie del medio indica la
presencia de acetona.
Reaccin negativa: color amarillo o cobrizo, corresponde al color de los reactivos.
Triptofanasa
+ NH3 + CH3COCOOH
4
Microbiologa General - 2011
Facultad de Ciencias Exactas - UNLP
Extracto de carne 3
Medio de cultivo: caldo triptona. Peptona 5
(Composicin g/l) Triptona 20
A.D. c.s.p. 1000ml pH
final 7
Revelado:
Se utiliza el reactivo de Kovacs: p-dimetilaminobenzaldehdo en alcohol amlico y HCl.
Agregar al tubo desarrollado 5 gotas y agitar.
Interpretacin:
La aparicin de color rojo en la capa alcohlica se debe a la formacin de un compuesto
de condensacin entre el p-dimetilaminobenzaldehdo y el indol.
Prueba de oxidacin-fermentacin
Permite determinar el metabolismo oxidativo o fermentativo de un microorganismo sobre
un determinado hidrato de carbono
La fermentacin es un proceso metablico que no requiere O 2. Se caracteriza por la
fosforilacin inicial del hidrato de carbono (glucosa-6-fosfato) y requiere de un
compuesto orgnico como aceptor final de electrones.
Los procesos oxidativos son estrictamente aerbicos. El proceso de oxidacin directa
del hidrato de carbono, que se da en el grupo fluorescente del gnero Pseudomonas, no
requiere de la fosforilacin inicial del azcar. La glucosa se oxida a cido glucnico o 2-
cetoglucnico y posteriormente se fosforila y degrada a cido pirvico.
5
Microbiologa General - 2011
Facultad de Ciencias Exactas - UNLP
minutos. Luego se enfra bajo canilla sin agitar y se siembra por puncin.
Inmediatamente se cubre con 1 cm de parafina o vaselina lquida estril ("Tubo sin O2").
Ambos tubos se incuban a 35C durante 48 hs. Algunos microorganismos requieren
hasta 2 semanas de incubacin.
Interpretacin:
6
Microbiologa General - 2011
Facultad de Ciencias Exactas - UNLP
Revelado e interpretacin:
Presencia de N2: se verifica la presencia de gas en la campanita.
Presencia de NH3: Agregar a una porcin del cultivo unas gotas del reactivo de Nessler
(iodomercuriato de potasio). Este reactivo, en presencia de iones amonio se descompone
con formacin de ioduro de dimercuriamonio que permite una determinacin
colorimtrica de iones amonio. Si se observa un precipitado color ladrillo rpidamente,
indica un resultado positivo.
Presencia de NO2-: Agregar a una porcin del cultivo 2 gotas del reactivo Nit-1
(solucin actica de cido sulfanlico) y luego 2 gotas del reactivo Nit-2 (solucin actica
de alfa dimetilnaftilamina).
7
Microbiologa General - 2011
Facultad de Ciencias Exactas - UNLP
Proteinasas
Protena + H2O polipptidos
Peptidasas
Polipptidos + H2O aminocidos
Extracto de carne 3
Medio de cultivo: Gelatina nutritiva Peptona 5
Composicin g/l Gelatina 12
Prueba de la Coagulasa
La coagulasa es capaz de activar especficamente la cascada de coagulacin por
activacin conformacional (no proteoltica) de la protrombina. Este proceso
desencadena la conversin de fibringeno en fibrina lo cual da lugar a la coagulacin
an en presencia de anticoagulantes como el citrato o el oxalato. El resultado es la
formacin de cogulos o grumos cuando se mezcla una suspensin bacteriana con
plasma. Esta prueba se utiliza para diferenciar microorganismos del gnero
Staphylococcus:
(+) Staphylococcus aureus
(- ) Staphylococcus epidermis
Procedimiento e interpretacin:
-Prueba rpida en portaobjetos: se prepara una suspensin bien homognea del
microorganismo sobre el portaobjetos y se agrega una gota de plasma de conejo. Se
mezclar suavemente con el ansa y despus por rotacin. La prueba se considera positiva
si hay aglutinacin microscpica.
8
Microbiologa General - 2011
Facultad de Ciencias Exactas - UNLP
Las bacterias que utilizan el citrato como fuente de C utilizarn el amonio presente en el
medio de cultivo, como fuente de nitrgeno.
Se envasa, esteriliza y deja solidificar en posicin inclinada. Se siembra por estras con
ansa recta. Se incuba durante 24 hs.
La aparicin de desarrollo con intenso color azul indica un resultado positivo.
Extracto de carne 5
Medio de cultivo Peptona de casena 10
Peptona de carne 5
NaCl 5
DNA 2 9
Agar 15
Microbiologa General - 2011
Facultad de Ciencias Exactas - UNLP
(Composicin g/l)
Revelado e interpretacin:
Se revela cubriendo la placa con una solucin de HCl 1N. El HCl provocar la
precipitacin del DNA intacto.
Ensayo positivo: se observa una zona clara alrededor del spot que contrasta con la
turbidez del medio (el cultivo produce DNAsa).
Ensayo negativo: ausencia de dicha zona clara.
El medio se puede modificar agregando azul de toluidina o verde de metilo en
concentracin de 0.05 gr/lt. El mtodo tiene una ventaja que permite detectar la
actividad de DNasa mediante la transparencia del colorante alrededor de las colonias
productoras de DNasa. NO se agrega cido y las colonias se pueden recoger
directamente de la placa para estudios posteriores.
Infusin de carne 2
Medio de cultivo hidrolizado de casena 17.5
(Composicin g/l) almidn 1.5
Agar 13
Revelado e interpretacin:
Se revela baando el desarrollo con una solucin I2-Iodurada (Lugol al 5%).
El medio conteniendo almidn se teir de azul, contrastando con el halo incoloro que se
observa alrededor de la estra del cultivo capaz de hidrolizar el almidn.
Prueba de la Ureasa
Es particularmente til para diferenciar Proteus spp. de otros miembros de la familia
Enterobacteriaceae.
El medio de cultivo, formulado por Rustigian y Stuart, presenta bajo contenido de
nutrientes y alta capacidad buffer. El extracto de levadura es la nica fuente de
carbono, nitrgeno, vitaminas y cofactores, y aporta los nutrientes esenciales para el
desarrollo bacteriano. Las sales de fosfatos constituyen el sistema buffer, el rojo de fenol
10
Microbiologa General - 2011
Facultad de Ciencias Exactas - UNLP
Urea 20
Medio de cultivo Fosfato monopotsico 9.1
(Composicin g/l) Fosfato disdico 9.5
Extracto de levadura 0.1
Rojo fenol 0.01
pH final: 6.8 0.2
Incubacin
A 35-37 C, en aerobiosis. Observar las reacciones a las 8, 12, 24 y 48 horas de
incubacin. Para aquellos microorganismos que hidrolizan lentamente la urea, incubar
hasta 72 horas. -La gran capacidad buffer de este medio de cultivo, puede enmascarar la
actividad uresica en bacterias que hidrolizan lentamente la urea.
No calentar o sobrecalentar el medio de cultivo porque la urea se descompone
fcilmente.
Produccin de pigmentos
Agar F:
Medio de cultivo utilizado para el aislamiento, la deteccin y la diferenciacin de
especies de Pseudomonas spp. en base a la produccin de fluorescena. Conocido
tambin como medio King B. En el medio de cultivo, la triptena y la peptona de carne
aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la glicerina favorece la
produccin de pigmentos, la concentracin de fosfatos estimula la produccin de
fluorescena e inhibe la produccin de piocianina y piorrubina.
agar F
(composicin en g/l)
Triptena 10
Peptona de carne 10
Fosfato dipotsico 1.5
Sulfato de magnesio 1.5
Agar 15
pH final: 7.2 0.2
Al medio, luego de esterilizado, se le agrega 10 ml de glicerina estril.
A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, del cual se sospeche la presencia de
Pseudomonas spp., tomar una colonia y estriar la superficie del medio. Incubar durante
11
Microbiologa General - 2011
Facultad de Ciencias Exactas - UNLP
Interpretacin de resultados
Examinar las colonias bajo luz ultravioleta, a 260 nm. Se considera un resultado positivo
la observacin de fluorescena, que es un pigmento de color amarillo, amarillo-verdoso
fluorescente que rodea la colonia o que se extiende por todo el medio de cultivo debido
a fenmenos de difusin.
Limitaciones
Algunas cepas de P. fluorescens y P. putida solo producen fluorescena a temperatura
ambiente, y se pueden obtener resultados falsos negativos si el medio se incuba a 30-
35C, por eso, ante la ausencia de crecimiento luego de incubacin a 35-37C, se
recomienda dejar los tubos conteniendo el medio de cultivo a temperatura ambiente.
agar P
(composicin en g/l) Peptona de gelatina 20
Sulfato de potasio 10
Cloruro de magnesio 1.4
Agar 15
pH final: 7.0 0.2
12
Microbiologa General - 2011
Facultad de Ciencias Exactas - UNLP
Interpretacin de resultados
Un resultado positivo se verifica por observacin de los pigmentos piocianina y/o
piorrubina. La produccin de piocianina se observa como una zona color azul, azul-
verdoso que rodea la colonia, o que se extiende en todo el medio de cultivo debido a la
difusin del pigmento. La produccin de piorrubina se observa como una zona de color
rojo oscuro-pardo alrededor de la colonia o que se extiende en todo el medio de cultivo
debido a la difusin del pigmento.
Limitaciones
- La ausencia de piocianina no descarta que el microorganismo aislado sea P.
aeruginosa. - Bajas cantidades de piocianina pueden no ser evidenciadas, por eso, ante
la sospecha de su presencia, se recomienda agregar al medio de cultivo unas gotas de
cloroformo, para exaltar la visualizacin del pigmento.
- La presencia concomitante de piorrubina y/o piomelanina, puede afectar la
visualizacin del color caracterstico de la piocianina.
- La produccin de pigmento, puede aumentarse dejando los tubos conteniendo medio
de cultivo a 22 C luego de haberlos incubado previamente toda la noche a 35-37 C.
Medio SIM
13
Microbiologa General - 2011
Facultad de Ciencias Exactas - UNLP
Siembra: A partir de un cultivo de 18-24 horas en medio slido, sembrar por puncin
profunda con aguja de inoculacin recta (no usar ansa con anillo). Se debe inocular el
centro del tubo, y la puncin debe abarcar 2 tercios de profundidad del medio de
cultivo desde la superficie. Es importante que la siembra se realice en lnea recta.
Resultados:
Cepas mviles: producen turbidez del medio, que se extiende mas all de la lnea de
siembra.
Cepas inmviles: el crecimiento se observa solamente en la lnea de siembra.
Cepas SH2 positivas: ennegrecimiento a lo largo de la lnea de siembra o en todo el
medio.
Cepas SH2 negativas: el medio permanece sin cambio de color.
Cepas indol positivas: desarrollo de color rojo luego de agregar el reactivo de Kovacs
o de Erlich.
Limitaciones
-En las bacterias aerobias estrictas, que slo crecen en superficie, la movilidad puede
ser difcil de observar.
14
Microbiologa General - 2011
Facultad de Ciencias Exactas - UNLP
Siembra:
15
Microbiologa General - 2011
Facultad de Ciencias Exactas - UNLP
Incubacin
Incubar los tubos 24-48 horas a 35-37 C.
Resultados
Se considera resultado positivo el viraje al amarillo del color del medio y la produccin
de gas
16