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El trmino biotecnologa puede parecer nuevo para el pblico amplio, pero, la biotecnologa est
presente en la vida cotidiana hace mucho tiempo. De hecho, la biotecnologa es una actividad
antigua, que comenz hace miles de aos cuando el hombre descubri que al fermentar las uvas se
obtena un producto como el vino. Tambin es biotecnologa la fabricacin de cerveza a partir de la
fermentacin de cereales que el hombre empez a elaborar hace 4.000 aos, y la fermentacin de
jugo de manzanas para la fabricacin de sidra. En estos procesos intervienen microorganismos que
transforman componentes del jugo de frutas o de cereales en alcohol.
El trmino biotecnologa puede significar que se trata de una disciplina individual, pero la esencia
de la biotecnologa es su naturaleza multidisciplinaria, la cual requiere amplias aportaciones de la
ciencia y la ingeniera. Esto quiz se ilustra mejor en la figura siguiente:
Produccin de yogures probiticos en los que se usa el microorganismo entero que est
presente en el producto final.
Muchos antibiticos son fabricados por microorganismos, como la penicilina que la fabrica
un hongo de la familia penicillium.
Las enzimas son protenas que tiene la funcin de catalizadores biolgicos, que aceleran
reacciones qumicas, haciendo que el proceso sea ms rpido y eficiente que cualquier otro
proceso qumico. Las enzimas se utilizan habitualmente en los detergentes o polvo para lavar
la ropa. Por ejemplo, lipasas para sacar manchas de grasas, proteasas para sacar manchas de
protenas, etc. Cada tipo de enzima tiene un rango de temperaturas dentro del cual es activa.
En la temperatura ptima acta al 100% y al alejarse de esa temperatura disminuye su
funcin. Para determinados procesos en los cuales se necesitan temperaturas extremas, se
van a emplear enzimas provenientes de organismos extremfilos que pueden actuar a
temperaturas extremas (altas o bajas). Por ejemplo, la ropa de hospital que requiere
esterilizacin se lava con productos que tengan enzimas que funciones a temperaturas altas,
mientras que el lavado en agua fra emplea enzimas provenientes de microorganismos que se
desarrollan en temperaturas bajas.
Las enzimas tambin se usan en la industria textil para ablandar los jeans. En este caso se usa
celulasa, que degrada la celulosa que es el principal componente de las clulas vegetales
(entre ellas, las clulas del algodn que es el principal componente de la tela de jean).
Mediante un proceso controlado (temperatura, tiempo, cantidad y tipo de celulasa) se logran
diferentes texturas de jean. Tambin se usa la enzima celulasa en la industria del papel (que
est formado por celulosa) para lograr diferentes texturas.
Actualmente, los cientficos comprenden mucho ms cmo ocurren los procesos biolgicos que
permiten la fabricacin de productos biotecnolgicos. Esto les ha permitido desarrollar nuevas
tcnicas a fin de modificar o imitar algunos de esos procesos y lograr una variedad mucho ms
amplia de productos. Los cientficos hoy saben, adems, que los microorganismos sintetizan
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Biotecnologa 2017
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compuestos qumicos y enzimas que pueden emplearse eficientemente en procesos industriales.
Estos conocimientos dieron lugar al desarrollo de la biotecnologa moderna.
Biotecnologa
Tradicional:
Empleo de organismos Biotecnologa Hoy:
para la obtencin de un Es el empleo de organismos vivos
producto til para la para la obtencin de un bien o servicio
industria. til para el hombre, e incluye la
+ produccin de protenas
recombinantes, el mejoramiento de
cultivos vegetales, animal y el empleo
Biotecnologa de organismos para limpiar el medio
Moderna: ambiente.
Indudablemente con la biologa moderna est avanzando nuestra tecnologa para manejar
organismos complejos, incluyendo nuestra propia especie. Est mejorando nuestro entendimiento de
muchos procesos tradicionales, en los que los agentes biolgicos se utilizaron de forma menos
controlada o deliberada. As por ejemplo, la biotecnologa de las fermentaciones, tal y como la
conocemos actualmente, se origino no de los antiguos descubrimientos caseros del vino y la col
fermentada, ni siquiera del conocimiento obtenido mediante observacin tal y como se obtuvo en el
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siglo 19, sino de las primeras aplicaciones de los agentes microbianos seleccionados a procesos,
con fines especficos.
Se puede tambin intentar definir la biotecnologa en funcin de lo que realiza, esperando evitar
quedar rpidamente retrasados si consideramos lo que puede hacer.
En competicin con la explotacin de organismos enteros, puede ser usada para fabricar
substancias especiales de plantas y productos de clulas animales, estos ltimos bien sea
directamente o en clulas microbianas transformadas para que produzcan antgenos,
anticuerpos o distintos agentes teraputicos o de diagnostico.
Estn empezando a ampliarse los mtodos genticos tradicionales para el desarrollo de cepas
nuevas. O mejoradoras de plantas o animales para uso convencional en agricultura.
Por consiguiente la definicin de Biotecnologa es muy amplia, claramente cambia con el tiempo y
ciertamente se ampliar en nuevas direcciones que aun no podemos prever.
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Se desconoce el origen exacto de los primeros intentos del hombre en la utilizacin de organismos
vivos para obtener un beneficio, pero la transicin de sus hbitos cazador-recolector a la vida en
comunidades y ciudades, es acompaada por innovaciones que pueden considerarse como los
primeros indicios de actividades biotecnolgicas. As, se encontraron evidencias de esas
actividades en culturas ancestrales como la china, griega, sumeria y otras que habitaron la tierra
5000 aos A.C. Durante este perodo, dado que el hombre desconoce la existencia de los
microorganismos, gran parte de los procesos biotecnolgicos son de carcter emprico, y estn
relacionados principalmente a la elaboracin de alimentos.
4000 AC: Los egipcios descubren cmo preparar pan leudado. Se establecen otros procesos
de fermentacin en el mundo antiguo, especialmente en China. La transformacin de la leche
por bacterias cido-lcticas resulta en la preparacin de yogurt. Se utilizan hongos
filamentosos (mohos) para producir queso, y otros procesos de fermentacin para
manufacturar vino y vinagre.
1000 DC: Los hindes notan que ciertas enfermedades permanecen en la familia. Ms an,
llegan a creer que los chicos heredan todas las caractersticas de sus padres.
1100 1700 DC: La generacin espontnea es la explicacin dominante acerca del origen
de los organismos a partir de materia inerte.
1300 DC: Los aztecas en Mxico cosechan algas de los lagos como una fuente de alimento.
1400 DC: La destilacin de una gran variedad de bebidas alcohlicas a partir de granos
fermentados se distribuye mundialmente. Egipto y Persia dejan de lado estos procesos por
influencia del Islam. Los cereales fermentados son base de la dieta africana (an en la
actualidad).
1492 DC: Cristbal Coln y otros exploradores que visitan Amrica, llevan maz (originario
de este continente) al resto del mundo, y los cultivadores europeos adaptan el cultivo a sus
condiciones locales. Los navegantes tambin llevan papas, cultivo nativo de los Andes
americanos.
1630 DC: William Harvey concluye que las plantas y los animales se reproducen
sexualmente: la contraparte masculina aporta el polen y la femenina los ovocitos. Pasarn
ms de 200 aos hasta corroborarse por microscopa la existencia de las gametas.
1665 DC: Robert Hooke observa la estructura celular del corcho. Pasarn 200 aos hasta que
las tcnicas microscpicas permitan a los cientficos descubrir que todos los organismos
estn compuestos por clulas.
1673 DC: Anton Van Leeuwenhoek, comerciante holands, utiliza sus microscopios para
realizar descubrimientos en microbiologa. Es el primer investigador en describir a las
bacterias y protozoos, entre otros microorganismos.
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Perodo 1700-1900
1798: El mdico ingls Edward Jenner publica un trabajo donde compara la vacunacin
(infeccin intencional a los humanos con el virus de la viruela bovina para inducir resistencia
a viruela) con la inoculacin (infeccin a los humanos con una cepa suave de viruela para
inducir resistencia a cepas ms severas de la enfermedad). Sus ideas surgen de observar que
las personas expuestas al virus de la viruela bovina, no eran vulnerables al virus de la viruela
humana. La palabra vacuna deriva de la palabra en latn vaccinus ( de las vacas).
1809: Un cocinero francs, Nicols Appert, desarrolla una tcnica que permite enlatar y
esterilizar los alimentos a altas temperaturas, y gana un premio entregado por Napolen.
1850s: Nuevas herramientas agrcolas (arados tirados por caballos, mquinas sembradoras,
cortadoras de forrajes, rastrillos) se vuelven populares en Europa, y en EE.UU. se introduce
alimento para animales procesado industrialmente, y fertilizantes inorgnicos,
revolucionando las prcticas agrcolas.
1856: Luis Pasteur (1822 - 1895) demuestra que los microorganismos son responsables de la
fermentacin. Sus experimentos posteriores demostrarn que la fermentacin es el resultado
de la actividad de levaduras y bacterias.
1859: Charles Darwin (1809 - 1882) trabaja en su teora de la seleccin natural como
mecanismo de evolucin de las especies. Su libro El origen de las Especies se publica en
Londres.
1864: Luis Pasteur desarrolla el proceso de pasteurizacin, calentando el lquido hasta lograr
la inactivacin de los microorganismos presentes, que podran agriarlo. Desde entonces
productos como la leche pueden ser transportados sin deteriorarse.
1865: Gregor Mendel (1822 - 1884), un monje austriaco presenta las leyes de la herencia a
la Sociedad de Ciencias Naturales en Brunn, Austria. Mendel propone que existen unidades o
factores de informacin responsables de los caracteres observables, y que tales factores
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(luego conocidos como genes) son transmitidos de una generacin a la siguiente. El trabajo
de Mendel permaneci ignorado hasta 1900, cuando los cientficos De Vries, Von Tschermak
y Correns corroboran el mecanismo propuesto por Mendel.
1870: Walter Flemming descubre el proceso de divisin celular conocido como mitosis.
1880: Pasteur publica su trabajo sobre cepas atenuadas o dbiles que no seran patgenas
pero protegeran contra otras formas ms severas.
1881: Robert Koch describe colonias bacterianas creciendo en rodajas de papa, medio
gelatinoso y medio agarizado. El agar nutritivo se convierte en una herramienta comn para
obtener cultivos puros y para identificar mutantes. Esto es considerado como uno de los
descubrimientos ms importantes que origin la microbiologa. En el mismo ao, Pasteur
utiliza la atenuacin para desarrollar vacunas contra patgenos bacterianos responsables del
clera aviario y del ntrax y resulta clave en la historia de la inmunologa ya que se abre el
campo de la medicina preventiva.
1884: Pasteur desarrolla la vacuna contra la rabia, que ser ensayada en humanos en 1885.
1892: El ruso Dimitri Ivanovsky y su grupo descubren al agente causante del mosaico del
tabaco (TMV). Reportan que el agente es transmisible y puede atravesar filtros que retienen
a las bacterias ms pequeas. Esos agentes se denominarn aos despus virus.
1897: El qumico alemn Eduard Buchner demuestra que la fermentacin puede ocurrir en
un extracto de levaduras (sin levaduras vivas), un descubrimiento clave para la bioqumica y
la enzimologa.
Millones de personas mueren a causa de dos guerras mundiales, empujando a la medicina hacia
nuevos lmites. Durante la Primera Guerra Mundial, se desarrollan procesos de fermentacin para
producir acetona a partir del almidn y solventes para pinturas, necesarios para la industria
automotriz en crecimiento. En los aos 30 el esfuerzo se focaliza en tratar de usar los subproductos
de la agricultura para suplir a la industria en lugar de petroqumicos. La llegada de la Segunda
Guerra Mundial trae consigo la manufactura de la penicilina. As, el foco biotecnolgico apunta a
los compuestos farmacuticos.
1902: El bilogo estadounidense Walter Sutton seala que los cromosomas llevaran los
factores hereditarios sugeridos por Mendel.
1909: El botnico dans Wilhelm Ludvig Johannsen acua el trmino 'gen' para describir al
elemento transportador de los caracteres hereditarios. Denomina genotipo a la constitucin
gentica de un organismo, y fenotipo a la expresin del genotipo.
1910: Tomas Hunt Morgan, genetista estadounidense, experimenta con moscas y prueba que
los genes estn en los cromosomas, estableciendo las bases de la gentica moderna.
1912: El fsico britnico Lawrence Bragg descubre que los rayos X pueden usarse para
estudiar la estructura molecular de sustancias cristalinas. Este hallazgo conduce al desarrollo
de la tcnica de cristalografa de rayos X, que posibilitar explorar las estructuras
tridimensionales de cidos nucleicos y protenas, jugando un rol crtico para el
descubrimiento de la estructura de la molcula de ADN aos ms tarde.
1919: El economista e ingeniero hngaro Kroly Ereky publica en Berln su obra clsica,
"Biotechnologie", donde acua el trmino Biotecnologa segn su visin de una nueva era
tecnolgica basada en la bioqumica. Fue considerado padre fundador de la biotecnologa.
1926: El genetista estadounidense Hermann Muller descubre que los rayos X inducen
mutaciones en las moscas de la fruta, aportando un instrumento para inducir mutaciones con
diversos fines.
1928: El bacterilogo ingls Frederick Griffiths observa que unas bacterias con apariencia
rugosa cambian a lisa cuando un principio transformante desconocido de la bacteria lisa
est presente. Luego de 16 aos, Oswald Avery identificar la naturaleza de tal principio
transformante: ADN. En otras reas, Lewis Stadler demuestra que la radiacin U.V. tambin
puede inducir mutaciones, y Alexander Fleming observa que todas las bacterias creciendo en
un radio alrededor de la especie de hongo filamentoso (moho) Penicillium notatum mueren,
comenzando as la era de la penicilina. Pasarn ms de 15 aos hasta que la penicilina est
disponible para su uso mdico por la comunidad.
1935: Andrei Nikolaevitch Belozersky asla ADN en estado puro por primera vez.
1939: El fisilogo francs Roger Jean Gautheret obtiene y cultiva callos (tejidos
indiferenciados) de zanahoria
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1940-1950: Los pases occidentales comienzan a emplear mquinas en vez de animales en el
campo.
1944: Se produce penicilina a gran escala. , Oswald Theodore Avery, Colin MacLeod y
Maclyn McCarty determinaron que el ADN es el material hereditario involucrado en la
transformacin de las bacterias de fenotipo rugoso a liso. Al principio, esta hiptesis no
tendra muchos adeptos, porque la molcula de ADN pareca demasiado simple para
contener toda la informacin gentica de un organismo, a diferencia de las protenas. Por su
parte, Frederick Sanger utiliza un nuevo mtodo denominado cromatografa para
determinar la secuencia de aminocidos de la molcula de insulina bovina. Ese ao, la
cientfica estadounidense Brbara McClintock, descubre que los genes pueden transponerse
(saltar) de una posicin a otra del genoma. Recibir en 1983 el premio Nbel por el
descubrimiento de los transposones.
1946: D.C. Salmon, un consejero militar norteamericano radicado en Japn, enva a EE.UU.
la variedad de trigo Norin 10, fuente del gen de enanismo que luego ayudara a producir las
variedades de trigo de la Revolucin Verde.
1950: El qumico austriaco Erwin Chargaff descubre que las cantidades de las bases
nitrogenadas adenina y timina son aproximadamente iguales en el ADN, al igual que las
bases guanina y citosina. Estas relaciones se conoceran luego como la regla de Chargaff,
sirviendo como principio clave en los anlisis de varios modelos de estructura del ADN por
Watson y Crick. En el rea agropecuaria, se logra la inseminacin artificial del ganado,
utilizando semen congelado.
1952: Alfred Hershey y Martha Chase realizan los experimentos de licuadora usando fagos
(virus que infectan bacterias, descubiertos en 1917). Postulan que si se marcan de manera
diferente las molculas de ADN y las protenas, se puede determinar cul de ellas est
involucrada en el proceso de replicacin del fago en la bacteria. Descubren que el ADN, y no
las protenas, puede ingresar desde el fago a la bacteria, aportando otra evidencia a favor de
la naturaleza nucleica del material gentico. Ese ao, el bilogo molecular norteamericano
Joshua Lederberg introduce el trmino plsmido para describir a las estructuras de material
gentico extracromosmico presentes en las bacterias, y William Hayes descubre el
fenmeno de conjugacin bacteriana (transmisin directa de genes de una bacteria a otra).
1953: James Watson y Francis Crick, con el aporte de Rosalind Franklin, proponen un
modelo de estructura para el ADN: molcula doble cadena, helicoidal, con dos hebras
complementarias y antiparalelas. Por ello recibirn el Premio Nbel en 1962. Adems,
William Hayes descubre que los plsmidos pueden usarse para transferir marcadores
genticos introducidos de una bacteria a otra.
Expandiendo los lmites de la investigacin del ADN. El descubrimiento de la estructura del ADN
result en una explosin en la investigacin de la biologa molecular y la gentica.
1957: Los investigadores Francis Crick y George Gamov proponen el "dogma central de la
biologa", que sugiere que la informacin gentica fluye en una sola direccin, desde el
ADN, pasando por ARN mensajero, finalizando en la sntesis de protenas (concepto central
que luego sera modificado con el descubrimiento de la replicacin de los retrovirus como el
HIV). Matthew Meselson y Franklin Stahl demuestran el mecanismo de replicacin del
ADN.
1958: Arthur Kornberg descubre y asla la ADN polimerasa, que se convierte en la primera
enzima para sintetizar ADN en un tubo de ensayo. Adems, ese ao, abre en Colorado el
Laboratorio Nacional de almacenamiento de semillas (NSSI), el primer organismo para el
almacenado de semillas a largo plazo del mundo.
1959: Reinart es capaz de regenerar plantas completas a partir de los cultivos indiferenciados
de callos de zanahoria.
1961: Marshall Nirenberg construye una hebra de ARNm formada nicamente por varias
copias de la base uracilo. Examinndola, descubre que el triplete de bases Uracilo (UUU)
codifica para el aminocido fenilalanina. Este fue el primer paso en el descifrado del cdigo
gentico.
1966: Se descifra el cdigo gentico. Marshall Nirenberg, Heinrich Mathaei, y Severo Ochoa
demuestran que una secuencia de tres bases nucleotdicas (denominada codn) determina
cada uno de los 20 aminocidos.
1972: Paul Berg asla y emplea una enzima de restriccin para cortar el ADN; utiliza tambin
una enzima ligasa para pegar dos fragmentos de ADN, formando una molcula hbrida
circular, generando as la primer molcula de ADN recombinante. En una carta pblica, Berg
y colegas proponen al Instituto Nacional de Salud de EE.UU. (NIH) generar un conjunto de
guas para regular los experimentos con ADN recombinante, hasta que se pudieran resolver
cuestiones relacionadas con la biotica y la bioseguridad de los mismos. Sus preocupaciones
derivarn en la Conferencia de Asilomar de 1975.
1973: Por primera vez los cientficos logran transferir ADN de un organismo a otro. Stanley
Cohen, Annie Chang y Herbert Boyer ensamblan fragmentos de ADN viral y bacteriano
cortando con la misma enzima de restriccin, creando un plsmido recombinante. Luego lo
introducen en la bacteria Escherichia coli, produciendo as el primer organismo
recombinante, transgnico o genticamente modificado.
1975: Conferencia de Asilomar. Los cientficos piden al gobierno que adopte normas para
regular la experimentacin con ADN recombinante, e insisten en el desarrollo de cepas de
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bacterias seguras que no salgan del mbito del laboratorio. Por su parte, Georges Kohler y
el argentino Csar Milstein fusionan clulas para producir anticuerpos monoclonales.
1976: Herbert Boyer y Robert Swanson fundan Genentech Inc., una compaa
biotecnolgica dedicada al desarrollo y a la venta de productos basados en la tecnologa del
ADN recombinante. El NIH enuncia las primeras reglas para la experimentacin con ADN
recombinante, restringiendo varios tipos de experimentos.
1977: Genentech, Inc., informa la produccin en bacterias, por primera vez, de una protena
humana: somatostatina (factor inhibitorio de la liberacin de hormona de crecimiento).
Walter Gilbert y Allan Maxam desarrollan un mtodo para secuenciar el ADN por
degradacin qumica, mientras que Sanger y sus colegas proponen un mtodo de
secuenciacin enzimtico que rpidamente se transformara en el mtodo de eleccin de los
investigadores.
1980: La Suprema Corte de EE.UU. establece que, en su pas, los organismos modificados
genticamente son patentables y, en 1980, permite a la compaa petrolera Exxon patentar un
microorganismo degradador de petrleo.
1981: Bill Rutter y Pablo Valenzuela publican un sistema de produccin del antgeno de
superficie del virus causal de la hepatitis B, en levaduras, dando los primeros pasos en el
desarrollo de la vacuna recombinante. Cientficos producen los primeros animales
transgnicos: son ratones. En el rea vegetal, se obtienen los primeros callos vegetales
transformados genticamente.
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1982: Genentech, Inc. recibe la aprobacin de la Administracin de Alimentos y Drogas de
EE.UU. (en ingls, FDA) para comercializar la insulina humana recombinante (producida en
E. coli), aprobando as la primera droga generada por esta tcnica.
1983: Laboratorios de EE.UU. y Francia aslan el virus del HIV. Un estudio de una familia
en Venezuela con la enfermedad de Huntington, muestra un patrn distinto y caracterstico
de RFLP en los individuos enfermos, llevando al desarrollo de un test de diagnstico basado
en dicha metodologa. El mismo mtodo revelar patrones caractersticos de las
enfermedades fibrosis qustica y distrofia muscular, entre otras. K. Mullis y colegas
desarrollan una tcnica para multiplicar fuera de la clula fragmentos de ADN de manera
especfica, denominada Reaccin en cadena de la polimerasa (o PCR), estableciendo una
de las tcnicas ms revolucionarias en biologa molecular. Tambin ese ao se obtienen
plantas de tabaco transformadas genticamente
1986: Se realizan ensayos de campo por primera vez, de plantas transgnicas resistentes a
insectos, virus y bacterias, en EE.UU. y Europa. En EE.UU. la Agencia de Proteccin
Ambiental (EPA, en ingls) aprueba la liberacin del primer cultivo modificado por
ingeniera gentica: tabaco. El NIH, por su parte, aprueba guas para realizar ensayos
clnicos de terapia gnica en humanos. Las empresas Caltech y Applied Biosystems, Inc,
desarrollan el secuenciador automtico de ADN por fluorescencia. La FDA otorga una
licencia a Chiron Corp. para la primer vacuna recombinante (para prevenir la hepatitis B).
1989: Se crea el Centro Nacional para la investigacin del Genoma Humano en EE.UU.,
dirigido por James Watson, con el objetivo de mapear y secuenciar el genoma humano
completo para el ao 2005, y contar para ello con la suma de 3 mil millones de dlares.
1990: Calgene conduce el primer ensayo de campo exitoso con plantas de algodn
transgnicas (tolerantes al herbicida Bromoxynil), y Michael Fromm, reporta la
transformacin estable del maz usando una pistola gnica de alta velocidad. Adems,
GenPharm International, Inc. desarrolla la primer vaca transgnica para producir protenas
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humanas en su leche para la formulacin de leches para bebs. Ese ao, se lleva a cabo el
primer protocolo de terapia gnica, en una nia de 4 aos con una enfermedad autoinmune
denominada ADA. La terapia resulta exitosa, pero desata una gran discusin tica en el
entorno acadmico y tambin en los medios. Se inicia el Proyecto Genoma Humano, como
un consorcio mundial para secuenciar el genoma humano, con un costo estimado de 13 mil
millones de dlares. El gobierno de los Estados Unidos autoriza por primera vez el uso de
una enzima recombinante en la fabricacin de alimentos: la quimosina, para la elaboracin
del queso.
1991: En Argentina se crea una instancia de consulta y apoyo tcnico para asesorar al
Secretario de Agricultura, Ganadera, Pesca y Alimentacin en la formulacin e
implementacin de la regulacin para la introduccin y liberacin al ambiente de materiales
animales y vegetales obtenidos mediante Ingeniera Gentica: la Comisin Nacional Asesora
de Biotecnologa Agropecuaria (CONABIA).
1992: Se reporta la transformacin estable de trigo. Alrededor de 400 ensayos de campo con
cultivos transgnicos se realizan en todo el mundo. Ya se obtienen plantas transgnicas con
composicin modificada de hidratos de carbono, y de cidos grasos.
1994: La FDA aprueba el primer cultivo genticamente modificado utilizado como alimento:
el tomate Flavr Savr. Para obtenerlo, se introduce el gen que codifica para la enzima
poligalacturonasa en una disposicin particular para que, al transcribirse, genere molculas
de ARN complementarias al ARNm de poligalacturonasa propio de la planta, impidiendo as
su traduccin. Dado que dicha enzima es la responsable de degradar la pectina (componente
de la pared celular vegetal que le da firmeza a la misma), los frutos de la planta de tomate
transgnico Flavr Savr permanecen firmes por ms tiempo, mejorando su uso en la industria
alimenticia y su comercializacin. Por otro lado, el USDA (Departamento de Agricultura de
EE.UU.) y la FDA aprueban la soja tolerante a herbicida. En otro contexto, se identifican los
genes relacionados con una serie de enfermedades, incluyendo melanoma, sordera, dislexia,
cncer de tiroides, cncer de prstata y enanismo. Esta tarea se realiza por anlisis de
ligamiento similares a los realizados con la familia venezolana (1983) y otras tcnicas ms
avanzadas. Ese ao se da a conocer un primer mapa aproximado del genoma humano.
1996: El gobierno del Reino Unido anuncia que 10 personas se han infectado con el agente
BSE (causante del Mal de la vaca loca en animales) por exposicin a carne contaminada.
Se reporta la secuenciacin del genoma completo de la levadura Saccharomyces cerevisiae,
utilizada para la fabricacin del vino, del pan y de la cerveza. Se secuencian tambin los
genomas de un grupo de bacterias particulares que habitan ambientes extremos (temperaturas
muy extremas, concentracin de sal muy elevada, etc.; se las denomina extremfilas). Su
estudio otorga a los cientficos herramientas para la obtencin de nuevas enzimas de
aplicacin industrial (enzimas activas a temperaturas, pH, salinidad extremas). A nivel
mundial, se aprueba la comercializacin de los primeros cultivos transgnicos (soja, algodn
y maz). Particularmente en Argentina, se aprueba la comercializacin de la soja tolerante a
glifosato.
1997: Investigadores del Instituto Roslin de Escocia, reportan el clonado de una oveja,
conocida mundialmente como Dolly, a partir de una clula de la ubre de una oveja adulta. Se
completa la secuenciacin del genoma de Borrelia burgdorferi, patgeno causal de la
enfermedad de Lyme, junto con los genomas de Escherichia coli y Helicobacter pylori
(bacteria causal de la lcera gstrica). Tambin se aprueba el Rituxan, el primer
medicamento para una terapia anticancergena basada en anticuerpos (para pacientes
enfermos de linfoma no Hodkin).
2001: Se publica el primer borrador del genoma humano. En Argentina, se aprueban para su
comercializacin cultivos de algodn transgnico tolerante al herbicida glifosato y otro maz
resistente a insectos lepidpteros.
2002: Se completa por primera vez el genoma de un cultivo comestible, el arroz, que
constituye la fuente de alimento principal de las dos terceras partes de la poblacin mundial.
2003: Se completa el Proyecto Genoma Humano, con un total de 2,85 mil millones de
nucletidos secuenciados, comprendiendo entre 20.000 y 25.000 genes estimados. Una
empresa argentina, Bio Sidus, obtiene por primera vez una ternera (Mansa) que en su leche
contiene hormona de crecimiento humana. Por otro lado, 7 millones de agricultores siembran
67,7 millones de hectreas de cultivos GM en 18 pases. Argentina ocupa el segundo lugar,
con 14 millones de hectreas de soja, maz y algodn. La adopcin asciende al 98%, 50% y
20% de las superficies totales para estos cultivos, respectivamente.
2004: Secuencian el genoma del pollo. Argentina autoriza el primer maz tolerante a
herbicida, anticipndose por primera vez en una aprobacin regulatoria a la UE.
2006: Los cultivos GM alcanzan las 100 millones de hectreas en todo el mundo.
2007: La empresa argentina Bio Sidus obtiene vacunos clonados y transgnicos que portan el
gen que codifica para la insulina humana (conocidos como dinasta Patagonia), con el objeto
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de obtener la hormona a partir de su leche. Otro grupo de investigacin local logra la
gestacin del primer clon equino de Amrica latina. Argentina siembra maz con
caractersticas acumuladas (resistencia a insectos y tolerancia a herbicida) y Brasil autoriza
un maz GM por primera vez, iniciando una etapa de aceleracin en las aprobaciones y en la
adopcin de transgnicos.
2009: De secuencia el primer genoma bovino de una vaca Hereford. Cientficos de Dubai
logran desarrollar el primer clon de camello. Tambin se clona el primer toro campen de la
raza Brangus en el mundo. Se completa la secuencia del genoma del sorgo, del maz y del
cerdo domstico. Cientficos de Estados Unidos logran mapear el genoma de todos los
rinovirus causantes del resfro comn. Descubren bacterias vivas bajo un glaciar de la
Antrtida. La Administracin de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos (FDA) aprueba
un frmaco (antitrombina) producido en cabras. Argentina siembra algodn con
caractersticas acumuladas (resistencia a insectos y tolerancia a herbicida) y supera las 20
millones de hectreas de cultivos GM. La adopcin representa el 100% de la soja, el 98% del
algodn y el 82% del maz.
2011: Se logra la secuenciacin del genoma de la papa realizado por un grupo de cientficos
de 14 pases (incluyendo a investigadores del INTA Balcarce). Asimismo, se secuencia el
genoma de Medicago truncatula, un pariente cercano de la alfalfa y un modelo para el
estudio de la biologa de las plantas leguminosas. Cientficos argentinos secuencian por
primera vez el genoma de un microorganismo que sobrevive en condiciones extremas en la
Puna Argentina. Expertos surcoreanos crean un cerdo transgnico capaz de producir rganos
para trasplantes a humanos. En Argentina, se desarrolla el primer bovino genticamente
modificado del pas, que en su edad adulta producir leche semejante a la leche materna.
Brasil autoriza la siembra comercial de un poroto resistente a virus, completamente
desarrollado por una institucin pblica (EMBRAPA). El sistema regulatorio argentino
cumple 20 aos de trabajo ininterrumpido.
2012: Un grupo internacional de investigadores descifra el genoma del gorila. Por otro lado,
un consorcio internacional formado por 150 investigadores de 12 pases secuencian los
genomas del cerdo y el jabal. La Administracin de Alimentos y Frmacos de EE.UU.
aprueba el primer medicamento producido por zanahorias genticamente modificadas para
uso en pacientes con enfermedad de Gaucher. De la mano del INTA, la Argentina y otros 12
pases secuencian el genoma del tomate. Adems se secuencia el genoma del meln, de la
cebada, de la pera, de la sanda y de la banana. Unos 17 millones de agricultores siembran
170 millones de hectreas de cultivos GM en 28 pases. Argentina ocupa el tercer lugar, con
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casi 24 millones de hectreas de soja, maz y algodn. Argentina autoriza la siembra
comercial de maces con cuatro y cinco genes acumulados para el control de malezas e
insectos.
2013: Consorcio internacional logra descifrar el genoma del garbanzo. Adems un equipo de
investigadores de diferentes pases secuencia y ensambla el genoma del kiwi. El Ministerio
de Agricultura, Ganadera y Pesca anuncia la renovacin y modernizacin del marco
regulatorio argentino para OGM, que acumula 5 aprobaciones comerciales en soja, 20 en
maz y 3 en algodn, adems de ms de 1.000 autorizaciones para ensayos a campo.
1.6 CUESTIONARIO
Explicar cul es la funcin de las enzimas y dar ejemplos de enzimas que se emplean en
productos biotecnolgicos.
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La clula es la unidad de vida fundamental. Una clula es una entidad aislada de otras clulas por
una membrana celular (y tal vez por una pared celular) que contienen en su interior diversos
compuestos y estructuras subcelulares.
La membrana celular es la barrera que separa el interior de la clula del exterior. Dentro de la
membrana celular se encuentran las diversas estructuras y componentes que hacen posibles que la
clula funcione. Son estructuras clave el Ncleo o Nucleide, donde se guarda informacin
gentica, el acido desoxirribonucleico (DNA) necesario para hacer nuevas clulas, y el citoplasma,
donde se encuentra la maquinaria para el crecimiento y otras funciones celulares.
Todas las clulas estn formadas por 4 tipos de componentes qumicos: protenas, cidos nucleicos,
lpidos y polisacridos. En conjunto, se denominan macromolculas. La naturaleza qumica y la
disposicin de las macromolculas de una clula de un organismo es lo que diferencia una clula de
otro organismo.
Aunque cada tipo de clula tiene una estructura y un tamao definido, una clula es una unidad
dinmica, que realiza constantes cambios reemplazando sus componentes. Incluso cuando no est
creciendo, una clula puede estar tomando materiales del medio para incorporarlos a su propia
estructura. Al mismo tiempo libera productos de desecho en el medio. Por tanto, una clula es un
sistema abierto en constante cambio y, sin embrago, permanece igual.
Las clulas se pueden considerar bajo dos aspectos. Por un lado, las clulas pueden ser consideradas
como maquinas qumicas que llevan a cabo transformaciones qumicas dentro de los lmites de la
estructura celular. Los catalizadores de esta mquina qumica son las enzimas, protenas capaces de
acelerar notablemente la velocidad de reacciones qumicas especficas. Por otro lado, las clulas
tambin pueden ser consideradas como sistemas codificados, anlogos a las computadoras, que
guardan y procesan la informacin gentica (DNA) que pasa finalmente a la descendencia durante la
reproduccin.
En condiciones adecuadas, una clula viable aumenta de tamao y luego se divide para formar dos
clulas. En el proceso ordenado que supone la divisin celular, la cantidad de todos los
constituyentes de la clula se duplica. Cuando una clula se divide cada una de las dos clulas
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resultantes contienen toda la informacin gentica necesaria para la formacin de mas clulas y, por
tanto, durante el crecimiento debe haber tambin una duplicacin del DNA. En consecuencia, tanto
la maquina como el cdigo deben estar funcionalmente coordinados para lograr que una clula se
reproduzca con fidelidad.
Los organismos vivos se pueden dividir en dos reinos: los vegetales y los animales multicelulares, y
los protistas y los virus, segn la siguiente tabla
La estructura celular de ambos reinos ha permitido la divisin de los tipos celulares en dos grupos
(sin incluir los virus). Estos grupos son los eucariotas y los procariotas; la diferencia entre ellos
depende principalmente de si los cromosomas (DNA) estn contenidos en un ncleo bien definido.
En la siguiente tabla se listan las principales diferencias entre los procariotas y los eucariotas en
trminos de su estructura celular y contenido de DNA
Los procariotas contienen un solo cromosoma, en tanto que los eucariotas contienen muchos
cromosomas en una estructura unida a una membrana, el ncleo.
En los eucariotas, el DNA contenido en los cromosomas est unido a histonas, protenas bsicas
ausentes en los procariotas. El DNA del ncleo de los eucariotas no es el nico DNA presente en la
clula, puesto que otras estructuras unidas a membranas, las mitocondrias y los cloroplastos,
tambin contienen DNA. Estas estructuras rodeadas de membrana, conocidas como organelos, no se
encuentran en los procariotas. Los organelos tambin contienen a las estructuras capaces de
sintetizar protenas, las cuales incluyen a los ribosomas. Los ribosomas de los organelos son
similares en tamao a los ribosomas de los procariotas (70S), en tanto que los ribosomas
citoplasmticas miden 80 S (S unidades de Sverberg).
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Los virus se incluyen con frecuencia en el grupo de los protistas. Los virus fueron detectados en
1982 por Iwanowski. Los virus contienen cidos nucledos que codifican toda su informacin
gentica, pero de penden de las clulas husped preexistentes para su reproduccin. Esta
incapacidad para existir sin usar otras clulas ha originado muchos argumentos en cuanto a si los
virus son o no organismos vivos. Los virus afectan a vegetales, animales y bacterias.
2.2.1 PROCARIOTAS
Los procariotas representan las clulas ms pequeas del reino protista, el cual consiste en bacterias
y algas verde-azules. El resto, algas, levaduras, hongos y protozoarios, son eucariotas. La siguiente
tabla muestra la comparacin de los protistas, bacterias, mohos y las levaduras en cuanto a su forma,
tamao y composicin.
Las clulas bacterianas se presentan como bastones, esferas, cadenas y espirales, que en general son
ms pequeas que las levaduras y los mohos
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Los tres grupos contienen organismos que pueden formar esporas cuando las condiciones son
desfavorables. La composicin de las bacterias muestra que contienen ms protenas y menos
lpidos o carbohidratos que las levaduras o los mohos.
Las diferentes formas de las bacterias se usan en las primeras etapas de la identificacin, pero
debido a la falta de otras caractersticas, se usan las nutricionales para una identificacin ms
detallada. Segn su fuente de energa, las bacterias y las algas verde-azules se pueden clasificar en
cuatro categoras:
Organismos fotoauttrofos, los cuales dependen de la luz como fuente de energa y utilizan
dixido de carbn como fuente de carbono. Este grupo incluye las algas verde-azules, pero
tambin ciertas bacterias fotosintticas (bacterias sulfurosas purpuras y verdes), as como
plantas superiores y algas verdes eucarioticas.
Organismos fotohetertrofos, los cuales dependen de la luz como fuente de energa, pero
usan compuestos orgnicos como fuentes de carbono. Estos son las bacterias purpuras no
sulfurosas.
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El citoplasma bacteriano est encerrado por una pared celular rgida altamente estructurada que
determina la forma de la clula. La eliminacin de esta pared provoca que la clula adquiera una
forma esfrica conocida como protoplasto cuando la membrana celular tiene poca resistencia
intrnseca. Si el protoplasto se coloca en un medio hipertnico, una solucin ms diluida que el
citoplasma, se provoca una rpida captacin de agua y, finalmente, la ruptura de la membrana.
En las algas verde-azules, la pared celular se compone bsicamente de celulosa, en tanto que en las
bacterias la pared est formada por un polmero nico de amino-azcar, peptidoglicano o murena.
La composicin qumica y la estructura del peptidoglicano muestran variaciones considerables entre
diferentes organismos, aunque su estructura bsica es la misma. Est formado por cadenas lineales
de polisacridos, hebras de glicano, entrecruzadas por cadenas peptdicas cortas.
Los cordones de glicano estn constituidos por unidades alternadas de N-acetilglucosamina y cido
N-acetilmurmico A cada molcula de N-acetilmurmico est unida una cadena de cuatro
aminocidos, los cuales son responsables del entrecruzamiento, tal como se ilustra en la siguiente
figura.
En algunas bacterias, cerca del 50% de la pared celular est compuesta de peptidoglicano; el resto
son varios polmeros, lo cual depende del organismo. Un grupo de estos son los cidos teicoicos,
polmeros que contienen fosfato.
Otras bacterias tienen pared celular con menor contenido de peptidoglicano pero tienen una
estructura ms compleja que contienen lpidos y protenas. Etas diferencias son responsables de las
observaciones realizadas por Gram en 1884, de que algunas bacterias se tien y otras no.
En la siguiente tabla se muestra el mtodo de tincin que divide a las bacterias gram-positivas y
gram-negativas.
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Las bacterias gram-positivas tienen una estructura bsica de peptidoglicano unida a cido teicoico,
en tanto que las bacterias gram-negativas tienen una membrana fuera de la capa de peptidoglicano
que consiste en una bicapa de fosfolpidos con lipopoliscaridos y protenas.
Las diferencias entre las bacterias gram-positivas y gram-negativas detectadas por la tincin de
Gram, se pueden correlacionar con otras caractersticas como la sensibilidad a la penicilina y a la
digestin con lisozima.
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Las clulas humanas y animales no contienen peptidoglicano por lo que son afectadas. La enzima
lisozima encontrada en clara de huevo, las lagrimas y otras secciones, rompe el enlace entre las
unidades de cido N-acetilmurmico y N-acetilglucosamina.
En la parte exterior de la pared celular de algunas bacterias, se encuentran polisacridos de alto peso
molecular formando un gel hidroflico, conocido como cpsula. El espesor de la cpsula puede
variar enormemente desde 10 nm hasta 1.0 m, y puede variar de acuerdo al estado de la clula. La
cpsula no tiene una funcin bien definida, sin embargo muchos patgenos estn encapsulados y los
componentes de la cpsula pueden ser antignicos.
Debajo de la pared celular bacteriana est la membrana de unos 40-80 A de espesor. La membrana
acta como una barrera semipermeable que controla la captacin y la liberacin de materiales,
ayudando a determinar la composicin del citoplasma.
Alrededor del ao 1900 se descubri el primer indicio de que los lpidos, molculas orgnicas
pequeas insolubles en agua que incluyen a las grasas y los aceites pueden ser un constituyente de
las membranas biolgicas. En la dcada de los aos 50 Robertson propuso que la membrana
consista en una capa externa de polisacridos, una capa interna de protenas y, entre estas, una
bicapa de lpidos conocida como una unidad de membrana. La bicapa lipdica consista en
fosfolipidos, molculas de glicerol con un extremo hidrfilo (el fosfato) y un extremo hidrofbico
(tallo de cido graso), arreglados como una capa doble.
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En las bacterias, la membrana citoplsmica es la nica estructura membranosa real, aunque existe
una membrana similar en los eucariotas alrededor de estructuras como el ncleo, las mitocondrias y
los cloroplastos.
2.2.1.3 Flagelos
Las bacterias pueden moverse en respuesta a varios estmulos o a componentes qumicos al alejarse
de los estmulos o al acercarse a ellos. Se ha demostrado que muchos nutrientes simples, como los
azucares y los aminocidos provocan respuestas en las bacterias. El medio de locomocin principal
de las bacterias es el flagelo. Este consiste en un cuerpo basal embebido en la membrana
citoplsmica, una regin en forma de gancho que conecta la base con un eje largo que es flexible y
delgado.
El flagelo se compone de hebras de una protena llamada flagelina. El ordenamiento de los flagelos
en la bacteria determina su tipo de movimiento y, a menudo se puede usar en su clasificacin.
Cuando son vistos en el microscopio electrnico, pueden observarse otros apndices sobre las
bacterias, que consisten en delgados filamentos conocidos como fimbrias o pilis, los cuales
participan en la transferencia de material gentico.
2.2.1.4 Esporas
El citoplasma de las bacterias contiene muy pocas estructuras separadas de unos o dos agregados de
material nuclear. Sin embargo, se puede hallar una estructura que solo est en las bacterias gram-
positivas, la endospora. Cuando las condiciones son difciles, o bien, en alguna etapa del ciclo de
desarrollo, las bacterias forman una espora refractiva a partir de una invaginacin de la membrana
citoplsmica. La gruesa pared de las esporas les confiere resistencia al calor o a la desecacin.
2.2.2 EUCARIOTAS
La clula eucariota est representada por plantas, animales, levaduras, algas y hongos. A pesar de la
gran diversidad entre estas clulas, hay muchas caractersticas comunes a ellas, lo cual incluye un
alto grado de complejidad interna.
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Clula Clula
animal vegetal
En los hongos, las levaduras y las algas, la clula est encerrada en una pared rgida que consiste
principalmente en polisacridos, los cuales le confieren una forma fija y la protegen del dao
mecnico y osmtico. La pared estabiliza la estructura celular y, en cuanto a las procariotas, puede
usarse como caracterstica taxonmica. Las levaduras pueden tener forma casi esfrica u oblonga y
se dividen por gemacin o fisin, en tanto que el crecimiento micelio se realiza por elongacin, el
cual puede incluir ramificacin.
Las eucariticas estn limitadas por una membrana de estructura similar a la de los procariotas. En
cuanto a los eucariotas vara mucho el tamao de las estructuras que rodean la membrana dentro de
la clula
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2.2.2.3 Ncleo
2.2.2.4 Mitocondrias
Las clulas eucariticas contienen estas estructuras, las cuales, a menudo son grandes, cilndricas,
encerradas por una membrana doble y contienen invaginaciones numerosas conocidas como crestas.
La mitocondria es el sitio principal de generacin de energa y contiene su propio sistema
sintetizador de protenas y su propio DNA. En la siguiente figura se puede observar con ms detalle
2.2.2.5 Cloroplasto
El cloroplasto tambin es una estructura rodeada por una membrana y, al igual que las mitocondrias,
contiene un sistema separado para la sntesis de protenas y su propio DNA. Como su nombre lo
indica, los cloroplastos contienen el pigmento de clorofila y en ellos se lleva a cabo la fotosntesis.
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La mayora de las eucariotas contienen un complejo de membranas denominado aparato o cuerpo de
Golgi, algunas veces nombrado ditiosoma. Al igual que el retculo endoplsmico, el aparato de
Golgi participa en la secrecin de substancias de la clula en particular enzimas.
Las vacuolas se encuentran en muchos tipos de clulas, especialmente en plantas. A menudo se usan
para almacenar enzimas o productos que podran ser disruptivos o txicos para la cella (las vacuolas
pueden llegar a ocupar de 80 a 90% del volumen d celular total).
Muchas de las estructuras citoplasmticas descritas estn en equilibrio dinmico y son sintetizadas y
degradadas segn sea requerido. Las diferentes estructuras parecen derivarse, ya sea directa o
indirectamente, del retculo endoplsmico de acuerdo con el esquema mostrado a continuacin.
La mayora de las levaduras y las algas pueden sintetizar los compuestos orgnicos necesarios para
su crecimiento a partir de la fuente de carbono. Muchas bacterias no pueden hacer esto y necesitan
la presencia de factores de crecimiento especficos en el medio, adems de una fuente de carbono y
energa.
Ciertas bacterias lcticas tienen necesidades muy estrictas de prcticamente todos sus aminocidos,
purinas, pirimidinas y vitaminas. En consecuencia estos organismos realmente pueden crecer en un
medio en el que no se conoce la concentracin de uno de estos nutrientes necesarios para el
crecimiento.
El grado de crecimiento estar relacionado directamente con la concentracin del nutriente esencial.
Esto constituye la base del ensayo microbiolgico.
En la siguiente tabla se listan algunas de las vitaminas y compuestos relacionados que a menudo se
necesitan para el crecimiento
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Las clulas microbianas, como todos los sistemas vivos con excepcin de los virus, se componen de
carbohidratos, grasas, lpidos y cidos nucleicos. Estos materiales se forman a partir de las unidades
bsicas de construccin o productos metablicos primarios, a saber, monohidratos, cidos grasos,
aminocidos y nucletidos (o nucleosidos) y, por otras reacciones metabolicas, se convierten en los
componentes estructurales principales de las clulas, como paredes celulares, membranas, enzimas,
protenas estructurales y DNA o RNA.
2.4.1 Carbohidratos
Son compuestos orgnicos con la formula general (CH2O)n, donde n>3. Existen dos formas
principales de carbohidratos; los monosacridos y los polisacridos.
Los monosacridos o azucares simples, son los carbohidratos ms pequeos que contienen entre 3 y
9 tomos de carbono y son las unidades de construccin de los polisacridos.
Para muchos microorganismos la D-glucosa es el compuesto base que se metaboliza para formar los
dems compuestos celulares. La mayora de los microorganismos (particularmente las levaduras),
pueden crecer en glucosa, la cual se transporta a travs de la membrana hacia la clula de difusin
pasiva, transporte activo o trasnlocacin de grupo.
Cuando hay polisacridos en el medio, es comn que sean hidrolizados a unidades de glucosa por
enzimas extracelulares (invertasas, celulasas, amilasas, amoniglucosidasas) antes de ser
transportados hacia la clula.
Los monosacridos se clasifican como aldosas o cetosas (ver figura). As, la glucosa es una
aldohexosa (aldo=azcar; hexosa= 6 tomos de carbono).
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Hay dos formas de glucosa (y otros azcares) llamadas formas D y L, que son imgenes especulares
entre s.
Los azucares de origen natural por lo general son de la forma D-. La glucosa se presenta
principalmente como una estructura de anillo, denominada la forma piranosa, en la que en enlace -
y - representan la posicin del grupo OH del tomo del carbono I
La unin de otros grupos qumicos a la estructura bsica, da lugar a una variedad de derivados de
azcar que incluyen alcoholes (glicerol, sorbitol, etc.), cidos (acido gluconico, acido glucornico),
fosfatos (glucosa-1-fosfato, glucosa-6-fosfato), desoxi-azcares (desoxirrobosa, ver figura) y
aminoazcares (glucosamina, galactosamina, acido N-acetilmurmico). Estos son componentes
comunes de la estructura de la clula microbiana.
Bajo la influencia de enzimas, los monosacridos se pueden condensar entre s para formar
polisacridos. El grupo OH sujeto al tomo de carbono en la posicin 1 de la molcula de glucosa,
es relativamente reactivo y se puede condensar con el grupo OH en la posicin 4 o 6 de otro azcar
para producir un disacrido con un enlace - (o -) 1,4 glucosdico (ver figura)
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Un polisacrido estructural importante es la celulosa, la cual contiene ms del 50% del carbono
orgnico total de la biosfera. La madera contiene aproximadamente 50% de celulosa, en tanto que el
algodn es casi celulosa pura. Se compone de unidades de D-glucosa unidas por enlace -1,4 (ver
figura) y es el componente principal de las clulas vegetales y algas.
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Las paredes celulares estn formadas por un peptidopolisacarido complejo llamado Peptidoglicano
o murena. Este consiste en cadenas paralelas de polisacrido compuestas de un disacrido de N-
acetil-D-glucosamina y cido N-acetilmurmico unido por enlaces -1,4 glucosdicos. En el grupo
hidroxilo del cido lctico unido al cido murmico, se encuentra una cadena lateral del tetrapptido
compuesta de L-alanina, D-alanina, cido D-glutmico y cido diaminopimlico o L-lisina (ver
figura). La D-alanina terminal de la cadena peptdica lateral de un polisacrido puede unirse con la
cadena peptdica de otra cadena de polisacrido, ya sea directamente o a travs de otra cadena
polipeptdica corta (Staphylococcus aureus, esta cadena de polipptido se compone de 5 unidades de
glicina).
Por lo tanto, el Peptidoglicano consiste en cadenas de polisacridos paralelas con muchas uniones
entre las cadenas que le confieren fuerza y rigidez a la pared celular.
La enzima lisozima hidroliza los enlaces -1,4 del Peptidoglicano para producir disacridos de N-
acetil-D-glucosamina y cido N-acetilmuramico, a los cuales estn unidos los pptidos. Este es uno
de los mtodos usados para obtener protoplastos de bacterias gram+
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La penicilina, un antibitico importante, inhibe la formacin de los entrecruzamientos peptdicos
entre las cadenas de polisacrido, formando as paredes celulares dbiles.
Los lpidos son compuestos orgnicos insolubles en agua localizados en todas las clulas vivientes,
pero son solubles en solventes no polares como el benceno y el ter.
Las grasas y lpidos se componen de cidos grasos, de los cuales se han aislado ms de 70 tipos
diferentes. Los cidos grasos se componen de una cadena larga de hidrocarburos con un grupo
carboxilo terminal, como se muestra en la figura.
Donde n est por lo general, entre 12 y 20. La cadena de hidrocarburo puede ser saturada (sin
enlaces dobles) o insaturada (uno o ms enlaces dobles). Los cidos grasos difieren principalmente
en la longitud de la cadena y en el nmero y la posicin de los dobles enlaces. Algunos de los cidos
grasos ms importantes y comunes se muestran en la siguiente tabla.
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Casi todos los cidos grasos naturales tienen nmero par de tomos de carbono y se llaman
saturados si no tienen dobles enlaces.
Los cidos grasos insaturados presentan uno o ms dobles enlaces (ver tabla). Si bien las plantas y
animales superiores tienen predominantemente cidos grasos insaturados de 14 a 22 tomos de
carbono; los microorganismos, y en particular las bacterias, tienen tipos ms simples de 12 a 18
tomos de carbono y cidos grasos insaturados C16 o C18: en las bacterias no se han encontrado
cidos grasos con ms de un enlace doble.
Los cidos grasos slo se encuentran en pequeas cantidades en forma libre. Se localizan en
materiales estructurales y de almacenamiento como esteres de glicerol (glicridos o acilgliceroles) o
como fosfosteres de glicerol (fosfoglicridos o fosfolpidos).
Los glicridos son la forma de almacenaje principal de grasas en los microorganismos, plantas y
animales.
Hay tres clases de glicridos, dependiendo del nmero de cidos grasos esterificados en la molcula
de glicerol.
1-monoacilglicerol (monoglicerido)
1.2-diacilglicerol (diglicrido)
1.2.3-triacilglicerol (triglicrido)
Los ms comunes en la naturaleza son los triacilgliceroles. La clase de triacilglicerol depende del
tipo y posicin de los cidos grasos esterificados en relacin con el glicerol, por ejemplo,
triesteroilglicerol.
Los fosfoglicridos se encuentran casi exclusivamente en las membranas celulares, siendo escaso en
grasas de almacenamiento. Son similares en estructura a los glicridos excepto que uno de los
grupos alcoholes primarios del glicerol est fosforilado ms que esterificado con un cido graso.
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As, el componente bsico de los fosfolpidos es el glicerol-1-fosfato o el glicerol-3 fosfato, al cual
estn unidos dos cidos grasos.
Los fosfoglicridos (ver figura) poseen una cabeza polar (hidroflica) y dos cadenas hidrocarbonadas
no polares (hidrofbicas) y, por tanto, se denominan lpidos anfipticos.
As en solucin acuosa, es fcil que formen micelas con las regiones polares de un grupo de
fosfoglicridos en contacto con el agua, en tanto que las cadenas laterales no polares se agrupan
entre s (ver figura).
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2.4.3 Esteroides
Los lpidos complejos, los cuales no son saponificables, incluyen a la clase bioqumicamente
importante de los esteroides. Los esteroides se obtienen de una estructura bsica, tal como se ilustra
en la figura.
Los animales sintetizan un gran nmero de esteroides, los cuales tienen diversos papeles fisiolgicos
y bioqumicos, incluyendo su funcin como hormonas. Algunos ejemplos son: colesterol, cortisona
y testosterona.
2.4.4 Protenas
Las protenas son las molculas orgnicas ms abundantes de las clulas vivas, comprendiendo entre
el 30% y el 70% del peso seco total de las clulas. Son componentes celulares muy importantes
puesto que son copiados de la informacin gentica de la clula y, posteriormente, dirigen la
maquinaria metablica de ella.
Las protenas se componen invariablemente de carbono, oxgeno y nitrgeno; casi todas contienen
azufre. Adems, algunas protenas contienen otros elementos como fierro, fsforo, zinc y cobre
El peso molecular de las protenas varia desde 5000 hasta ms de 40 millones. Sin embargo, ciertas
cadenas peptdicas, como las que se asocian con el peptidoglicano, constan de pocos aminocidos
con pesos moleculares tan bajos como 240. Las protenas y pptidos se componen de .-
aminocidos, los cuales representan las unidades de construccin de las protenas. Existen 20 -
aminocidos comunes unidos entre s mediante enlaces peptdicos para formar polmeros grandes,
no ramificados o cadenas polipeptdicas, ellos son; Glicina, Alanina, Serina, Cistena, Treonina,
Valina, Leucina, Isoleucina, Metionina, Fenilalanina, Tirosina, Triptfano, cido asprtico,
Aspargina, cido glutmico, Glutamina, Lisina, Arginina, Histidina y Prolina.
Los enlaces peptdicos se forman por una reaccin de condensacin entre el grupo carboxilo de un
aminocido y el grupo amino de un segundo aminocido.
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El nmero y secuencia de los residuos aminocidos en una cadena polipeptdica (protena)
determina la funcin y la actividad cataltica (si existe). El peso molecular promedio de un
aminocido es 138. Sin embargo, puesto que se pierde una molcula de agua en la formacin de un
enlace peptdico, el peso molecular promedio de un residuo de aminocido en una protena es de
120.
La estructura, y en consecuencia, la funcin de una molcula de protena, est gobernada no slo por
su composicin de aminocidos, sino tambin por su forma tridimensional caracterstica o
conformacin. Muchos de los aminocidos tienen cadenas laterales ya sea hidrofbicas (no polares)
o hidroflica (polares), que determinan la manera en la cual se dobla una molcula de protena.
Adems, el aminocido cistena contiene un grupo sulfhidrilo (-SH) que puede reaccionar con otra
cistena para formar enlace sulfhidril covalente (enlace disulfuro).
Estos enlaces, junto con fuerzas de Van der Waals, puentes de hidrogeno e interacciones polares,
son los causantes de la conformacin tridimensional de una protena. Existen dos conformaciones
principales de protenas; fibrosas y globulares
Las protenas fibrosas son ms fuertes fsicamente y son insolubles en agua o soluciones acuosas
diluidas. Se componen de cadenas polipeptdicas arregladas en paralelo a lo largo de un solo eje para
formar fibras grandes o lminas. Representan los componentes estructurales bsicos del pelo
(queratina), cuero, uas, colgeno y tendones de los animales superiores, as como de los flagelos,
cilios y pilis de los microorganismos.
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Se observa que hay cuatro niveles diferentes de estructura protenica, las cuales se pueden resumir
como sigue:
Las protenas que tienen ms de una cadena polipeptdica se denominan protenas multimricas u
oligomricas, y cada polipptido se conoce como subunidad o protmero.
En general, la mayora de las protenas grandes tienen dos o ms subunidades que pueden no poseer
ningn enlace covalente entre ellas. Ejemplos de protenas ologomricas son las enzimas,
hexocinasa de las levaduras (4 subunidades), triptfano sintetasa (4 subunidades), lactato
deshidrogenasa (4 subunidades) y la sintetasa de cidos grasos (21 subunidades), aunque la
ribonucleasa y la lisozima poseen una sola subunidad.
De ordinario, las subunidades estn asociadas estrechamente, aunque puede no haber enlaces
covalentes. En consecuencia, la protena acta como una sola molcula y, de hecho, casi siempre se
requieren todas las subunidades para el funcionamiento ptimo de la protena.
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En la siguiente tabla encontramos algunas protenas que se encuentran ms comnmente en la
naturaleza y su funcin.
Una de las clases principales de protenas son las enzimas, las cuales funcionan como catalizadores
biolgicos.
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Los cidos nucleicos se componen de nucletidos y participan en el almacenamiento, replicacin,
transcripcin y transferencia de la informacin gentica. Los nucletidos tambin tienen funciones
importantes en el metabolismo, particularmente en reacciones de transformacin de energa. Los
nucletidos sirven como coenzimas portadoras de energa, como coenzimas en la transferencia
del acido actico, azucares, aminas y otras molculas y como coenzimas en reacciones de oxido
reduccin.
En los nucletidos se encuentran comnmente tres bases pirimdicas: uracilo, timina y citocina y, en
una cantidad menor 5-metilcitocina y 5 hidroximetilcitocina (ver figura).
Hay dos bases puricas principales, a saber: adenina y guanina y formas menores como 2-
metiladenina y 1-metilguanina (ver figura).
Los nucleosidos son similares a los nucletidos excepto que carecen del grupo fosfato unido en la
posicin 5 del anillo de la ribosa (azcar de 5 carbonos). Hay dos tipos de nuclesidos: los
ribonuclesidos que contienen D-ribosa como componente de azcar y los 2-
desoxirribonuclesidos, que contienen 2-desoxiribosa-D-ribosa (ver figura)
Los nucletido son steres de nuclesido con cido fosfrico y, otra vez, son de dos tipos, a saber:
los ribonucletidos, que contienen D-ribosa y los desoxirribonucletidos, los cuales contienen 2-
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desoxi-D-ribosa. Es comn encontrar a los nucletidos en forma libre en el interior de las clulas.
Los ribonucletidos son los constituyentes principales (bloques de construccin) de los cidos
ribonucleicos (RNA), y los desoxirribonucletidos de los cidos desoxirribonucleicos (DNA). El
grupo de cido fosfrico, en general, se encuentra unido en posicin 5 de la D-ribosa o de la 2-
desoxi-D-ribosa, pero puede asociarse con las posiciones 2o 3en incluso formar grupos de cido
fosfrico cclicos, en forma notable, la adenosina-3, 5-monofosfato (AMP cclico), la cual es un
compuesto importante en la regulacin del metabolismo (ver figura).
Estos grupos fosfatos forman complejos con Mg2+ y Ca2++ dentro de la clula y tienen funciones muy
importantes. La ATP (adenosina-5-trifosfato) es el portador primario de energa en la clula, que
transfiere energa desde reacciones catablicas (oxidativas) a reacciones anablicas (biosintticas).
Los nuclesidos di- y tri- fosfatos sirven tambin como portadores de molculas especficas. As, la
UDP (uridina difosfato) es un portador especfico de residuos de azcar en la sntesis de
polisacridos, esto es, como UDP-glucosa para la biosntesis de glucgeno.
Los nuclesidos trifosfato funcionan tambin como precursores de unidades de mononucletido para
la sntesis de DNA y RNA.
Existe gran cantidad de otros mononucletidos importantes que contienen bases que no se
encuentran en los cidos nucleicos. La nicotinamida adenina dinucletido (NAD) y su forma
fosforilada (NADP), as como la flavina mononucletido (FMN) y la flavina adenina dinucletido
(FAD) (ver figuras), son compuestos cuya funcin principal es actuar como cofactores o coenzimas
en reacciones de xido reduccin en el interior de la clula.
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El DNA (cido desoxirribonucleico) es un biopolmero no repetitivo que contiene toda la
informacin gentica celular (en ciertos virus esta funcin la tiene el RNA).
Durante la divisin celular, cada clula hija recibe una copia exacta y completa del DNA parental.
En los procariotas (bacterias, algas verde azules) hay una molcula de DNA nica que forma un solo
cromosoma, el cual tiene un peso molecular superior a 2*10 9 y constituye aproximadamente el 1%
del peso seco de la clula. En los eucariotas (levaduras, hongos, animales y plantas superiores)
generalmente existen algunos cromosomas (molculas de DNA9 los cuales, en clulas diploides, se
presentan en el ncleo en forma combinada con protenas llamadas histonas. Adems del DNA
nuclear, las clulas eucariticas contienen DNA satlite, especialmente en las mitocondrias y en los
cloroplastos, el cual es diferente del DNA nuclear. El DNA procaritico de ordinario est unido a un
pliegue o invaginacin de la membrana celular llamado mesosoma en la regin nuclear (los
procariotas no poseen un ncleo verdadero).No hay protenas asociadas con el DNA. Los
procariotas tambin pueden tener un material extracrosomal denominado plsmidos o episomas.
Todas las molculas de DNA estn formada de cuatro unidades de mononucletidos principales
unidas entre s por enlaces 3,5fosfodister para formar una cadena de polinucletido larga y sin
ramificaciones (ver figura).
Dos de tales cadenas, las cuales son complementarias una de la otra, se combinan para formar una
estructura de doble hlice en la que las dos cadenas permanecen juntas por la formacin de puentes
de hidrogeno entre pares de bases complementarias. As, la adenina de una cadena siempre est
unida por puentes de hidrgeno con la timidina de la segunda cadena, y la citocina se une por
puentes de hidrogeno a la guanina.
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Los enlaces de hidrogeno estabilizan la molcula de doble enlace del DNA y, puesto que las bases
G-C se unen por tres de tales enlaces en comparacin con dos entre las bases A-T, mientras mayor es
la cantidad de pares de bases guanosina-citosina (G-C), la molcula de DNA es ms estable (ver
figura).
Dentro de la clula el RNA (cido ribonucleico) existe en tres formas, a saber: RNA mensajero
(mRNA), RNA de transferencia (tRNA) y RNA ribosomal (rRNA). Todas consisten en una cadena
de polirribonucletido compuesta de los cuatro ribonucletidos principales (aunque el tRNA
contiene adems algunos ribonucletidos inusuales que incluyen a los cidos pseudourudlico y
ribotimidlico). En los procariotas todos los RNAs se encuentran en el citoplasma, en tanto que en
los eucariotas el rRNA se localiza en el citoplasma (en los ribosomas) y el mRNA y tRNA se
encuentran en el ncleo, mitocondrias, cloroplastos y citoplasma.
El mRNA se sintetiza por la transcripcin enzimtica de una hebra de la molcula de DNA. Las
bases que constituyen la hebra individual de mRNA son complementarias a dicha hebra (excepto
que el uracilo reemplaza a la timina). Despus de la transcripcin, el MRNA pasa a los ribosomas
donde sirve como molde para el ordenamiento secuencial de los aminocidos durante las sntesis de
protenas. Los tripletes de nucletidos (codones9 a lo largo de la hebra de mRNA determinan un
aminocido especifico.
Los tRNAs son molculas pequeas (23000-30000 de peso molecular) que actan como portadores
de aminocidos especficos. Durante la sntesis de protenas, cada uno de los 20 aminocidos mas
comunes tiene al menos un tRNA especifico que lo conduce hasta el mRNA que se encuentra unido
al ribosoma. Una vez all, el tRNA transfiere el aminocido correspondiente a la cadena
polipeptdica en crecimiento.
El rRNA constituye hasta el 65% del peso de los ribosomas y se divide en tres tipos; 23 S, 16 S y 5
S, dependiendo de su capacidad para sedimentar en la centrifugacin. Durante la sntesis de
protenas, el mRNA se une al ribosoma, y un tRNA se adhiere al mRNA y transfiere su aminocido
a la cadena polipeptdica en crecimiento; el ribosoma se mueve entonces a lo largo del mRNA hasta
el codn prximo que da la informacin para el aminocido siguiente. Sin embargo, la verdadera
funcin de los diferentes tipos de rRNA se desconoce an.
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2.5 Cuestionario
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Tema 3 BIOLOGIA MOLECULAR
3.1 GENERALIDADES
La gentica es la disciplina que trata de los mecanismos por los cuales los caracteres se transmiten
de un organismo a otro y como se expresan. Puesto que la transmisin de la informacin biolgica
es la base de la funcin celular, la gentica es una herramienta de primera magnitud. Acoplada con la
biologa molecular permite entender los mecanismos moleculares que permiten que la clula
funcione. El estudio de la gentica desde la perspectiva molecular tambin es fundamental para
entender la variabilidad de los organismos y la evolucin de las especies.
Muchas de las molculas implicadas en la transmisin gentica son macromolculas. Antes de que
conociramos su naturaleza, o incluso las etapas de dicha transmisin, estaba claro que exista una
unidad de informacin gentica denominada gen.
La mayora de los genes son entidades que codifican la estructura de un nico polipptido o
protena. Un polipeptido se compone de una serie de aminocidos unidos por un enlace peptidico.
Existen unos 20 AA diferentes presentes en las protenas, y una nica molcula de protena
normalmente tiene varios cientos de AA. El gen es el elemento de informacin que codifica la
secuencia de AA de la protena: Los genes son los almacenes de la informacin, mientras que las
protenas son las entidades funcionales.
En todas las clulas los genes estn compuestos de cido desoxirribonucleico (DNA). La
informacin del gen est contenida en la secuencia de bases del DNA. La informacin guardada en
el DNA codifica la secuencia de una protena, y lo hace exclusivamente a travs de una molcula
intermediaria, el cido ribonucleico (RNA). Dado que las tres clases de macromolculas, DNA,
RNA y protena, contienen la informacin biolgica en sus secuencias, frecuentemente se
denominan macromolculas que llevan informacin.
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3.3 ETAPAS DE LA TRANSMISIN DE LA INFORMACIN
Replicacin: La molcula de DNA que acta como el material gentico de la clula, es una
doble hlice de dos largas cadenas. Durante la replicacin el DNA se duplica produciendo
dos hlices dobles
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3.4 ESTRUCTURA DEL DNA
La informacin gentica para todos los procesos celulares se guarda en el DNA en forma de
secuencia de bases de la cadena polinucleotdica. En el DNA slo hay 4 bases diferentes. Adenina
(A), guanina (G), citosina (C) y timina (T).
El esqueleto de la cadena de DNA est formado por unidades de fosfato y del azcar desoxirribosa
alternando entre s. Unida a cada azcar existe una de las bases mencionadas. Debe recordarse el
sistema de numeracin para las posiciones del azcar y de la base; el fosfato que conecta dos
azucares va desde el carbono 3de un azcar al carbono 5del azcar adyacente. En un extremo de la
molcula del DNA, el azcar tiene un fosfato en el hidroxilo 5, mientras que en el otro el azcar
tiene un hidroxilo libre en la posicin 3.
En los cromosomas de todos los organismos celulares, el DNA existe en forma de dos cadenas
polinucleotdicas cuya secuencia de bases es complementaria. La complementariedad de las bases
surge de la especificidad del apareamiento de las bases pricas y pirimdicas: la adenina se aparea
siempre con la timina, y la guanina con la citosina.
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Las dos cadenas de la doble hlice resultante estn ordenadas de manera antiparalela. Esto significa
que las dos cadenas estn orientadas cabeza-pie. En la figura de abajo, la cadena de la izquierda
est ordenada en la direccin 5a 3de arriba abajo, mientras que la otra se ordena en la direccin 5a
3de abajo arriba. Las dos cadenas estn enrolladas entre s formando una doble hlice. En esta
hlice, el DNA forma dos surcos distintos, el mayor y el menor.
De las mltiples protenas que interaccionan especficamente con el DNA, la mayora interaccionan
principalmente con el surco mayor, donde existe una cantidad de espacio considerable. Dada la
regularidad de la doble hlice, algunos de los tomos de las bases estn siempre expuestos en el
surco mayor.
El tamao de la molcula de DNA puede expresarse en trminos de su peso molecular, pero dado
que cada nucletido tiene peso molecular de 330 y que, por otra parte, las molculas de DNA tienen
muchos nucletidos, el peso molecular aumenta rpidamente. (El cido nucleico, incluso el de los
virus pequeos, puede tener un peso molecular del orden de millones y el DNA de las clulas de
miles de millones). Una manera ms conveniente de expresar los tamaos de las molculas de DNA
es en trminos del nmero de miles de bases, o de pares de bases, por molcula. As, una molcula
de DNA con 1000 bases contiene una kilobase de DNA. Si la molcula de DNA es una doble hlice,
entonces se habla de kilopares de bases. As, una doble hlice de 5000 pares de base tendra el
tamao de 5 kilopares de bases.
La bacteria Escherichia coli tiene 4600 kilopares de bases de DNA en su cromosoma. Dada la
inmensa cantidad de informacin se secuencias genmicas que se est acumulando, es
frecuentemente til hablar de millones de paras de bases o megapares de bases. El genoma de E. coli
tiene 4.6 megapares de bases.
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3.5 LA REPLICACIN DEL DNA ES SEMICONSERVATIVA
Cuando una clula se divide en dos, cada una de las clulas hijas contiene el complemento total de
informacin gentica (excepto en las divisiones que originan vulos y espermatozoides). El DNA
debe replicarse en forma precisa; lo cual se logra mediante la separacin de las dos cadenas, seguida
por la asociacin de los nucletidos de las hebras sencillas con las bases complementarias mediante
puentes de hidrogeno (ver figura).
Mediante la replicacin semiconservativa del DNA se generan hlices hijas idnticas doble. Esto
significa la asociacin de la guanina con la citosina y la de la adenina con la timina. A continuacin
los nucletidos que se han asociado con los de la cadena sencilla, los primeros se unen entre s. La
sntesis del DNA nuevo la realizan las enzimas conocidas como DNA polimerasas. El DNA se
sintetiza en forma continua sobre una cadena de DNA (cadena 3-5) conocida como cadena
principal, empero, la cadena 3-5est mal orientada para la sntesis continua mediante la enzima
DNA polimerasa. En esta cadena el DNA, la sntesis ocurre en fragmentos de aproximadamente 100
nucletidos, llamados fragmentos de Okasaki. (Ver figura).
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La replicacin del DNA significa, por tanto, la asociacin de una cadena original con una nueva y se
dice es semiconservativa. Hay otras enzimas que participan en la sntesis del DNA. Entre estas estn
el cido ribonucleico (RNA), polimerasas y nucleasas, ya que las molculas de cido ribonucleico
actan como iniciadoras de la replicacin del DNA, y la DNA ligasa que sirve para unir entre s
fragmentos de Okasaki adyacentes. Hay otras enzimas encargadas de relajar el enrollamiento del
DNA para permitir la replicacin en las horquillas de replicacin. El proceso de tal actividad es ms
complicado para los eucariotas debido a la estructura cromosmica ms compleja.
En E. coli, la replicacin del DNA comienza en un sitio especifico del cromosoma llamado Ori C.,
este es un tramo de 440 pares de bases (pb) cuya funcin normal da por resultado la replicacin del
DNA lejos de este origen en ambas direcciones. El anlisis de otros sitios de iniciacin de
replicacin de DNA procaritico han revelado regiones conservadas repetidas de 12 pb con zonas
espaciadoras de 16 pb. Probablemente estas permiten la unin de protenas al DNA en las secuencias
conservadas y la iniciacin de la replicacin del DNA.
Aunque la replicacin del DNA en los eucariotas se comprende menos, se han hecho algunos
adelantos mediante el uso de la levadura Saccharomyces cerevisiae como sistema modelo. A partir
de este organismos se han aislado secuencias que permiten replicar pequeas molculas circulares
de DNA llamadas plsmidos. Las secuencias se denominan Autonomously Replicating Sequences,
ARS (secuencias de replicacin autnoma) y es posible que funcionen de forma c=similar a Ori C.
El RNA mensajero que transfiere la informacin gentica es transcrito del DNA mediante una
enzima RNA polimerasa dependiente del DNA. Para que esto ocurra las cadenas de DNA deben
separarse, slo una cadena se usa como molde con las bases de RNA unidas por puentes de
hidrogeno con el DNA. La RNA polimerasa dependiente del DNA, cataliza la formacin de
fosfodiester entre las unidades nucleotdicas que parten del extremo 5del DNA (ver figura). E. coli
posee slo una de estas polimerasas, pero los eucariotas tienen por lo menos cuatro clases, que
posiblemente reconocen secuencias distintas de unin o iniciacin.
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La RNA polimerasa de E. coli, que ha sido objeto de estudios detallados, es un tetrmero (cuatro
subunidades). Se necesita un polipptido adicional denominado sigma para la iniciacin exacta;
algunas veces, se requiere de un factor, rho, para determinar la transcripcin.
El RNA mensajero (mRNA) es slo uno de varios tipos de molculas de RNA que se encuentran en
la clula. EL tamao del RNA vara entre procariotas y eucariotas. En los primeros, a menudo se
codifican varios mensajes en una sola molcula de mRNA, pero en los eucariotas los transcritos
primarios, los m RNA, a menudo son mucho ms grandes que en mRNA maduro final, el cual es el
resultado del proceso del mRNA. Una caracterstica importante del mRNA es que solo contiene la
informacin para protenas especficas, sino tambin otras secuencias laterales que intervienen en el
mecanismo de la sntesis de protenas.
El RNA ribosomal (rRNA) es el componente estructural principal de los ribosomas, que son el sitio
de la sntesis de protenas. En los procariotas hay tres molculas distintas de rRNA, en tanto que en
los eucariotas hay cuatros. Hay mltiples copias de las especies de rRNA en el DNA, que junto con
las protenas conforman las subunidades grandes y pequeas de los ribosomas.
El cdigo en s, se determina por una secuencia de tres nucletidos (un triplete) para cada
aminocido. Como esto produce 64 combinaciones posibles y hay 20 aminocidos, entonces algunos
aminocidos son codificados por ms de un triplete.
El triplete que da la clave a un aminocido, como en el mRNA, se conoce como codn. Las posibles
combinaciones del cdigo gentico se muestran en la siguiente tabla para los codones de los 20
aminocidos presentes en las protenas. Adems se usan tres codones como seales de detencin
durante la traduccin, los cuales se denominan codones sin sentido.
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Los codones son llevados por el mRNA y la informacin complementaria, o anticodn, se encuentra
en la hebra transcrita del DNA y tambin en el tRNA.
Los codones indicados en la tabla muestran que las dos primeras bases tienen el efecto mayor al
especificar un aminocido en particular, pero que la tercera base puede variar a menudo sin afectar
el sentido del codn. Por ejemplo, tanto el codn UUU como el UUC, conducen a la incorporacin
del aminocido fenilamina.
El codn AUG para la metionina casi siempre se usa como codn de iniciacin para que el primer
aminocido sea incorporado en un polipptido con una sucesin de tripletes que especifica a los
aminocidos hasta que se llegue a un codn sin sentido y se termina la traduccin.
El codn de iniciacin de la traduccin es AUG, el cual es el nico codn para la metionina, pero
hay dos molculas de tRNA que contienen el anticodn para AUB (es decir, CAU) Uno de estos se
usa siempre para la iniciacin en los procariotas (tRNAmmet), el cual lleva una N-formilmetionina:
para insertar la metionina en posiciones internas en los polipptido se usa un tRNA diferente
(tRNAmmet).
En los eucariotas tambin existen dos molculas de tRNA para la metionina, pero la forma de
iniciacin no est formulada. En general, el aminocido N-terminal de las protenas maduras no es
metionina, lo cual indica que este residuo es separado de la protena despus de la traduccin.
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3.8 MUTACION
Una vez que se ha descrito el material hereditario, su cdigo y su traduccin, es ms fcil entender
la naturaleza de las mutaciones. Estas se originan debido a las perturbaciones en el cdigo gentico
y ocasionan cambios en la regulacin o funcionamiento de las protenas. Por ejemplo, un tipo de
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mutacin simple se origina cuando se altera la secuencia de nucletidos, ocasionando un cambio en
el sentido de un codn. Hay muchas formas de clasificar la mutacin, y estas ilustran los
mecanismos y efectos de las mutaciones. El estudio de la mutacin y el marco conceptual para
comprender el proceso de la mutagnesis se basan principalmente en el estudio de los procariotas y
sus virus. Los eucariotas inferiores, en particular Saccharomyces cerevisiae, tambin ha aportado
evidencias moleculares comparativas que muestran algunas diferencias entre eucariotas y
procariotas. Por ejemplo, diferentes sistemas celulares inician mecanismos de reparacin del DNA
que mantienen al DNA, si este se daa. Son tiles dos conceptos acerca del origen de las
mutaciones, que son: que las mutaciones pueden surgir por mala replicacin del DNA, es decir, por
errores en la replicacin del DNA, o bien, por una mala reparacin, es decir, por errores durante la
reparacin del DNA daado.
Parece ser que la replicacin del DNA es ms discriminatoria en los eucariotas, como tambin la
reparacin del dao del DNA inducido por agentes mutagnicos. Por lo tanto, existe una tendencia
de fagos a procariotas y a eucariotas inferiores hacia la presencia de reparacin errnea como fuente
de mutacin.
Las mutaciones se pueden clasificar como mutaciones puntuales o mutaciones cromosmicas. Las
mutaciones cromosmicas son cambios bruscos ya sean en el numero o estructura de los
cromosomas, en tanto que las mutaciones puntuales son cambios pequeos a nivel de los
nucletidos. El dao al DNA causado por agentes mutagnicos puede ocasionar errores en la
transmisin hereditaria de cromosomas completos y, por lo tanto, puede causar la prdida o ganancia
de estos. Tambin puede suceder que los cromosomas se rompan, y estos tengan afinidad por otros
cromosomas rotos dando lugar a aberraciones cromosmicas. Estas pueden ocasionar la
transferencia de un cromosoma a otro (translocacin); la perdida de material gentico (delecin); o
bien, la inversin de una porcin del cromosoma si ocurren dos rupturas en el mismo cromosoma.
Los cambios en la secuencia de nucletidos pueden alterar el sentido del cdigo gentico dando
como resultado un aminocido diferente en un polipptido o un polipptido truncado si el cambio es
de un codn con sentido a uno sin sentido. Los efectos de tal mutacin, es decir, el fenotipo,
dependen del lugar de la mutacin. Es evidente que una mutacin sin sentido que produce una
protena truncada, causara la ausencia de la actividad protenica particular, a menos que la mutacin
tenga lugar cerca del extremo normal del polipptido. Las mutaciones sin sentido que producen un
cambio en un aminocido de un polipptido tendrn un efecto que depende de la posicin del
aminocido en la protena. Es claro que los cambios en el lugar activo o en una posicin que afecta
la estructura de la protena tendrn mayor efecto. Algunos cambios causaran una disminucin en la
actividad de la protena dando como resultado una mutacin rezumante. Sin embargo, algunas
mutaciones por substitucin de bases no producen un cambio en el sentido debido a los codones
mltiples de algunos aminocidos. Es obvio que estas no tienen efecto sobre el producto protenico.
Estas mutaciones son el resultado de inserciones o deleciones de bases. Estas alteran el marco de
lectura del DNA y alteran la secuencia de codones posterior. El efecto de la mutacin por cambio en
el marco de lectura es dar una protena no funcional, por ejemplo (ver figura)
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Estas mutaciones pueden ocurrir, por supuesto, con mltiplos de una base. Los mltiplos de tres
bases deben ser aadidos o eliminados, as el marco de lectura no se altera, pero los aminocidos se
aaden o eliminan en el polipptido final.
Los daos al DNA pueden ser de dos tipos generales. Los cambios sutiles en el DNA, como la
alquilacin de una base de DNA, pueden ocasionar la asociacin equivocada de la base en la
replicacin del DNA. En este caso la posicin de la alquilacin es importante y la posicin o6 de la
guanina es la lesin ms importante que da como resultado mutaciones GC a AT. Esto demuestra la
especificidad de las alteraciones mutacionales inducidas por algunos mutgenos. Otros, como la
acridina, inducen mutaciones de corrimiento de marco de lectura por lo menos en sistemas
procariticos.
Algunos daos al DNA producen formas de lesiones del DNA que son no codificantes y, por tanto,
interrumpen la sntesis de DNA. Este dao es inducido por la luz ultravioleta que forma enlaces
cruzados entre timidinas adyacentes. Estas lesiones voluminosas interrumpen la sntesis del DNA y
ocasionan espacios en el DNA. Para ambos tipos de dao existen mecanismos de reparacin que
pueden llevar al DNA a su forma original, pero la reparacin del DNA tambin puede provocar
mutaciones si se cometen errores.
RESUMEN
El DNA es el material hereditario y est constituido por una hlice de hebra doble.
Las protenas estn asociadas al DNA el cual se enrolla sobre s mismo.
El cdigo gentico se determina a partir de secuencias de tres nucletidos, con una seal de
iniciacin y tres seales de terminacin de la trascripcin.
El cdigo gentico se transfiere mediante el mRNA y se traduce en los ribosomas en una
protena. Los tripletes de nucletidos que codifican para los aminocidos en el mRNA se
llaman codones, los cuales se asocian con los anticodones en el tRNA que lleva aminocidos
especficos.
Las mutaciones se producen como resultado de alteraciones en el cdigo gentico (o en el
acceso a l). Estas pueden ser cambios globales en los cromosomas, que pueden verse al
microscopio, o bien, cambios
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3.9 INGENIERIA GENETICA
3.9.1 Metodologa
Las tcnicas de la ingeniera gentica, tambin conocidas como tecnologa del DNA recombinante,
han evolucionado las ciencias biolgicas. Dicho en forma simple, con estas tcnicas se logra la
captacin de DNA de una fuente conocida y su incorporacin a un vector para mover y amplificar
esta pieza de DNA para su anlisis. Los vectores pueden ser estructuras basadas en plsmidos, o
bien, en virus. Los plsmidos son molculas pequeas de DNA circular que se encuentran
comnmente en bacterias. Las clulas que captan estas molculas se conocen como clulas
transformadas.
Se emplean diferentes mtodos para aislar genes de inters de organismos procariticos, eucariticos
inferiores, plantas y animales. El DNA se puede aislar por clonacin, es decir, la amplificacin de
secuencias de DNA idnticas, mediante varios mtodos que producen fragmentos de DNA
adecuados para su incorporacin en un vector. stos incluyen el corte del DNA en sitios especficos
mediante enzimas conocidas como enzimas de restriccin, la ruptura fsica de molculas grandes de
DNA por esfuerzo de corte, la sntesis de DNA complementario (cDNA) a un mRNA mediante el
uso de la enzima transcriptasa reversa, o bien, al sntesis qumica del DNA.
Estas enzimas sirven a la bacteria en la que aparecen, como proteccin contra DNA extrao. Las
enzimas cortan el DNA extrao desde el exterior de la hlice, pero no digieren el DNA husped
debido a los patrones de metilacin caracterstico del DNA. Hay muchas enzimas de restriccin
conocidas, de las cuales muchas de ellas estn disponibles en forma comercial; algunas de ellas
reconocen secuencia similares como su sitio de actividad. stas se conocen como isoquizmeros.
Las enzimas de restriccin se nombran de acuerdo con las especies de donde provienen, con
nmeros romanos para distinguir enzimas diferentes que provengan del mismo organismo. Por
ejemplo, la enzima Hapa I proviene de Haemophilus parainfluenzae.
La enzimas de restriccin reconocen secuencias de DNA con un eje de simetra repetido llamadas
secuencias palindrmicas (ver figura).
En estas secuencias algunas enzimas de restriccin cortan a la doble hlice a lo largo del eje de
simetra y otras la cortan de manera escalonada. En el primer caso se dice que las enzimas producen
extremos romos y en el segundo caso se dice que los extremos son cohesivos. La formacin de
extremos cohesivos es una propiedad muy til, ya que el DNA obtenido de una fuente distinta, pero
cortada de manera similar, se puede asociar mediante puentes de hidrogeno entre bases
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complementarias. Una DNA ligasa (generalmente ordinaria del fago T4) puede unir entonces las
molculas para producir DNA hbrido o quimrico.
Las secuencias de cuatro o seis bases reconocidas por enzimas de restriccin se presentarn en un
nmero limitado de sitios de todo el DNA de un organismo (DNA genmico). El corte con enzimas
de restriccin dar como resultado longitudes adecuadas de DNA para clonacin, aunque debe
tenerse cuidado en caso de que el gen de inters tenga un sitio de restriccin para la enzima dentro
de l. Esto se puede superar solo mediante la digestin parcial de la enzima, de modo que, en
promedio, el gen de inters quede intacto. La frecuencia probable de una secuencia particular de
hexanucletidos es aproximadamente cada 4096 pares de bases y pares de bases y para una enzima
que reconoce cuatro bases, cada 256 pares de bases. Por lo tanto, es probable, ya que un gen tpico
de procariotas tiene d 1 a 2 pares de kilobases (1000 bases), que por lo menos algunas
endonucleasas de restriccin que reconocen 6 pares de bases, no corten tal secuencia. En los
eucariotas los genes pueden ser ms grandes y contener secuencias interpuestas llamadas intrones,
que pueden causar complicaciones.
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3.9.3 Aislamiento de cDNA
En ciertos casos los anticuerpos monoclonales se pueden usar para aislar un mRNA slo a partir de
los componentes celulares. Los anticuerpos monoclonales se obtienen, se inyectan a un ratn o a un
conejo con la protena para la que se requiere el cDNA.
El animal se sacrifica posteriormente para obtener las clulas del bazo, las cuales se fusionan con
clulas de mieloma. Las clulas denominadas hibridomas producen un anticuerpo muy especfico
para la protena blanco (ver figura de abajo).
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El anticuerpo se utiliza entonces para precipitar mRNA para la protena de inters mientras se
produce en el ribosoma. As, el mRNA se separa del anticuerpo como ya se describi, y se obtiene
una copia de cDNA. Puesto que los genes de los eucariotas superiores a menudo contienen
secuencias interpuestas no codificadoras llamadas intrones, la produccin de cDNA es crtica en la
representacin de secuencias codificadoras cuando es necesaria la expresin en los organismos
inferiores. Lo anterior evita los problemas asociados con el reconocimiento y proceso de secuencias
no codificadoras.
El anlisis de la enzima de restriccin permite indicar la posicin de los genes al cortarlos, o bien,
sus secuencias laterales efectuaran su expresin cuando se analice la formacin de producto gnico
en los fragmentos. Las secuencias laterales intervienen en funciones tales como regulacin, la unin
de la RNA polimerasa y la unin ribosmica.
La nucleasa S1 digiere nicamente DNA o RNA de una sola hebra. El mapeo con la nucleasa S1 es
una herramienta muy til para ubicar el sitio de transcripcin en el DNA.
Mediante la hibridacin de una RNA transcriptasa a DNA de una sola hebra, se produce un hibrido
resistente a la digestin por la nucleasa S1. As, es posible desnaturalizar el hibrido DNA-RNA y
analizar y separa el DNA.
En forma rutinaria, las molculas de DNA se analizan mediante electroforesis en gel. El gel es una
red compleja de molculas polimricas y la distancia que el DNA migra a travs del gel refleja su
tamao, el cual se puede estimar usando fragmentos de DNA marcador como referencia. La agarosa
se usa en el anlisis de molculas de varios cientos hasta 20000 pares de bases, en tanto que la
poliacrilamina se usa para fragmentos de DNA ms pequeos. El DNA se observa usando luz UV
despus de teirlo con bromuro de etidio (ver figura)
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Por otra parte, la tcnica complementara con el RNA que ha sido transferido al papel de
nitrocelulosa o otras membranas (ver figura)
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La secuencia de bases del DNA se puede determinar usando uno de dos mtodos. En uno de ellos,
creado por Maxam y Gilbert, se necesita el rompimiento de la hebra en bases especficas, con lo que
se obtiene molculas de tamao caracterstico. El segundo mtodo, ms usado requiere la sntesis de
DNA en presencia de nucletidos, pero con la adicin de un nucletido anlogo que interrumpe la
sntesis (un trifosfato de di-desoxinuclesido). Ambos mtodos utilizan una cantidad limitante de
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ruptura de DNA o reactivo de terminacin, por lo que la frecuencia de estos eventos es aleatoria y
ocurre en cada sitio disponible en el DNA. Las molculas de tamao diferente son separadas por
electroforesis en gel de poliacrilamida y se observan mediante la autorradiografia de DNA marcado
radiactivamente.
Los plsmidos son molculas de DNA de doble hebra que contienen la informacin de un origen de
replicacin y varias protenas. En las bacterias estas protenas a menudo estn asociadas con la
resistencia, por ejemplo, a los antibiticos. En este caso, los plsmidos llevan la informacin de
protenas que rompen el antibitico. Los plsmidos se aslan y modifican para su uso en la
experimentacin con DNA. Un ejemplo de un plsmido de uso comn es el pBR322 (ver figura)
El plsmido consta de 4362 pares de bases y lleva genes resistentes a la ampicilina y la tetraciclina.
Su mapa de restriccin est perfectamente caracterizado con un sitio para la enzima Bam HI en el
gen resistente a la tetraciclina y un sitio Pst I en el gen existente a la ampicilina. El DNA
recombinante se puede preparar mediante la ruptura de uno de estos dos sitios de restriccin. Lo
anterior produce extremos cohesivos y se puede asociar, mediante puentes de hidrogeno, un
fragmento de DNA de otra fuente obtenido con la misma enzima. Por ltimo, el DNA es unido
covalentemente por medio de la enzima DNA ligasa.
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Si el DNA del plsmido (pBR322) y el de la fuente se cortan con Bam HI y se ligan entonces esto
inactiva al gen de resistencia la tetraciclina, y la introduccin del plsmido recombinante E coli da
lugar a que la bacteria sea sensible a la tetraciclina y resistente a la ampicilina. Las bacterias que no
hayan incorporado el plsmido se eliminan exponindolas a ampicilina; entre las colonias resistentes
a este antibitico, aquellas que son resistentes a la tetraciclina contienen insertos de DNA.
Los plsmidos que contienen genes de inters tendran que ser aislados de insertos obtenidos del
DNA celular total o de cDNA obtenido a partir de mRNA. Estos pueden determinarse si se dispone
de una sonda para el gen de inters al realizar la hibridacin de la colonia. El DNA de colonias
individuales se hibrida en filtros de nitrocelulosa. O tambin, es posible seleccionar un plsmido si
se puede detectar su protena caracterstica, por ejemplo, al rescatar una bacteria mutante por medio
del DNA extrao que substituye a una enzima. Este tipo de seleccin depende de la expresin de los
genes en husped extrao, la cual no siempre se efecta, especialmente cuando se trata de genes
eucariticos
Incorporados a bacterias. Esto se debe a que los mecanismos de expresin difieren, y tambin a que
los genes eucariticos pueden contener secuencias interpuestas denominadasintrones.
3.9.9 Bacterifagos
Los bacterifagos (fagos) son virus bacterianos que se usan como vectores. Ellos infectan capas
bacterianas y presentan algunas ventajas sobre los plsmidos. La caracterstica principal es que
pueden contener fragmentos grandes de DNA recombinante, lo cual reduce el nmero de aislados
necesarios para representar a los genes de los eucariotas superiores.
El fago , como sus derivados, se usa mucho, y hasta un tercio de su DNA se puede reemplazar con
DNA extrao. El DNA circular de una sola hebra, el cual se puede obtener del fago M13, y sus
derivados, tambin se usan frecuentemente en el mtodo didesoxi (Sanger) para el anlisis de la
secuencia de DNA.
En el fago hay secuencias especificas de DNA denominadas sitios cos que permiten el
empaquetamiento del DNA. Dichos sitios se han clonado en plsmidos para producir csmidos.
Estos vectores contienen diferentes sitios de restriccin y marcadores de resistencia a antibiticos.
Los csmidos pueden llevar fragmentos de DNA grandes de 30 a 45 kilobases cuando el DNA est
empaquetado en forma similar al DNA del fago . Los csmidos contienen el potencial para llevar
molculas de DNA grandes.
3.9.10 Virus
Los virus eucariticos se usan como vectores de clonacin, este es el caso del virus SV40 usado con
algunas clulas de mamferos.
Las manipulaciones de DNA recombinante se efectan en bacterias (E. coli), pero en ocasiones los
gens pueden ser transferidos de nuevo a otros huspedes. En algunos casos, se han creado vectores
de va colateral que pueden funcionar en dos tipos de husped. Un ejemplo se encuentra en la
levadura Saccharomyces cerevisiae, en el cual una parte del plsmido pBR322 y otra parte del
plsmido denominado 2m (de la levadura), se entrelaza con un gen de levaduras. Esto puede
funcionar en E. coli con la seleccin de bacterias que llevan plsmidos en base a la resistencia a los
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antibiticos y en las levaduras por la presencia de genes, para los cuales la clula de levadura
husped es defectuosa. Esto permite que las clulas de levadura que llevan plsmido sean
seleccionadas, ya que ste deja que ellas crezcan.
Existen plsmidos vectores para otras bacterias y levaduras, as como para algas, plantas y clulas de
mamfero. Estos vectores son de importancia prctica, ya que muchos organismos proporcionan
caractersticas novedosas que se optimizan mejor in situ, en vez de tratar de llevarlas a un sistema
extrao (heterlogo). Otra caracterstica de E. coli, es que no se utiliza en ninguna fermentacin
industrial tradicional. Las bacterias que se acostumbra usar son: Bacillus sp, para la produccin de
enzimas, actinomicetos para la produccin de antibiticos o corineformes para la obtencin de
aminocidos.
Existen sistemas de vectores para Bacillus subtilis, que incluyen vectores de va colateral E. coli-B
subtilis y otros semejantes para Streptomyces. El inters en las ltimas especies se debe a que con
ellas se produce mayor variedad de antibiticos. Se espera mejorar los rendimientos de estos
antibiticos y modificarlos. Las especies de Pseudomonas tambin son recomendables como
huspedes para los plsmidos recombinantes. Estos organismos son de inters debido a su capacidad
para degradar muchos contaminantes de la atmosfera.
Ha surgido gran inters en cuanto a los sistemas de gran clonacin de levaduras, tanto para la
produccin de compuestos de importancia comercial como para el mejoramiento de la utilizacin de
substratos. Las tcnicas tambin han demostrado ser muy valiosas en el uso de levadura como un
sistema modelo para el anlisis de clulas eucariticas. En cuanto a la aplicacin prctica, se ha
puesto mucho inters en el uso de la levadura como husped para la produccin de compuestos
valiosos por medio de la ingeniera gentica, debido a la experiencia acumulada que existe para la
fermentacin de levaduras.
Se han obtenido varios tipos de vectores para levaduras, los cuales tambin se replican con E. coli
(ver figura).
Cuatro plsmidos de levaduras. Un plsmido integrante contiene un marcador que las levaduras eligen
pero ningn origen de la replicacin para ellas. Estos plsmidos sern estables solamente si se integran
en los cromosomas de las levaduras. Un plsmido episomal contienen un marcador elegible para las
levaduras y un segmento de DNA del circulo 2m. El DNA de este crculo contiene el origen de la
replicacin y tambin los genes rep, los cuales mantienen estables al plsmido extracromosmico a un
nmero de copias relativamente bajo. Un plsmido replicante contiene un segmento de DNA (la
secuencia ARS) que le permite replicarse de manera autnoma en clulas de levaduras; sin embargo, las
secuencias ARS que contienen plsmidos no son estables, ya que no existe un mecanismo para mantener
tales plsmidos extracromosmicos a alto nmero de copias durante la mitosis. Su estabilidad se logra
al aadir una secuencia CEN, un segmento de DNA de uno de los centrmeros de levadura que se unen al
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Las manipulaciones del DNA se hacen en E. coli, donde la seleccin se basa en la resistencia a
antibiticos. Los plsmidos tienen sitios diana nicos para varias enzimas de restriccin, as como
marcadores elegibles para las levaduras, los cuales pueden rescatar por complementacin clulas
huspedes mutantes.
Los plsmidos episomales de levaduras (YEp), contienen una parte del plsmido 2m de la levadura
unida al plsmido bacteriano y al marcador elegible para la levadura. En una clula hay
aproximadamente 50 a 100 copias del plsmido 2m; los vectores hbridos tambin estn presentes
como plsmidos en copias mltiples que son mantenidos bajo seleccin. Los vectores de este tipo
tienen una alta diferencia de transformacin.
Tambin se han obtenido los plsmidos constitutivos de las levaduras (YIp), los cuales carecen de
secuencias del plsmido 2m pero contienen secuencias para el rescate de mutantes, as como para
la seleccin y replicacin en E. coli. Debido a que no tienen un origen de replicacin transforman las
clulas de levadura mediante integracin en DNA cromosomal, y realizan la transformacin a una
rapidez que es varias rdenes de magnitud menor que la de los plsmidos YEp.
Se han obtenido plsmidos replicantes de levaduras (YRp), que contienen secuencias de estas, lo
cual les confiere la capacidad de replicarse de manera autnoma. En otros aspectos, estos vectores
son semejantes a los vectores YIp. El nmero de copias de los vectores YRp en clulas
transformadas es bajo (aproximadamente 10) y son inestables.
Las secuencias de nucletidos ubicadas a cada lado de las secuencias codificantes de los genes,
contienen estructuras importantes para la expresin y regulacin de este. En la regin 5de las
clulas eucarioticas y procarioticas esta las secuencias de DNA que enlazan a las protenas. Estas
incluyen a las secuencia Pribnow, o bien TATAAT de los procariotas, donde empieza la
transcripcin, la cual va precedida por la secuencia TTGACA, que es el sitio de reconocimiento de
la RNA polimerasa. Las regiones 5se conocen como promotores y la posicin de estos elementos es
crucial para la expresin del gen. En los eucariotas opera un sistema similar que consiste en una
secuencia TATAAAA/T de Goldberg-Hogness a unos 25 pb hacia arriba del sitio de iniciacin, con
un segundo elemento CAAT ubicado a unos 80 pb hacia arriba, que tambin puede ser importante.
En los procariotas, la secuencia AGGAGGU, conocida como secuencia de Shine-Delgarno, es
importante en la colocacin correcta del mRNA en los ribosomas.
Las secuencias hacia abajo del gen tambin son importantes para la expresin. En los procariotas, la
terminacin de la transcripcin ocurre en secuencias especficas que pueden formar una estructura
secundaria rizada. En los eucariota es importante una secuencia AAUAA, ya que se aade un
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extremo poli-A de aproximadamente 100 a 200 residuos, sin embargo, se tiene que saber ms acerca
de las seales de terminacin.
La importancia de las regiones 3 (hacia abajo) y en particular, las regiones 5 (hacia arriba) de los
genes, ha dado como resultado la incorporacin de tales elementos en los denominados vectores de
expresin. La regin 5hacia arriba contiene elementos que dan por resultado la expresin
caracterstica de los genes. Estas regiones han sido tomadas de genes altamente expresados y se han
usado para expresar otras protenas incluyendo protenas de importancia comercial.
En las levaduras, estas han sido usadas, por ejemplo, con el promotor de la 3-fosfo-glicerato cinasa
para expresar el interfern alfa del hombre. Las concentraciones de las protenas no son tan altas
como lo serian si estuviese presente en el vector el gen PGR de las levaduras, debido a que la carga
de la clula de producir grandes cantidades de tales protena que, entre otras cosas, pueden afectar la
viabilidad.
Idealmente, la secuencia promotora usada debe ser controlable de modo que la sntesis de protena
en concentracin alta se accione en el momento adecuado. Este tipo de regulacin se puede obtener
usando, por ejemplo, promotores de protenas de choque trmico, o bien, como se ha logrado en las
levaduras, un promotor de fosfatasa acida, el cual funciona a 28 C pero no a 35 C. Esto permite
obtener suficiente biomasa antes de pasar a la sntesis del producto.
Otra caracterstica de aplicacin potencial es el uso de vectores de secrecin que permiten exportar
el producto y su recoleccin a partir de caldo de fermentacin ms que la masa celular. Esto tiene
aplicacin posible en sistemas celulares inmovilizados.
Estos vectores de secrecin se pueden desarrollar en muchos sistemas. En las levaduras, se basan en
todas las protenas secretadas conocidas e incorporan la terminal amino principal de tales protenas
que se requiere para el proceso previo a la secrecin. La hormona sexual de levaduras, denominada
factor alfa, se ha utilizado para lograr la secrecin, pero parece ser que las levaduras tambin pueden
reconocer y procesar seales de secrecin colocadas en genes de interfern de eucariotas superiores.
En comparacin con las levaduras, hubo un menor avance de los sistemas de clonacin gnicos en
hongos filamentosos.
En las plantas, tambin se han obtenido sistemas de clonacin de genes. Se han construido
plsmidos que se replican autnomamente para la alga verde unicelular Chlamydomonas reinhardii.
Este sistema promete la produccin por medio de un crecimiento fotosinttico. En los ltimos dos
aos hubo un avance rpido en los sistemas de clonacin en plantas superiores. Este problema se
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soluciono al investigar vectores posibles basados en virus y plsmido vegetales. La solucin que se
basa en los plsmidos Ti de la bacteria Agrobacterium tumefaciens, inductora de tumores vegetales
parte de este plsmido y se incorpora en el DNA vegetal; el DNA extrao incorporado en esta parte
del plsmido usando enzimas de restriccin y la DNA ligasa se incorporan junto con el DNA Ti.
Esto ha abierto amplias posibilidades para el mejoramiento de los vegetales, no obstante, el
plsmido Ti solo se puede insertar de manera natural en un nmero limitado de especies vegetales,
las cuales no incluyen algunos de los cultivos ms importantes. Los sistemas de vectores para estas
especies aun se encuentran en investigacin y entre sus posibles aplicaciones se encuentran la
manipulacin de vas biosintticas, la incorporacin de resistencia y el mejoramiento del valor
nutricional de las cosechas.
Se puede introducir DNA extrao en el DNA de las clulas de mamfero mediante la microinyeccion
directa en el embrin. La obtencin de sistemas de clonacin de genes en cultivos de clulas de
mamfero es de la mayor importancia ya que pueden ser la base de procesos de fermentacin
comerciales.
Las clulas transformantes pueden ser detectadas con facilidad luego de la incubacin con DNA
total si existe una forma de seleccionarlas. La deteccin de transformantes se baso inicialmente en la
complementacin de clulas deficientes en una funcin determinada, con el gen activo
correspondiente. La cotransformacion de un gen deseable unido a un marcador seleccionable, por
ejemplo, de resistencia a antibiticos, puede superar este problema y permitir la integracin en los
cromosomas.
En la actualidad se cuenta con vectores virales para clulas de mamfero, la mayora se basa en el
virus circular SV40. Se han obtenido derivados que contienen un replicn de E. coli unido al suyo
que contiene de expresin en el cual se pueden insertar y expresar los genes extraos. Estos vectores
de va colateral pueden usar de nuevo E. coli para manipulaciones de DNA con transferencia de
lneas de clulas de mono, en las cuales se efecta el anlisis de su expresin o efecto. La funcin
episomal de este y otros vectores virales limita el nmero de huspedes, pero se puede usar para la
integracin cromosmica en otras clulas.
RESUMEN
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TEMA 4 MEJORAMIENTO DE CEPAS INDUSTRIALES
4.1 INTRODUCCION
Una forma de mejorar el rendimiento es mediante la optimizacin del medio de cultivo y de las
condiciones de operacin, pero esto est limitado por la capacidad de sntesis mxima del producto
deseado que tiene el organismo. La otra posibilidad es el mejoramiento gentico de la cepa.
La gentica se puede usar de muchas maneras para mejorar las caractersticas deseadas de un
organismo. La reproduccin comn se puede aplicar a una amplia variedad de organismos, aunque
el ciclo sexual de muchos organismos de importancia comercial aun se desconocen.
Alternativamente se puede usar la mutagnesis, fusin de protoplastos y la ingeniera gentica. El
mejoramiento no solo se puede referir al rendimiento del producto, sino tambin a la estabilidad del
crecimiento, crecimiento mejorado, resistencia, o a la eliminacin de productos laterales.
1. S eleccin natural
Se debe tener en cuenta que en cada divisin celular hay una pequea probabilidad de que ocurra
un cambio gentico, por lo cual no es sorprendente que en una gran masa celular la poblacin sea
heterognea. Esta distribucin puede presentar problemas de rendimientos debido a que en
general las variantes tienen menores niveles de produccin que la poblacin parental. Estos
cambios definitivos (mutaciones) se deben distinguir de las variaciones fenotpicas que dependen
de las condiciones ambientales y que tienen lugar en todas las clulas de la poblacin que
expresan la misma modificacin fisiolgica, dentro de las variaciones permitidas por su genotipo.
En las mutaciones espontneas el elemento responsable de la mutacin no es conocido, pero igual
que las inducidas (el factor mutagnico se conoce) son estables y hereditarias y tienen una
frecuencia estadsticamente medible (tasa de mutacin).
La frecuencia de mutaciones espontneas vara entre 10-6 a 10-9 mutaciones por genoma y por
generacin. Por lo tanto, si se considera un valor de 10 -7 se debern estudiar un gran nmero
de organismos (> 10 7) en la bsqueda del tipo deseado.
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En la seleccin de variantes naturales, una prctica que todava es utilizada se refiere a la
observacin de las caractersticas morfolgicas de las colonias, las cuales, en manos de un
operador avezado, se asocian con mayor o menor productividad, lo que permite seleccionar y
posteriormente estudiar los clones aislados.
Estos estudios involucran una etapa de crecimiento seguida por ensayos de evaluacin del
producto. En estos casos es ms adecuado realizar las experiencias en erlenmeyers de hasta 500
ml, ya que si bien demanda una considerable mano de obra, los resultados de ensayos en tubos o
pequeos frascos son menos confiables.
Cuando se comparan los incrementos en los rendimientos de cepas obtenidas por mutaciones
naturales como las que resultan del empleo de un agente tal como la luz ultravioleta se observa, en
general, que con agentes como el mencionado los incrementos en productividad son superiores y
con una mayor tasa de mutacin.
2. Mutacin inducida.
Hasta donde sea posible el aislamiento del mutante debera utilizar la caracterstica mejorada del
mismo como factor de seleccin. El incremento de su productividad podra ser el resultado de
una modificacin en los mecanismos de control que limitan el nivel de produccin y/o de una
variacin en los precursores que llevan al producto. En este sentido el conocimiento de las
rutas y mecanismos de control de la biosntesis de un producto facilitan la estrategia a seguir en
el aislamiento.
Es importante en los programas de bsqueda y seleccin, tener una alta proporcin de mutantes
entre la poblacin sobreviviente al tratamiento, debido a que slo estos individuos son los
estudiados. Con el aumento de la dosis del mutgeno en general se incrementa esta proporcin,
aunque para cada mutgeno y cada organismo hay una dosis ptima. Los agentes mutagnicos
pueden ser agrupados en:
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muerte entre el 90 y 99.9%. Otros agentes como rayos X y rayos v son actualmente poco
utilizados.
2. Qumicos: Estos agentes se emplean en concentraciones del orden de 0.05M con
exposiciones de 0.5 a 12 horas. Como muchos de ellos son no txicos, el grado de
mortandad no es empleado como dato de eficiencia. El tratamiento se realiza
adicionando el mutgeno a una suspensin de clulas, la cual es incubada a temperatura
constante un determinado tiempo. Estas manipulaciones requieren personal con
experiencia debido a las lesiones que pueden ocasionar. Entre estos agentes se destacan
los siguientes: a) Acido nitroso. Este agente induce transiciones A-T --- G-C y/o
deleciones por uniones cruzadas en el interior de la cadena. b) N-metil-N'-nitro-N-
nitrosoguanidina (NTG). Es uno de los mutgenos ms potentes, produciendo una alta
tasa de mutacin con bajo porcentaje de mortandad. Requiere de un manejo sumamente
cuidadoso. c) Anlogos de base. Producen transiciones, como el 5-bromuracilo y la 2-
aminopurina, siendo otros anlogos menos efectivos. Sus modos de accin dependen de
sus incorporaciones al nuevo ADN formado y del lugar que ocupen al sustituir a la base
normal. d) Mutgenos estructurales, como la proflavina o naranja acridina que no son
incorporados covalentemente al ADN, sino que actan como agentes de intercalado en la
estructura, promoviendo adiciones o deleciones simples durante la sntesis.
3. Recombinacin gentica
Todos los procesos no meiticos en clulas vegetativas que llevan a recombinacin son llamados
parasexuales y aparecen tanto en organismos procariotas como eucariotas.
Los virus pueden intercambiar material gentico entre cepas heterognicas despus de una
infeccin mixta en el mismo husped. En bacterias el fenmeno de recombinacin se observa
en: 1) conjugacin, en donde la transferencia de material gentico se realiza a travs de pilis,
teniendo algunas caractersticas de un proceso sexual; 2) transduccin, en el que la transferencia
de ADN de una clula a otra se realiza mediante una partcula viral que acta como vector; y 3)
transformacin, donde la recombinacin puede ocurrir despus de la insercin experimental de
un ADN aislado, a una bacteria receptora.
El intercambio de material gentico entre diferentes especies puede tambin ser alcanzado por
fusin celular. El primer paso en este caso es la preparacin de protoplastos, los cuales son
clulas que han perdido su pared celular externa y son limitadas solamente por su membrana.
Se los prepara sometiendo una suspensin celular a la accin de enzimas degradativas de la
pared (lisozima) en un medio isotnico, para minimizar la ruptura por efectos osmticos. Los
protoplastos de los cultivos que se desea fusionar, son mezclados y fusionados en presencia de un
agente inductor (polietilenglicol 50%) y de dimetil sulfxido en algunos casos, luego de lo cual se
los siembra rpidamente en un medio completo para regenerar las clulas.
4.2.1 Mitosis
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En la profase los cromosomas se vuelven visibles debido a su condensacin y se dividen
longitudinalmente en mitades idnticas conocidas como cromtidas, unidas en una regin conocida
como centrmero. Antes de la profase se ha efectuado la sntesis del DNA, con la que se duplica el
contenido de este.
La formacin del huso empieza en la profase tarda y termina en la metafase; consiste en molculas
protenicas de cadena larga, tubulina que forma dos polos.
Los cromosomas estn unidos al ecuador del huso mediante sus centrmeros. El huso se requiere
para orientar los cromosomas y separar las cromtidas.
En la anafase, los centrmeros se dividen y cada cromtida es llevada a polos opuestos del huso. En
este punto comienza la telofase, en la cual se forma de nuevo la membrana nuclear, los cromosomas
se vuelven menos condensados, y se forman de nuevo los nuclolos.
Se forma una nueva membrana y pared celular entre los dos ncleos y, finalmente las clulas se
separan.
4.2.2 Meiosis
La divisin mittica de las clulas origina clulas hijas con un complemento de cromosomas
idntico al de la clula madre. Sin embargo, para que la fusin sexual de las clulas no de cmo
resultado una duplicacin de DNA, por ejemplo, en la fusin de un espermatozoide y un ovulo, una
divisin reductora o meitica precede a la produccin de las lneas celulares (lnea germinal). Por lo
tanto, le meiosis causa produccin de clulas con la mitad del numero normal de cromosomas.
La esencia de la meiosis es que consiste en dos divisiones celulares, pero solo una divisin
cromosomal, originando la participacin del nmero de cromosomas. Otra caracterstica crtica de la
meiosis es que el material gentico es asignado al azar a las lneas de las clulas germinales, es
decir, cualquiera de cada par de cromosomas puede estar presente en gametos particulares. Adems,
pueden ocurrir intercambios moleculares de porciones de los cromosomas entre pares de ellos,
conocidos como cromosomas homlogos, los cuales mezclan o recombinan el material gentico en
diferentes combinaciones. Este proceso se conoce como recombinacin.
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En la figura se muestra la divisin meitica celular. Esta se puede dividir en dos etapas, cada una de
ellas se divide en profase, metafase, anafase y telofase.
La Primera divisin meitica exhibe una profase prolongada que se auto subdivide. Durante esta
primera profase ocurre el proceso de recombinacin gentica entre los cromosomas homlogos.
Los quiasmas se separan y, en la anafase I, los centrmeros homlogos permanecen intactos y son
llevados a polos opuestos del huso.
En la telofase I se han formado ncleos hijos, cada uno con la informacin gentica de un grupo de
cromosomas, aunque estos han duplicado el DNA.
La segunda divisin meitica puede ocurrir inmediatamente o puede retardarse. La profase meitica
II tiene los cromosomas condensados que aparecen y las cromtidas que se forman. Estas cromtidas
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se alinean a la mitad del huso en la metafase II, pero el huso est en direccin opuesta a la de la
primera divisin meitica. En la anafase los centrmeros se separan y un cromosoma se mueve a
cada polo del huso. La membrana nuclear se forma de nuevo y se producen cuatro clulas
germinales, conocidas como ttradas, a partir de la clula madre. Cada clula de la ttrada tiene un
complemento gentico haploide.
Las reglas de la herencia de las eucariotas estn determinadas por la divisin meitica. Un par de
cromosomas que llevan la informacin gentica pueden ordenar aleatoriamente a las clulas
haploides de la ttrada.
Las clulas germinales derivadas de la ttrada darn un resultado predecible para su progenie
cuando ocurra la fusin con otra lnea germinal conocida. Para que quede claro, el carcter bajo
anlisis debe ser determinado por uno o pocos genes. Estas leyes simples que gobiernan la herencia
fueron deducidas por Gregorio Mendel en experimentos con guisantes en los cuales se registraron
las proporciones exactas de los tipos de descendientes.
Dos trminos usados frecuentemente por los genetistas para describir la fusin de las lneas de
clulas germinales son el Genotipo, que consiste en la constitucin gentica de una muestra y el
Fenotipo, que se refiere a la apariencia de la muestra.
Mendel observo que en las cruzas entre cepas con dos caracteres diferentes, la descendencia o F 1
exhiba solo uno de los caracteres o Fenotipos, el cual se describi como dominante. El otro
Fenotipo o carcter se describi como recesivo. Mediante la cruza F 1xF1, el Fenotipo recesivo se
puede recuperar en la generacin F2 con una frecuencia predecible. Sin conocimiento de la meiosis o
los cromosomas Mendel dedujo que:
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Por ejemplo, en el entrecruzamiento de lneas puras de plantas amarillas y verdes, Mendel encontr
que se produjo una amarilla impura F1 como heterocigoto. La cruza de la F1 con F1 producira varios
cigotos posibles se cada gene se pudiera ordenar y segregar al azar. Esto da origen a una relacin
definida del fenotipo entre la descendencia de I amarillo puro, 2 amarillos impuros; 1 verde.
Algunas veces, cuando se examinan pares de caracteres no hay segregacin independiente, sino una
tendencia de los dos caracteres heredados a transmitirse juntos. Esto se debe a su presencia en el
mismo cromosoma y, por lo tanto, estn fsicamente unidos entre s. Este ligamento se puede tomar
como evidencia firme de que pares de genes se ubican en el mismo cromosoma.
Muchos caracteres, como el peso de una res muerta o la produccin de plantas forrajeras no se
deben a la transmisin de genes individuales, sino a los efectos combinados de muchos pares de
genes, donde cada uno contribuye con un efecto aditivo. Sin embargo, debido a que estos genes
obedecen los principios de la herencia, es posible designar y estudiar la transmisin de genes por
medio de tcnicas estadsticas.
La recombinacin tambin ocurre en bacterias y, con mayor razn en las clulas mitticas de los
eucariotas pero sin un mecanismo especializado para facilitar su frecuencia, a saber, el apareamiento
de cromosomas homlogos durante la profase meitica I. Tambin se cuenta con tcnicas para el
mapeo gentico de algunas bacterias. Estas se basan en el ligamiento de genes cuando son
transferidos por bacterifagos, o mediante el proceso de transferencia por conjugacin. En este
ltimo proceso, una parte del cromosoma de E. coli se transfiere de una clula donadora a una clula
receptora.
4.5 MUTAGNESIS
Los programas de mutacin y seleccin han probado ser extremadamente exitosos en aumentar el
rendimiento de antibiticos y otras substancias como los aminocidos. La frecuencia natural de la
mutacin es baja y es necesaria una seleccin extensiva.
Muchos de estos cambios mutacionales para la produccin de antibiticos son pequeos y conducen
a aumentos de produccin el orden de algunos por cientos, como en el caso de la produccin de
cefalosporina a partir de Cephalosporium sp, y en la obtencin de penicilina a partir de Penicillium
chrysogenum. Un aspecto de tal mejoramiento es que los cambios mutacionales se pueden efectuar
sin conocer el ciclo sexual o la base bioqumica de la formacin del producto.
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Los mutgenos se pueden clasificar en fsicos (rayos X, luz UV) y qumicos. Estos pueden producir
mutaciones por eventos de replicacin errnea mediante la alteracin de las propiedades de
apareamiento de las bases, o errores cometidos durante la reparacin de lesiones en el DNA.
Se cree que las clulas eucarioticas exhiben mayor discriminacin durante la replicacin del DNA
que los procariotas, y que gran parte en las mutaciones en los eucariotas son el resultado de errores
en la reparacin. Sin embargo, la naturaleza del dao en el DNA afecta los tipos de mutacin
inducidos y una consecuencia de tal especificidad es la variacin del mutgeno usado para variar los
tipos de mutacin producidos. Otra caracterstica de la induccin de la mutacin es que se requiere
una dosis especfica para producir el mximo de mutaciones. A menudo, dosis mayores pueden
ocasionar que la frecuencia disminuya al aumento de letalidad despus del tratamiento.
Las mutaciones han permitido un incremento de 500 veces en la produccin de penicilina a partir de
Penicillium chrysogenum. En este caso, como en otros con produccin de metabolitos secundarios,
el conocimiento real acerca de las enzimas que participan de la regulacin de la produccin del
antibitico es escaso, sin embargo, un protocolo de mutacin-seleccin aun posibilita una
produccin mayor. Los tipos de mutantes aislados en tales circunstancias a menudo reflejan
cambios, en las etapas limitantes del producto de las rutas metabolicas, como liberar la inhibicin
del producto final, reducir o abolir la formacin de subproductos, aumentar la cantidad o actividad
de las enzimas o incrementar la eliminacin del producto de la clula al disminuir el grado de la
inhibicin del producto final (ver figura).
Los tipos de mtodos de seleccin usados para aumentar el rendimiento incluyen tanto la seleccin
aleatoria, as como, la seleccin racional. Esta ltima utiliza principios bioqumicos genticos, o
ambos, para selecciones aisladas. Estos se basan en distintos mtodos tales como:
Se han usado mecanismos dependiendo del producto de inters. Estos incluyen mutaciones en la
membrana celular que permiten mayor salida del producto, o bien por regeneracin de protoplastos,
que parece estar asociada en el asilamiento de mutaciones en Streptomyces.
El mejoramiento de las cepas industriales tambin se pueden lograr por medio de tcnicas de
reproduccin cuando se cuente con ellas, y tcnicas parasexuales cuando no este disponible ningn
ciclo sexual. Estas tcnicas buscan incorporar los fenotipos deseables en una al recombinar el
material gentico.
Los ciclos sexuales dependen de la meiosis para conseguir una combinacin nueva de cromosomas
en la descendencia de acuerdo con los principios mendelianos. Esto solo puede lograrse entre cepas
e la misma especie y se ha usado en la produccin comercial de hongos y en la levadura
Saccharomyces cerevisiae para mejorar los proceso de horneado y de elaboracin de cerveza. De
esta forma se ha hecho ms rpida la produccin de pan, se ha logrado mayor tolerancia al alcohol y
mayor utilizacin de carbohidratos.
Por desgracia, solamente otros pocos organismos importantes en biotecnologa tienen procesos
sexuales. Sin embargo, la recombinacin del material gentico se puede lograr por mecanismos
parasexuales. Estos procesos pueden incluir mecanismos de conjugacin y transduccin para la
transferencia del DNA de las bacterias, fusin de protoplastos, comn tanto a bacterias como a
eucariotas y la induccin de apareamientos forzados y recombinacin mittica en eucariotas.
El ciclo parasexual en los hongos fue descubierto a principios de los 50 (ver figura).
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Con la tcnica se logra la hibridacin de dos cepas, induciendo inicialmente diferentes lesiones
auxotrficas en cada una. Como auxtrofos, requieren la adicin de un metabolito primario para su
crecimiento.
Al colocarlos en placas con medio sin ninguno de los requerimientos, solamente los hbridos pueden
crecer donde cada efecto es complementado por la enzima activa de la otra cepa.
La recombinacin puede ocurrir entre los dos genomas parentales por recombinacin mittica entre
regiones homologas del DNA.
Este ltimo fenmeno se puede mejorar mediante los llamados agentes haploidizantes, como la p-
fluorofenilalanina y el benelato. Estas sustancias promueven la perdida de cromosomas y se puede
examinar la retencin de los fenotipos deseados en las cepas haploides o casi haploides.
Metabolitos primarios son aquellos esenciales para la vida de un microorganismo como por ejemplo,
aminocidos, nucletidos, vitaminas, cidos orgnicos.
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Antes de considerar la seleccin de este tipo de mutantes, es necesario conocer los mecanismos de
control involucrados en la biosntesis de estos metabolitos. Las concentraciones de los mismos estn
reguladas por sistemas de control por retroalimentacin ("feed back). Los dos principales sistemas
involucrados son inhibicin y represin "feed back".
La represin es aquella donde el producto final de una va metablica previene la sntesis de una
enzima o de todas las que catalizan la va mencionada. Esto ocurre a nivel de cido
desoxirribonucleico (ADN), impidiendo la transcripcin del gen a cido ribonucleico mensajero
(mRNA). Este mecanismo es de accin ms lenta que el anterior, ya que permite actuar a las
enzimas preformadas.
Los mutantes que no producen inhibidores o represores por producto final pueden ser empleados
para la produccin de intermediarios en caminos no ramificados, o de intermediarios y productos
finales en caminos ramificados.
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adecuado, obtenindose un filtrado enriquecido en auxtrofos, debido a que los esporos
germinados por su mayor tamao son retenidos en el filtro.
Si bien los mutantes auxotrficos se utilizan para producir grandes cantidades de muchas
sustancias de inters, los mismos no son adecuados para la obtencin de productos que controlan
independientemente su sntesis. Un caso tpico es el que figura a continuacin, donde se sintetiza
un producto P.
Para el aislamiento de este tipo de mutantes se puede emplear la tcnica de gradiente en placa,
en la cual existe una variacin en la concentracin del anlogo en un sentido de la placa,
presentando la misma, zonas de escaso crecimiento por altos niveles del anlogo txico desde
donde es posible aislar los mutantes resistentes. Estos debern ser posteriormente estudia- dos
en relacin a la produccin de P.
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4.7.2 Mutantes productores de enzimas de inters industrial
Solamente se tendrn en cuenta las enzimas degradativas, cuya produccin puede ser controlada
por induccin, represin "feed back" y/o represin catablica. Las tcnicas de mutacin en este
caso pretenden alterar los mecanismos de control para obtener mutantes que puedan producir
enzimas en ausencia de in- ductor y an en presencia de represores. Las mutaciones pueden
tener lugar en un gen regulador, eliminando la produccin de un represor activo, o si se
producen en el operador, se podra evitar la unin del represor. Los mutantes que producen
enzimas inducibles en ausencia de inductor se denominan mutantes constitutivos. Los mismos
pueden ser aislados a partir de un cultivo continuo en el cual el sustrato inductor est en
concentraciones limitantes, lo cual favorece el desarrollo de los mutantes constitutivos sobre la
poblacin inducible; empleando inductores dbiles o utilizando ciclos con y sin inductor,
tratando de favorecer el enriquecimiento en la poblacin del mutante constitutivo, ya que al
transferir a un medio con inductor el tipo inducible requiere un tiempo de induccin que no lo
requiere el constitutivo.
Metabolitos secundarios son sustancias no imprescindibles para las funciones vitales como por
ejemplo alcaloides, toxinas, antibiticos, giberelinas, etc.
La relacin entre metabolito primario y secundario presenta todava numerosos interrogantes con
relacin a los mecanismos que controlan la sntesis de estos ltimos. Se deben hacer algunas
consideraciones, ya que en ciertas fermentaciones de antibiticos la velocidad de crecimiento
regula la formacin de enzimas biosintticas. En el caso de la gramicidina S (GS), las GS
sintetasas se forman en la ltima parte de la fase de crecimiento exponencial. Las enzimas
despus de alcanzar un pico en sus actividades especficas desaparecen rpidamente al entrar la
poblacin en fase estacionaria. Los estudios de este producto en cultivo continuo permitieron
establecer una relacin inversa entre la velocidad especfica de crecimiento y la produccin de
sintetasa. Si bien el mecanismo no es conocido, se estableci que los picos de actividad especfica
en funcin de u varan de acuerdo a la naturaleza del sustrato limitante de crecimiento (C, N, S y
P).
Otro factor del proceso de control es la regulacin "feed back" lo que significa que la acumulacin
de metabolitos secundarios (penicilina, cloranfenicol, cicloheximida, etc.) es lo que limita su
propia sntesis. En el caso de caminos ramificados como el de penicilina, la acumulacin
intracelular de lisina disminuye su produccin, efecto que se revierte por el agregado de -
aminoadipato.
Algunos tipos de regulacin "feed back" involucran a fosfato inorgnico, el cual regula la
actividad de fosfatasas. En algunos casos la adicin del fosfato al medio de cultivo limitado se
asocia con un incremento de ATP con disminucin de la formacin de antibitico.
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Como ya se dijo, la glucosa y la fuente de nitrgeno (en especial amonio) si es rpidamente
metabolizada ejerce represin catablica. Un ejemplo es la produccin de cafalosporinas por
Streptomyces clavuligerus, la cual es suprimida por amonio.
Los procedimientos en medios lquidos son en general largos y requieren gran cantidad de
material. La ventaja es que el proceso es controlado en condiciones relativamente comparables
a las de produccin en relacin a agitacin y aeracin.
El test en placas es ms rpido, permite controlar un mayor nmero de colonias con menor
material pero en condiciones que no reproducen la fermentacin en medio lquido. Se trata
aqu de evaluar la cantidad de antibitico excretado por una colonia. Una variante consiste
en cubrir la placa con un celofn estril y agregar sobre el mismo una capa de agar conteniendo
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el organismo indicador, incubando luego la placa toda la noche. De esta forma, las colonias de
los mutantes son mantenidas libres de contaminacin por el organismo sensible. En este caso el
tamao de la zona de inhibicin es controlado por el espesor de la capa. Evidentemente, como se
mencion anteriormente, el programa de mejoramiento debe incluir una mejora en el medio de
produccin.
ACTIVIDADES
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TEMA 5 PROCESOS DE FERMENTACION
5.1 INTRODUCCION
Los efectores internos estn representados por la dotacin gentica intrnseca del organismo
considerado y por sus mecanismos de regulacin metablica. Estos ltimos pueden ser modificados
por alteraciones del medio ambiente o ms precisamente por los efectores externos, mientras que la
existencia de un gen depende de la especie del microorganismo considerado. Un gen est o no est,
slo su expresin puede modificarse. Con el fin de mejorar la productividad de un proceso de
fermentacin las cepas empleadas pueden someterse a tratamiento fsico o qumico de mutacin
que al alterar algn sector del genoma logran aumentar la produccin de un metabolito aunque
tambin pueden disminuirla o incluso suprimirla.
Tambin se puede dotar a un microorganismo de una capacidad gentica nueva cuando se efecta la
insercin de sectores del genoma de una especie en un microorganismo, hacindose ste capaz de
producir metabolitos que desde el punto de vista gentico de su especie no podra hacerlo. La
obtencin de mutantes por el uso de agentes mutagnicos o por algn otro mecanismo bioqumico y
la construccin de cepas nuevas por ingeniera gentica constituyen los recursos de la gentica
microbiana, para mejorar la productividad de un microorganismo dado o para dotarlo de una
capacidad productiva nueva. Es decir, que los efectores internos pueden modificarse para lograr la
optimizacin de un proceso fermentativo.
El comportamiento o expresin fenotpica, o sea lo que realmente se observa como respuesta del
microorganismo al medio ambiente en el reactor es, adems, el resultado de la influencia de las
variables de naturaleza fsica y qumica que constituyen los efectores externos.
Los efectores externos de naturaleza fsica estn vinculados con las condiciones de operacin que
se utilizan en los reactores y son por ejemplo la temperatura, la agitacin, aireacin, etc.; es decir,
estn constituidos por las variables de manipulacin fsica que se fijan o se programan en el curso
del proceso de produccin.
La modificacin de algunos de los efectores fsicos como por ejemplo la temperatura, tiene un
efecto notable sobre un proceso. Si el valor utilizado no es adecuado puede disminuir o an impedir
la formacin de un metabolito determinado. Adems la temperatura puede modificar los
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requerimientos nutritivos de algunos microorganismos, lo que significa que al modificarse el valor
de un efector puede cambiar los requerimientos de otro.
Los efectores externos de naturaleza qumica estn representados por la presencia de los
componentes de los medios de fermentacin, adems del 0 2 que puede considerarse un nutriente
ms. Los componentes de los medios deben cumplir con todos los requerimientos nutricionales y
adems con los requerimientos especficos que son indispensables para la formacin de productos.
Los reactores estn tambin estrechamente vinculados al manejo o manipulacin de los efectores
externos, ya que adems de la regulacin de las variables fsicas permiten segn el modo de
operarlos fijar o regular la alimentacin de componentes de los medios que, como ya se dijo,
constituyen los efectores qumicos. Tal es el caso cuando se operan los reactores en "batch" o en
forma discontinua, (todos los componentes son colocados desde un comienzo en el medio de
produccin) o cuando se opera el reactor en "batch alimentado" donde la alimentacin de los
componentes se realiza en forma controlada durante el proceso. Finalmente cuando se opera el
reactor en continuo, se alimenta medio completo a una determinada velocidad al mismo tiempo que
se deja salir con la misma velocidad medio fermentado, lo que permite tratar a la velocidad de
crecimiento especfico como variable independiente.
La influencia de los efectores internos y externos sobre el comportamiento de una clula microbiana
se puede representar esquemticamente como lo muestra la figura.
Para comprender con claridad estos conceptos es conveniente citar algunos ejemplos
demostrativos. Supongamos una cepa de un microorganismo (B. subtilis) que genticamente est en
condiciones de efectuar la biosntesis de una enzima (-amilasa) y que es colocada en un medio de
cultivo adecuado y en condiciones de operacin ptimas para la produccin de esa enzima. Por
medio adecuado se entiende una fuente de carbono como el almidn o dextrina, adems de fuente
orgnica de nitrgeno, y otras sales minerales. Por condiciones de operacin ptimas se consideran
la temperatura de 30-37 C, agitacin, pH inicial 6.5-7.0.
Supongamos tambin que el proceso es de tipo "batch". Si en la composicin del medio utilizamos
glucosa, por ejemplo, difcilmente tendremos un rendimiento normal de -amilasa mientras exista
glucosa en el medio, debido a la influencia negativa de sta, ya que la misma acta como represor
catablico de la biosntesis de la enzima. Este es un ejemplo negativo de un efector externo
(glucosa) que no permite la expresin del gen de la cepa.
No solamente la glucosa tiene este efecto, sino en general, cualquier otra fuente de carbono que sea
de consumo rpido.
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Si en cambio se opera el reactor como "batch" alimentado, con alimentacin programada de
glucosa, la influencia negativa de ese efector externo desaparece, porque su concentracin se
mantiene en lmites muy bajos.
Otro efector externo de naturaleza qumica que inhibe la biosntesis de otros productos como
muchos antibiticos es el anin fosfato. Por eso la produccin industrial de esos compuestos debe
hacerse de manera tal que existan concentraciones limitantes de fosfato inorgnico. Si ste est en
concentraciones de 0.3 a 300 mM generalmente se producen crecimientos celulares altos pero
concentraciones superiores a 10 mM suprimen la sntesis de muchos antibiticos.
Es importante tener en cuenta que todas las etapas de un proceso de fermentacin deben estar
ntimamente ligadas e integradas ya que es indispensable que el proceso sea optimizado
globalmente. Cada etapa debe considerar la importancia e influencia de los procesos y operaciones
anteriores y tambin de los siguientes para poder cumplir con ese concepto de integracin. La
calidad de una cepa de microorganismo debe estar supeditada a su real capacidad de produccin en
el fermentador. Pero adems es necesario que esa cepa, altamente productora, no produzca, por
ejemplo, dificultades en la etapa de separacin y purificacin como es el caso de cepas de
Penicillium chrysogenum que no pueden utilizarse porque producen pigmentos que encarecen las
etapas de purificacin. Lo mismo sucede con el uso de medios, basados en subproductos como el
suero de queso, que pueden dar buenos rendimientos de un producto pero que representan un
inconveniente en la etapa de purificacin.
Adems, el reactor y las condiciones de operacin deben ser tales que aseguren la productividad
mxima del proceso y la calidad del producto, que en algunos casos depende de las condiciones de
operacin empleadas como sucede con algunos preparados enzimticos cuya composicin es
regulada segn como se opere en la etapa de la fermentacin y en la correspondiente a la separacin
y purificacin.
5.4.1 Seleccin
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Debe -ser de fcil conservacin por largos perodos de tiempo, sin prdida de sus
caractersticas particulares.
Debera llevar a cabo el proceso fermentativo completo en un tiempo corto.
Si el objetivo del proceso es un producto, ste debera ser de alto rendimiento y de fcil
extraccin del medio de cultivo.
Los microorganismos que se utilizan en un proceso, pueden ser obtenidos por aislamiento a partir
de fuentes naturales o de una coleccin de cultivos. A nivel industrial, en general, cada firma posee
su propia coleccin de organismos, muchos de los cuales han sido mejorados a travs de tcnicas
clsicas de mutacin o de ingeniera gentica. Sin embargo, estas cepas slo son empleadas por la
industria que las posee, debido al gran valor comercial de las mismas. En algunos casos se dispone
de organismos modificados genticamente para llevar a cabo reacciones especficas de biosntesis,
degradacin o biocatlisis, los cuales estn protegidos por patentes. Esto significa que un gran
porcentaje de organismos aislados o modificados no son disponibles para uso general en
laboratorios.
"American Type Culture Collection", USA, la cual mantiene bacterias, levaduras, algas,
actinomycetes, mohos, protozoos, virus y lneas celulares;
"Colletion Nationale de Cultures de Microorganismes" del Institut Pasteur, Francia;
"Northern Regional Research Laboratory" (NRRL), de Peoria, USA,
"National Collection of Type Cultures", Londres, Inglaterra.
Si el organismo a utilizar es aislado de fuentes naturales como agua, suelo, plantas y desechos, la
eleccin del material de partida puede hacerse teniendo en cuenta que el organismo exprese en ese
ambiente las propiedades que son de inters. Por ejemplo, en suelos tratados con pesticidas se
podran encontrar organismos adaptados a la degradacin de estos productos qumicos; o en larvas
de insectos muertos agentes causales de la muerte.
Elegida la fuente de aislamiento, las posibilidades de xito dependen de la tcnica elegida para el
mismo; en este caso las alternativas son:
a) aislamiento directo
b) enriquecimiento del cultivo con o sin pretratamiento de la muestra.
Una vez efectuado el muestreo y seleccin (screening) para el aislamiento de una cepa de inters, la
misma deber ser caracterizada. En este procedimiento se debe tener en cuenta que la composicin
qumica del material a partir del cual se va a realizar el aislamiento comienza a variar a partir del
momento en que es tomada la muestra, por lo tanto sta se debe procesar rpidamente, tratando de
evitar alteraciones que afecten a la poblacin de inters.
En este caso es deseable que el medio que se utiliza para el aislamiento permita la mxima
expresin del material gentico del organismo. Si se busca por ejemplo un organismo con accin
antimicrobiana, se puede crecer al potencial productor, en una caja de petri en presencia del o los
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organismos contra los cuales se requiere la accin antimicrobiana, observndose la produccin del
inhibidor por las zonas de inhibicin de crecimiento.
Esta tcnica consiste en incrementar en una poblacin mixta el nmero de organismos de inters en
relacin al resto. De esta forma se busca favorecer el crecimiento de un tipo dado de
microorganismos mediante condiciones de cultivo adecuadas al mismo, o de condiciones
inapropiadas para el desarrollo de los otros. Esto se logra mediante el empleo de sustratos
especficos o ciertos inhibidores. Para mantener la fuerza selectiva del medio, el cual se modifica
por el crecimiento del organismo buscado, se realizan subcultivos peridicos en medio fresco. Esto
lleva a que el organismo de inters sea el dominante de la poblacin, lo cual facilita su posterior
aislamiento en medio slido. Se debe considerar en este caso el efecto del medio sobre la velocidad
especfica de crecimiento ().
La seleccin de un organismo por este procedimiento depende de su valor de comparado con los
de los otros organismos. Evidentemente el dominante de la poblacin ser el que posea el mayor
valor de para las condiciones de cultivo empleadas. Sin embargo no necesariamente ser ms til
un organismo de ms alto; puede ser deseable uno con mayor afinidad por el sustrato. El
problema de seleccin puede ser superado empleando el sistema de cultivo continuo, donde la
fuerza de seleccin se mantiene a un nivel constante y el organismo dominante ser seleccionado
por su afinidad por el sustrato, ms que por su mxima.
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A valores de u=D<z se tiene que A>B y por lo tanto, el organismo A podr ser seleccionado a
pesar de que mA<mB (z=valor de u a partir del cual B>A).
Los objetivos de la conservacin de los cultivos se podran resumir en los siguientes aspectos:
a) Preservar la pureza gentica del cultivo sin prdida de ninguna de sus propiedades
bioqumicas;
b) Preservar los niveles de su productividad inicial;
c) Lograr que el cultivo pueda ser transportado y manejado con facilidad. Esto ltimo puede ser
un factor esencial en la seleccin de un mtodo de preservacin.
En todo trabajo de Microbiologa se deben conocer las caractersticas de la poblacin con la cual se
va a trabajar (propiedades morfolgicas y bioqumicas). En este sentido, tanto en la conservacin
como en el desarrollo del cultivo, ya sea el que suministra o el que recibe la cepa, deberan usar las
mismas tcnicas metodolgicas. Tanto para el mantenimiento, preparacin y propagacin de
inculos se deben usar mtodos reproducibles que no produzcan variaciones o prdidas de las
caractersticas de la cepa empleada.
No hay mtodos de mantenimiento en procesos industriales que sean comunes a todas las industrias,
emplendose en algunos casos mtodos especficos secretos.
En general los cultivos no son estudiados en detalle debido a la casi imposibilidad de determinar en
cada etapa si ha habido o no alteracin gentica. En la mayora de las situaciones solamente se
pueden notar cambios mensurables u observables tales como pigmentacin, morfologa, reacciones
fermentativas, propiedades microscpicas, etc. El anlisis de estos parmetros junto con la
determinacin cuantitativa del recuento de colonias antes y despus del proceso de mantenimiento
brindan la informacin necesaria para la correcta evaluacin de la tcnica de conservacin a elegir.
Subcultivos
Es un mtodo comn de conservacin, que consiste en el repique peridico del cultivo en un medio
nutritivo fresco. El intervalo de transferencia vara con el microorganismo, debiendo considerarse el
medio adecuado para cada especie. Una vez desarrollados los cultivos se mantienen a 4 C durante
lapsos que oscilan entre 15 das y 2 meses. Los inconvenientes que presenta son varios:
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a) incremento de la posibilidad de mutacin con cada transferencia, con prdida de las
caractersticas del organismo
b) riesgo de contaminacin
c) alteraciones en el medio de cultivo, durante la estada en fro, en la cual se produce una
desecacin gradual del mismo.
Es una tcnica simple y efectiva para prolongar la conservacin de muchos organismos y consiste
en cubrir completamente el cultivo despus de su desarrollo en medio slido, con una capa de aceite
mineral o vaselina estril. Los cultivos en esta forma se pueden conservar a temperatura ambiente o
an mejor en heladera por perodos de varios aos. Algunos autores sostienen que en estas
condiciones los microorganismos pueden continuar reproducindose, con posibilidades de aparicin
de mutantes; sin embargo se acepta que estas alteraciones no se observan hasta los tres aos de
mantenimiento.
Congelacin
Debido a que la actividad metablica de una clula se reduce considerable- mente por
mantenimiento a muy baja temperatura, la congelacin es una tcnica de eleccin, ya sea para cortos
o largos perodos de tiempo. A esto ha contribuido tambin la mayor disponibilidad de nitrgeno
lquido (-196 C) y el mejoramiento de los equipos de refrigeracin. La tcnica involucra el
crecimiento del cultivo hasta la fase estacionaria, ya que en general en esta etapa las clulas son
ms resistentes a los daos por congelacin y descongelacin, que las de fase exponencial. Tambin
es aconsejable utilizar una densidad celular elevada en la congelacin, debido a que, cuando parte de
las clulas se lisan se liberaran sustancias crioprotectoras que aumentaran el porcentaje de clulas
sobrevivientes.
Las clulas a congelar pueden ser resuspendidas directamente en un agente crioprotector o se puede
agregar el mismo como aditivo al medio de cultivo. El ms empleado es glicerol al 10%, aunque
otros agentes como dimetilsulfxido, glucosa, dextranos, sacarosa, suero de conejo, lactosa y
extracto de malta, han si- do tambin empleados.
La suspensin celular es colocada en ampollas (vidrio o plstico) y sellada antes de colocarla bajo
nitrgeno lquido. Uno de los problemas de esta tcnica se refiere a la velocidad de congelacin.
Muchos estudios son coincidentes en sealar que una velocidad de congelacin lenta y una rpida
descongelacin rinden los mayores nmeros de clulas viables. Se encontr que dependiendo de la
naturaleza de las clulas, existe una velocidad de congelacin ptima en cada caso para obtener una
mxima sobrevida. Como criterio general se puede decir que, lo ms ampliamente usado es el
enfriamiento a 1C min -1 (ya que una rpida congelacin causa ruptura de membranas) hasta -20 C
y luego un rpido descenso.
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En caso de nitrgeno lquido, la conservacin podra prolongarse por aos, asegurando una buena
provisin del mismo y disponiendo de equipos con sistemas de alarma en caso de fluctuaciones de
temperatura.
Cultivos en tierra
La tierra estril puede ser inoculada con un cultivo e incubada varios das para inducir esporulacin
de bacilos aerobios y anaerobios. Una vez que la misma se manifiesta, la tierra es secada
(desecador) y el cultivo mantenido de esta forma en una atmsfera seca o en refrigerador. El mtodo
ha sido utilizado ampliamente con hongos y actinomycetes, los cuales han sido mantenidos en estas
condiciones varios aos. Tambin se puede utilizar tierra para la conservacin directa de
suspensiones de esporos.
Preservacin en celulosa
Liofilizacin
La tcnica consiste en partir de un cultivo de fase estacionaria (donde las clulas son usualmente
ms resistentes) resuspendiendo las clulas con un medio crioprotector, en el cual se obtenga
una alta densidad celular. Unas pocas gotas de suspensin celular son transferidas a una
ampolla, la cual es congelada a aproximadamente -40 C y deshidratada mediante una
sublimacin en vaco. Este debe ser mantenido en 5-10 m mediante una bomba. El secado
contina hasta llegar a valores de humedad del orden del 1%; luego, la ampolla es sellada bajo
vaco. Se debe evitar la formacin de radicales libres que se producen por exposicin de las clulas
al oxgeno, ya que estn asociados con prdida de viabilidad; de all la importancia de mantener
el vaco.
Normalmente la liofilizacin produce daos en las clulas, siendo los mismos en algunos casos
reversibles, por lo cual stas necesitan un tiempo de recuperacin que es variable en funcin del
tipo de dao producido.
Se encuentra con frecuencia que el crecimiento despus de la rehidratacin tiene una fase de
retardo extendida. Se puede reducir esta fase si se emplea para el crecimiento un medio de igual
composicin que el que da ptimo desarrollo pero disminuyendo su concentracin original entre un
25 y un 50%.
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Tema 6 MEDIOS DE FERMENTACION
6.1 INTRODUCCION
Como ya se explic, los componentes de los medios constituyen los efectores externos de
naturaleza qumica que desempean un rol esencial en los procesos ya que deben cumplir con
los requerimientos del crecimiento y de formacin de productos y adems suministrar energa
para la sntesis de metabolitos y para el mantenimiento celular.
No obstante que los microorganismos varan considerablemente respecto de los nutrientes que
pueden necesitar es posible efectuar la distincin de las siguientes categoras de componentes:
Los medios pueden clasificarse, considerando la naturaleza qumica de los componentes, en:
En el estudio de los medios de cultivo es conveniente considerar en primer lugar el diseo para
tratar a continuacin la formulacin y optimizacin de los mismos.
6.2 DISEO
Otros aspectos que son tambin importantes se refieren a todos los procesos y operaciones
previos y posteriores a la etapa de fermentacin y al conocimiento de los mecanismos
bioqumicos que regulan la formacin de algunos productos, como es el caso de la importancia
del anin P04 ,. Trataremos especialmente de los tres primeros.
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6.2.1 Requerimientos nutricionales
Los requerimientos nutricionales estn determinados por el tipo de metabolismo celular, ya sea
autotrfico, que corresponde a los microorganismos que obtienen el carbono del C02 como las
algas y algunas bacterias, y los heterotrficos que necesitan compuestos orgnicos como fuente de
carbono. Otro factor esencial est determinado por las condiciones del cultivo, si es aerobio o
anaerobio. El 0 2 es uno de los oxidantes ms comunes en el metabolsmo energtico. En la
ausencia del 02, el N03 o S04 son utilizados como aceptores de electrones por algunas bacterias. Las
bacterias metanognicas son auxtrofos anaerobios que utilizan H 2 para reducir el C02 a CH4 para
obtener energa. Otros protistas obtienen su energa, en condiciones anaerobias por reaccin de
xido-reduccin realizadas sobre compuestos orgnicos. Las fuentes de carbono cumplen
tambin el rol de ser fuente de energa.
Otro requerimiento nutricional est constituido por las fuentes de nitrgeno que pueden ser de
naturaleza inorgnica u orgnica. El nitrgeno es utilizado para la biosntesis de protenas, cidos
nucleicos y polmeros de la pared celular. Para la sntesis de protena se requieren en general L-
aminocidos, aunque tambin son necesarios algunos aminocidos de la serie D como D-alanina y
D-asprtico para su incorporacin a la pared de las clulas. En algunos casos se requieren
tambin pptidos de histidina.
Los requerimientos de K y Mg son tambin esenciales. Una parte importante del primero est
unida al RNA de manera que los requerimientos de K aumentan con los factores que influyen en
el aumento del RNA de las clulas, como la velocidad de crecimiento. El in K acta como
coenzima y probablemente acta como catin en la estructura aninica de varios componentes
celulares. El in Mg es esencial para la estabilidad de los ribosomas y acta como cofactor en
numerosas reacciones del metabolismo. Tanto el K como el Mg se incorporan a los medios en
forma de sales como fosfato y sulfato.
a. Los que son frecuentemente esenciales para el crecimiento como Ca, Mn, Fe, Co,
Cu y Zn y
b. los que son raramente esenciales como B, Na, Al, Si, Cl, V, Cr, Ni, As, Se, Mo,
Sn, e I.
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Los requerimientos de factores de crecimiento comprenden ciertos aminocidos y vitaminas del
grupo B como tiamina, riboflavina, cido pantottico, niacina, etc., que representan para muchas
bacterias y levaduras factores esenciales en los medios sin los cuales no se produce crecimiento
celular. La mayor parte de las vitaminas son constituyentes de coenzimas. Otros factores de
crecimiento son las purinas, poliaminas, putrescinas, etc.
En algunos procesos existe la necesidad de efectuar otros agregados, a parte de los nutrientes
requeridos por los microorganismos y que representan los requerimientos especficos del
proceso considerado.
Un ejemplo es el caso de los precursores que constituye la base de una molcula que debe ser
sintetizada por el microorganismo, como el cido fenil-actico para la penicilina. Otro ejemplo
es el agregado de ciclo dextrinas en procesos de produccin de Bordetella pertussis que puede
actuar como complejante de inhibidores de crecimiento celular. El agregado de cloruros o
bromuros en el caso de algunos antibiticos como cloro y bromotetraciclinas, tetraciclinas
producidas por el Streptomyces aureofaciens, responde tambin a requerimientos especficos
para inhibir la sntesis de productos no deseados, como ocurre tambin con el agregado de
barbitricos en la produccin de estreptomicina por S. griseus.
El diseo correcto tiene que ver con las caractersticas bioqumicas propias y evolucin de los
parmetros de cada proceso. Por ejemplo, un proceso caracterizado por un descenso continuo de
pH, debido al uso de una sal de amonio como fuente de nitrgeno, obliga a considerar en su
diseo algn agregado que no corresponda a una exigencia nutricional, como es el caso del
control de pH del mismo. Este puede efectuarse por agregados al medio de agentes "buffer"
como mezclas de fosfatos o de carbonato de calcio o como ms generalmente se hace, con
agregados peridicos de soluciones alcalinas que pueden efectuarse en forma ms conveniente
mediante un control automtico de pH. El diseo de un medio especfico para la produccin de
cido ctrico debe considerar la influencia negativa que para el proceso tiene un exceso de hierro
en su composicin; por lo tanto dicho medio debe disearse de manera tal que su preparacin (a
partir de diversas materias primas) considere una eliminacin total del hierro y posterior
agregado del mismo en cantidades controladas.
Aparte de su presencia en el medio de cultivo, los nutrientes deben estar disponibles para ser
usados por la clula.
Por lo tanto, con el objeto de controlar su concentracin y prevenir la precipitacin de los iones
metlicos, es necesario o esencial quelar el ion mediante algn agente quelante agregado, como el
EDTA (Acido Etilendiaminotetraactico).
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En medios complejos de uso industrial la situacin es an ms complicada ya que existe una gran
variedad de sustancias orgnicas, las cuales pueden quelar, secuestrar o absorber iones metlicos
reduciendo la concentracin inica disponible. Entre dichos compuestos podemos citar:
aminocidos, protenas, cidos orgnicos, polifenoles, polifosfatos y materiales coloidales.
En general se puede decir que todo material insoluble presente en el medio de cultivo va a
tener una determinada capacidad de unin a elementos metlicos disminuyendo su concentracin
efectiva, como ocurre tambin con los aminocidos y protenas que tienen los grupos reactivos
R-COO -, RHN-, RS-, RO , que son los ms importantes. La dinmica de formacin del
complejo est determina- da por la constante de equilibrio de formacin del complejo metal-
ligando, y por la velocidad a la cual el equilibrio es obtenido. La constante de equilibrio para la
formacin del complejo del in metlico (M) con el ligando (L) se expresa de la siguiente forma:
Fe+3 >Pb2+ > Cu2+ > Ni 2+ > Co3 + > Zn 2+ > Co 2+ > Cd2+ > Fe 2+ > Mn 2+ > Mg> Ca2+
2+ 2+ > Na+ > K+ > y de la cual se puede deducir, por ejemplo, que el ion Cu2+ estar
>Sr > Ba
fundamentalmente como complejo mientras que Ca 2+ Na+ y K+ estarn en forma de iones
metlicos libres.
Por otro lado la velocidad a la cual se alcanza el equilibrio tiene tambin una serie de orden
decreciente de velocidades de acuerdo al ion: Sr 2+ > Ca2+ > Zn 2+> Mn2+ > Fe2+ > Co2+ >
Mg2+ > Ni 2+.. De ambas consideraciones surge por ejemplo que cuando se alcanza el equilibrio
el ion Ca 2+ estar casi siempre libre para ser utilizado y si est complejado se har rpidamente
disponible, en cambio el Mg2+ estar generalmente libre pero si est complejado se har
disponible muy lentamente. En la misma forma se puede deducir que el Co 2+ estar
fundamentalmente en forma complejada siendo disponible adems a muy baja velocidad. Por esa
razn ese elemento es potencialmente limitante.
Las fuentes de nitrgeno de naturaleza inorgnica ms comunes son el amonaco o las sales
de amonio.
1. Hidrolizados de protenas (Peptonas) que son obtenidas por hidrlisis cida o enzimtica
de distintas fuentes proteicas como carne de diferentes rganos y animales, pescado,
casena, gelatina, harina de soja, algodn, girasol, etc. Mediante ajuste de la relacin
enzima-sustrato y variando tiempo de hidrlisis es posible variar el tamao de la cadena
de polipptidos. Aparte de su funcin como fuente nitrogenada, las peptonas aportan
algunas vitaminas y sales inorgnicas como fosfatos y suministran tambin algunos
micronutrientes como Ca, Zn, Fe y Cu.
2. Extracto de carne, que se obtiene por extraccin acuosa y concentracin posterior
variando su tipo de acuerdo a la calidad de carne, tiempo de extraccin y temperatura de
la misma.
3. Extracto de levadura, que es disponible en forma de pasta o polvo, y puede ser obtenida
mediante autlisis o plasmlisis de la levadura, es bsicamente una mezcla de
aminocidos, pptidos, vitaminas solubles en H2O y carbohidratos.
4. Extracto de malta, que es el extractosoluble en H2O de la malta de la cebada
5. "Cornsteep", el agua de maceracin de la industria del maz tiene mucha importancia por
su utilizacin como componente esencial de los medios para la produccin de varios
antibiticos y enzimas.
Es muy importante tambin la correcta eleccin de una determinada fuente cuando se presentan
varias alternativas posibles. En este sentido deben considerarse los costos, la disponibilidad y el
problema de impurezas que puede acompaar a las distintas materias primas utilizadas.
6.3 FORMULACIN
La formulacin tiene que ver con los aspectos cuantitativos de los medios, es decir debe
establecer las concentraciones de cada componente a ser utilizadas.
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Una primera aproximacin con respecto a las cantidades a utilizar de las diversas fuentes lo da el
conocimiento de la composicin de biomasa del microorganismo a ser empleado. Una
composicin elemental y tpica de la biomasa es (en % de peso seco): Carbono, 46-48;
Nitrgeno, 7-12; Fsforo, 1-3; Azufre, 0.5-1.0; Mg, 0.5-1%.
Es decir, que si queremos formular un medio para producir una determinada cantidad de
biomasa debemos promover las distintas fuentes que aseguren como mnimo las cantidades de
elementos que deben ser suministrados.
La composicin de un medio mnimo basado en este principio, que adems tiene en cuenta los
requerimientos de las fuentes de energa, que ha sido calculada por Pirt para la produccin de
Klebsiella aerogenes en concentracin de 10 g/l se ilustra en la siguiente tabla
Sacarosa
En la misma forma se pueden establecer balances de materia para otras reacciones que incluyan
productos y deducir de las mismas las cantidades de biomasa y productos que se pueden obtener
a partir de una determinada cantidad de fuentes de carbono y de nitrgeno. Las otras fuentes de
elementos menores y factores no son necesarias de incluir en las ecuaciones.
Aplicando este criterio podemos establecer entonces que para obtener una determinada
concentracin de biomasa, por ejemplo 30 g/l debemos formular el medio como mnimo con 60 g/l
de fuentes de carbono asimilable, que es en el caso anterior la sacarosa. Con respecto a las
fuentes de nitrgeno, sta debe estar en concentracin tal como para satisfacer la ecuacin
anterior, que es 0.61 moles de NH 3 o sea 10.37 g de amonaco, lo que representa 8.54 g de N2 ..
Ya tenemos por lo tanto la cantidad de la otra fuente fundamental a ser agregada. Del
conocimiento de la composicin centesimal de otros componentes menores podemos establecer
as las cantidades a agregar.
Ahora bien, sabemos por otra parte que la levadura necesita para crecer algunas vitaminas del
grupo B como la biotina, tiamina, cido pantotnico, etc. Esas vitaminas deben estar por lo
tanto presentes en el medio. Como el proceso de produccin de levadura es un proceso industrial
que interesa desarrollar con costos de produccin mnimos, es conveniente estudiar las fuentes de
carbono, nitrgeno y de vitaminas y minerales ms econmicos y disponibles que podamos
encontrar. Surge as la eleccin lgica de las melazas de caa de azcar o de remolacha que
renen la mayor parte de las condiciones. Del conocimiento del efecto Crabtree ya comentado y
para evitar la formacin de alcohol y maximizar la produccin de biomasa surge la necesidad de
implementar una alimentacin programada empleando melaza como sustrato limitante, de lo cual
resulta la eleccin de un sistema de "batch" alimentado para la produccin. Mayores detalles de
este proceso se darn en el captulo 8 relacionado con produccin de levadura.
6.4 OPTIMIZACIN
Pueden ocurrir situaciones en las cuales sea imperativo la optimizacin de los medios de cultivo.
Entre ellas podemos mencionar las siguientes:
6.5 ESTERILIZACION
Es conveniente, al tratar este tema, dar una definicin clara del trmino y de otros relacionados, ya
que a veces suelen producirse confusiones.
Esterilizacin significa la eliminacin de toda forma de vida de un medio o material, lo que se lleva
a cabo generalmente por medios fsicos, por ejemplo, filtracin, o por muerte de los organismos por
calor, productos qumicos u otra va.
Esta definicin excluye por lo tanto cualquier tcnica que resulte solamente en un dao a los
microorganismos o atenuacin de la actividad de cualquier tipo.
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La palabra desinfeccin se aplica a la remocin o destruccin por cualquier va de organismos
vivos que pueden causar dao particular o infeccin. No significa por lo tanto la destruccin de
todos los microorganismos, sino solamente de aquellos que pueden producir un resultado no
deseado.
Los mtodos de esterilizacin pueden ser de 3 tipos: a) por destruccin total de microorganismos; b)
Por muerte o inactivacin; y c) Por eliminacin con medio fsicos.
Por destruccin total se entiende un proceso muy violento, que casi siempre implica
calentamiento apreciable del material, como ocurre con la aplicacin de una llama, que es lo que
hacemos en el laboratorio cuando flameamos un aza de platino o las bocas de tubo de ensayo o
erlenmeyers. Otra manera de destruir contaminantes es con el uso de poderosos agentes
oxidantes. Por supuesto sta metodologa, aunque es efectiva, est muy restringida en su empleo.
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La eliminacin fsica est restringida a la esterilizacin de gases lquidos, y es
fundamentalmente llevada a cabo por filtracin mediante filtros absolutos o filtros fibrosos.
Los filtros absolutos son de materiales cermicos, de vidrio o de metal con poros tan
pequeos que la penetracin de los microorganismos no es posible.
Los filtros fibrosos no son absolutos y el material filtrante puede ser lana de vidrio,
amianto y esteres de celulosa, siendo las fibras de un dimetro variable de 0.5 a 15
micrones.
La cintica de la esterilizacin por calor hmedo, que es la nica que consideraremos en sta
monografa por su aplicacin a la esterilizacin de medios de fermentacin, est caracterizada
bastante aproximadamente por una reaccin cintica de primer orden.
(1)
N/N o es la fraccin de organismos viables que sobreviven despus del tratamiento por calor
durante el tiempo t y K = constante de velocidad de destruccin, que depende de la temperatura
segn la clsica ecuacin de Arrhenius:
Donde:
A = constante
E = energa de activacin
Si se grfica el ln k en funcin de 1/T se obtendr una lnea recta, siendo la inclinacin igual
a -E/R y la interseccin de la recta con la ordenada, el valor de la constante de Arrhenius.
La ecuacin de velocidad de muerte necesita una aclaracin, ya que la misma no admite una
disminucin del nmero de organismos a cero, porque si N es cero,
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t debera ser infinito. Para resolver este problema supongamos que N = 0.1 y calculemos el
valor correspondiente de t. No podemos decir que despus de ese tiempo sobrevivir una
dcima parte de un microorganismo, pero si podemos decir que habr slo una probabilidad
de 1 en 10 de que sobreviva un microorganismo. Ya veremos que por razones de seguridad
podemos fijar el valor de N = 0.001 o sea fijar una probabilidad de 1 en 1000 de
sobrevivencia.
Durante la primera y ltima etapa ocurre parte de la destruccin trmica de organismos presentes
en el medio debido a que se alcanza temperatura elevada sobre todo en la ltima parte de la curva
AB y la primera parte de la curva CD. Se considera que la temperatura a partir de la cual se
produce destruccin de esporos es 100 C.
Por lo tanto tendremos eliminacin de esporos de 100 a 120 C durante la etapa de calentamiento y
de 120 a 100 C durante la correspondiente al enfriamiento. Los tiempos de calentamiento y
enfriamiento varan de acuerdo al volumen del equipo. En fermentadores industriales de 60.000
1 por ejemplo esos tiempos estn en el orden de 28-30 minutos y 11-14 minutos para los
perodos de calentamiento y enfriamiento respectivamente.
En la prctica de la esterilizacin es necesario tener presente que la calidad nutriente del medio
debe ser preservada todo lo posible, razn por la cual, es imprescindible disear un ciclo de
esterilizacin lo ms efectivo posible pero al mismo tiempo lo ms corto posible. Podremos definir
un trmino nabla (V) que representa la magnitud de la disminucin del nmero de organismos
viables de manera que:
Y por tanto
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Sin embargo, como ya dijimos, parte de la destruccin ocurre en la etapa de calentamiento y otra
parte en la de enfriamiento, de manera tal que:
Debe tenerse en cuenta que estas consideraciones son vlidas para el clculo del tiempo de
esterilizacin mnimo, a 120 C, en fermentadores industriales del volumen considerado. En el
caso del laboratorio cuando utilizamos un autoclave y deseamos esterilizar distintos recipientes
con volmenes diversos de medio, el tiempo de calentamiento y de enfriamiento no son
generalmente considerados, salvo en el caso de equipos que tengan un perodo de calentamiento
y de enfriamiento prolongado, los que por otra parte no son recomendados para su uso en el
laboratorio. Lo que es importante en este caso es el tipo de recipiente, su geometra y el volumen
de medio a esterilizar.
Erlenmeyers de 2000 ml requieren de 30-35 minutos mientras que si son de 125 ml el tiempo es
de 12-14 minutos. En cambio un frasco prex cuadrado de 1000 ml requiere 30-35 minutos y una
botella de suero de 9000 ml 50-55 minutos. Estos tiempos aseguran la eliminacin de esporos
bacterianos de las especies ms resistentes.
Como ya dijimos anteriormente, los medios de fermentacin utilizados en la industria son casi
siempre complejos y a menudo con slidos en suspensin, de manera tal que los cambios que se
producen durante la esterilizacin pueden ser importantes. A veces puede haber modificaciones
beneficiosas o perjudiciales de- pendiendo del tiempo de esterilizacin.
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Existen casos en los cuales si se prolonga la esterilizacin 50 a 60 minutos se producen prdidas
de rendimiento que llegan hasta el 65% con respecto al medio normal. En ciertos casos cuando el
tiempo es solamente de 15-20 minutos se puede producir un efecto beneficioso.
La naturaleza de las interacciones que tienen lugar entre los componentes de un medio, durante la
esterilizacin por calor, depender no solamente de la naturaleza de los componentes sino tambin
de la temperatura, duracin del calentamiento, pH del medio, y de la agitacin. Un ejemplo tpico
de interaccin es la reaccin de Maillard que tiene lugar entre los grupos carbonilos de los azcares
con los grupos amino de protenas, aminocidos, etc. Se forman as productos de condensacin con
lo cual se inactivan significativas cantidades de carbohidratos y nitrgeno amnico. Por ese motivo
es necesario que los carbohidratos se esterilicen por separado de los compuestos nitrogenados
orgnicos.
Los aminocidos y factores de crecimiento son muy lbiles al calor. Entre los aminocidos, el
triptfano, glutamina, asparagina, y entre las vitaminas hidrosolubles, la tiamina, riboflavina y
piridoxina son las ms susceptibles de sufrir des composicin. En todos estos casos es aconsejable
disolverlas separadamente en pequeos volmenes de H2O y luego esterilizarlas por filtracin.
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La figura muestra que a medida que la temperatura aumenta, el valor de k para la reaccin con baja
E (curva A) aumenta ms lentamente que en el otro caso. Esto significa que un aumento de la
temperatura acelera la destruccin de esporos ms que la degradacin de nutrientes. Recordando la
ecuacin anterior:
Vemos que el tiempo requerido para la destruccin de esporos decrece en proporcin al aumento de
k. Por lo tanto si se emplea alta temperatura para la esterilizacin se requiere un tiempo menor, por
lo cual se concluye que la esterilizacin llamada de alta temperatura-corto tiempo favorece la
conservacin de la calidad nutriente al mismo tiempo que produce la destruccin efectiva de los
esporos.
Es necesario aclarar que el uso de alta temperatura con tiempos cortos en escala grande implica
necesariamente el empleo de un sistema de calentamiento y enfriamiento continuo en lugar de
proceso de esterilizacin en batch.
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TEMA 7 ESTEQUIOMETRIA DEL CRECIMIENTO MICROBIANO Y FORMACION
DE PRODUCTOS
Teniendo en cuenta nicamente aquellos compuestos del medio de cultivo que se encuentran en
mayor cantidad y se consumen en forma significativa, el crecimiento aerobio de las clulas puede
describirse en base al denominado modelo de caja negra. En este modelo se considera que la
clula es un compartimiento abierto que recibe un flujo de FCE, uno de fuente de nitrgeno y uno de
O2 y del cual salen flujos de biomasa, CO2, H2O, algn producto (si lo hubiera) y energa (como
calor). En este modelo no se hace ninguna suposicin sobre el metabolismo celular. En la Figura 1.1
se observa un esquema del modelo utilizado.
Figura 1.1: Esquema del crecimiento celular segn el modelo de caja negra.
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En base a este modelo, el crecimiento aerobio de las clulas puede describirse mediante la siguiente
ecuacin:
Esta ecuacin representa un punto de vista macroscpico del metabolismo y considera nicamente
aquellos componentes que presentan un intercambio neto con el ambiente que los rodea. La
ecuacin no incluye compuestos como el ATP, el NADH que integran el metabolismo y que sufren
cambios cclicos en las clulas pero que no sufren cambios netos con el ambiente. Tampoco se
incluyen compuestos como las vitaminas y minerales tomados durante el metabolismo, estos
factores de crecimiento se consumen generalmente en tan pequeas cantidades que su contribucin a
la estequiometria y a la energa de la reaccin es despreciable.
Para formular la ecuacin de la reaccin de crecimiento y sntesis del producto debemos conocer la
frmula molecular para describir la biomasa. Se puede considerar que el 90 al 95 % de la biomasa
est constituida por cuatro elementos mayoritarios (C, H, O, N) y se ha encontrado que esa
composicin elemental se mantiene relativamente constante para un importante nmeros de
microorganismos cultivados bajo condiciones diferentes. De este modo se puede definir un
microorganismo promedio como aquel cuya composicin es (p/p): 46,5 % C, 6,94 % H, 31,0 % O
y 10,85 % N y el contenido restante (aproximadamente un 5%) est representado por sales.
Teniendo en cuenta esta composicin media se puede escribir la frmula molecular de la siguiente
manera: C3,87 H 6,94 O 1,93 N 0,775. Esta frmula se puede expresar en base a un tomo de carbono y
obtener as la denominada frmula mnima de un microorganismo CH 1,79 O 0,5 N 0,2, la
cual representa el 95 % p/p de la biomasa (no incluye el 5 % de sales) y a partir de ella se define un
c-mol de biomasa como la cantidad de biomasa que contiene 1 tomo gramo de C. El peso
molecular de un c-mol de biomasa ser:
En la tabla se presentan las formulas mnimas de varias especies en base a los cuatro elementos
mayoritarios
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As se puede definir un c-mol de cualquier sustancia, la cul es la cantidad de esa sustancia (g) que
contiene 1 tomo de carbono (12 g de C).
Ejemplo: Glucosa:
a: Representa los moles de la fuente de nitrgeno consumida por cada c-mol de FCE consumida.
Yx/s: representa los c-moles de biomasa formada por cada c-mol de FCE consumida.
q: Kcal/c-mol de FCE
Para calcular los coeficientes estequiomtricos de la ecuacin de crecimiento se deben medir todas
las variables del cultivo, biomasa, FCE, velocidad de consumo de O2 y de produccin de CO2 y
concentracin de producto (si lo hubiera).
Los coeficientes estequiomtricos Yx/s y Yp/s corresponden al valor del rendimiento de biomasa y
producto (expresado en c-mol), respectivamente. El coeficiente a puede ser calculado de un balance
de nitrgeno.
La cantidad total de O2 consumido y CO2 producido durante el cultivo se calculan como la integral
de las velocidades correspondientes en funcin del tiempo segn:
Midiendo la composicin de los gases a la salida del reactor se pueden calcular las velocidades de
consumo de O2 y produccin de CO2 por medio de las siguientes ecuaciones que surgen de un
balance en fase gaseosa
Siendo:
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La relacin entre los moles de CO2 producidos y los moles de oxgeno consumidos se denomina
coeficiente respiratorio (CR) y proporciona informacin sobre el estado metablico de los
microorganismos y se lo emplea para controlar el proceso.
Coeficiente de rendimiento
Se define como la relacin entre producto obtenido y sustrato consumido. El mtodo usual para
medir los rendimientos es medir la cantidad de biomasa o producto formado y sustrato consumido
en un perodo determinado y calcular a partir de las siguientes ecuaciones los rendimientos:
Estos son los rendimientos experimentales y representan el rendimiento global, que es la cantidad de
biomasa o producto total formado respecto al sustrato total consumido. Es un rendimiento global
porque el sustrato se utiliza para otros fines:
Los rendimientos en biomasa y producto son parmetros de gran importancia pues dan una medida
de la eficacia de conversin del sustrato en biomasa y productos. Un proceso destinado a la
produccin de biomasa tendr como objetivo maximizar Yx/s y minimizar Yp/s. Si lo que interesa
es el producto se tendr el caso inverso.
Para calcular el valor de Yx/s debemos conocer cul es el sustrato limitante. El sustrato limitante
puede ser la FCE, la fuente de nitrgeno. Si el sustrato limitante es la fuente de nitrgeno, s ser la
concentracin de la fuente de nitrgeno (ej. amonio).
Grado de reduccin ()
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El grado de reduccin () se define como el nmero de electrones que se transfieren al oxgeno
cuando se oxida 1 c-mol de un compuesto dado.
Cada molcula de oxgeno capta 4 electrones por lo tanto el nmero de electrones que son
transferidos al oxgeno ser 4.n
=4n
Siendo:
Es decir que grado de reduccin se refiere al nmero de electrones que tiene disponible un
compuesto para transferir al oxgeno durante su combustin completa a CO 2, H2O y compuestos que
contengan nitrgeno.
Para simplificar los clculos se pueden hacer balances elementales y obtener una ecuacin general
que nos permita calcular el grado de reduccin de cualquier compuesto.
Esta ecuacin es muy til ya que permite calcular sin necesidad de plantear la ecuacin de
oxidacin.
La ecuacin 1.6, describe la ecuacin de grado de reduccin para cualquier compuesto que se oxida
a CO2, H2O y NH3. Esta ecuacin de tiene implcito que ni el CO2, H2O y NH3 tienen electrones
disponibles es decir = 0 (no tienen electrones disponibles). Por lo tanto, se debe poner NH3 para
tener en cuenta que este fue el nivel de referencia elegido para el nitrgeno.
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Cabe aclarar que si el compuesto contiene nitrgeno, es necesario especificar cul ser el estado de
oxidacin final de este, es decir elegir el nivel de referencia para el nitrgeno. Podemos poner que el
compuesto se oxida a N2 o nitrato, etc. pero de esta manera se deber utilizar otra ecuacin para el
grado de reduccin.
Es decir que el calor de reaccin por mol de electrones transferidos al oxgeno (q 0= q/) es
relativamente constante para la oxidacin de una amplia variedad de molculas orgnicas (Tabla).
Esto implica que el valor de es una medida de la energa contenida en un compuesto. As un c-mol
de etanol brinda ms energa que un c-mol de glucosa.
Los balances de materia y energa proporcionan una herramienta muy til en los procesos
biolgicos. Cuestiones como: cul es la concentracin de dixido de carbono en la corriente de
salida de un fermentador, cul es la fraccin de sustrato consumido, qu cantidad de reactante se
necesita para producir determinada cantidad de producto, cunto oxgeno debe alimentarse para que
se produzca la fermentacin, cunto calor se produce durante el proceso, etc., pueden contestarse
mediante los balances de materia y energa.
Balances de materia
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Aplicando balance de carbono a esta reaccin se obtiene:
Estos balances obedecen al principio de conservacin de la masa: no puede haber ms carbono del
que 1 c- mol de sustrato puede aportar. Aplicando el balance de nitrgeno se obtiene:
Este balance obedece al principio de conservacin de la energa: los electrones disponibles del
sustrato deben ir obligadamente a los distintos productos.
De los balances de carbono y grado de reduccin surgen aspectos tericos interesantes que tienen
cierta capacidad predictiva, importante desde el punto de vista prctico para la industria.
Para obtener el mximo rendimiento posible para la produccin de biomasa se puede considerar que
no se forma producto ni dixido de carbono por lo que a partir del balance de carbono:
Se obtiene:
Del balance de grado de reduccin se puede considerar que todos los electrones de la FCE van para
la biomasa, es decir:
Surgen as dos rendimientos mximos tericos, uno que surge del balance de carbono y el otro que
surge del balance de grado de reduccin. De los dos rendimientos se usar aquel que sea menor,
segn el valor del grado de reduccin de la FCE (s):
Esta es una idealizacin, para que la reaccin ocurra en forma espontnea segn los principios de la
termodinmica, se necesita disipar energa entonces habr una parte de la FCE que se disipar como
calor. En la prctica se tiene entonces un rendimiento que es el 60 % del mximo terico.
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exotrmicas, ese calor liberado es importante conocer cuando se trabaja a escala mayor para poder
controlar la temperatura
Las reacciones bioqumicas en las clulas no ocurren de forma aislada sino que forman un complejo
entramado de transformaciones metablicas.
Despejando HR
Recordando que el contenido energtico de los compuestos orgnicos est relacionado con el grado
de reduccin mediante la siguiente ecuacin: qi = q0.i sera:
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En el caso de cultivos anaerobios no se puede utilizar la ecuacin 1.15 para calcular el calor de
reaccin (HR). En estos procesos anaerobios se debe realizar el balance de entalpa (ec. 1.12).
En los balances de energa de los fermentadores los efectos energticos que se consideran son: el
calor de reaccin, el calor latente de cambio de fase y el trabajo mecnico.
Se obtiene:
Hp = entalpa de producto.
Hx = entalpa de biomasa
Hs = entalpa de sustrato
Q = representa el cambio total o acumulacin de energa en el sistema.
Ws = representa el trabajo mecnico.
M. hv = calor latente de evaporacin (M= masa del lquido evaporado y hv el calor
latente de evaporacin).
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La evaporacin es el cambio de fase ms probable en la operacin de un fermentador de manera que
si se controla la evaporacin, los efectos del calor latente pueden ignorarse. Para que no exista
acumulacin de energa en el sistema:
Siendo
Por lo tanto la cantidad de calor que debe eliminarse de un fermentador (Q) para mantener las
condiciones ptimas de temperatura ser:
3.Encuentre una expresin general que le permita calcular el grado de reduccin de un compuesto
dado cuando es oxidado a CO2, H2O y NO3H.
4.Se determin la composicin elemental de un hongo resultando los siguientes valores (p/p en base
seca): C= 42,6%, H=7,1 %, O=33,2%, N=8,3%, sales 7,6%.
5.Se har el anlisis de un cultivo de Candida utilis en batch. El medio de cultivo est formado por
glucosa, sulfato de amonio y sales.
6.Calcule el rendimiento mximo terico en biomasa que se puede obtener en un cultivo con las
siguientes fuentes de carbono y energa (FCE).
Acido frmico
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glucosa
7.La levadura Saccharomyces cerevisiae crece anaerbicamente en un medio con glucosa y con SO 4
(NH4)2 con un rendimiento de 0,12 (yx/s). Calcular:
9.Se lleva a cabo un estudio sobre la aptitud de diferentes fuentes de carbono y energa sobre el
crecimiento de un microorganismo de composicin standard. En uno de los requerimientos se
ensayaron en frascos agitados cido oxlico (C 2O4H2) y glucosa (C6H12O6). La concentracin de las
mismas en el medio de cultivo fue de 5 g/l y se utiliz SO 4 (NH4)2 como fuente nitrogenada. Los
frascos se rotularon A y B correspondindole una letra a cada sustancia ensayada. Al final del
experimento se determin la concentracin de biomasa seca, siendo esta de 2,65 g/l en los frascos A
y de 0,595 g/l en los frascos B.
El inculo fue de 0,2 g/l y el sustrato se consumi totalmente en ambos frascos sin poderse detectar
productos en los sobrenadantes de los cultivos.
10.Un microorganismo aerobio de composicin CH1,625 O0,5 N0,125 produce una sustancia extracelular
cuya frmula molecular es C6H4O2N2. Realizando un cultivo batch de este organismo en un medio
de cultivo conteniendo 30 g/l de glucosa y amonio como fuente de nitrgeno, se midieron os
rendimientos en biomasa (Yx/s) y oxgeno (Yx/o) obtenindose valores de 0,170 y 0,307 g/g,
respectivamente:
11. Se desea cultivar una bacteria en glicerol. Considerando composicin standard de la biomasa,
amonio como fuente de nitrgeno y los siguientes requerimientos: P (66g x/gp), Mg (600 gx/gMg), S
(300 gx/gs), K (60gx/gk), Ca (1gx/gCa), disee el medio sobre la base de 5 g/l de glicerol. Las sales de
que se dispone en el laboratorio son: (NH4)2SO4, KH2PO4, KCl, CaCl2.H2O y MgSO4.7H2O.
Considere rendimiento real (0,6 del mximo terico).
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12. Las levaduras Saccharomyces cerevisiae y Zigosaccharomyces mobilis crecen anaerbicamente
en un medio con glucosa, amonio y sales, produciendo etanol. Los rendimientos celulares (yx/s)
obtenidos fueron de 0,14 y 0,06 para Saccharomyces cerevisiae y Zigosaccharomyces mobilis
respectivamente.
Determinar cuntos gramos de etanol producen cada una de las levaduras por gramo de
glucosa (Yp/s).
Cunto representan los valores obtenidos de yx/s respecto al mximo terico.
Cul de las dos levaduras resulta ser ms eficiente para la produccin de etanol?
13.Se sabe que para Micrococcus denitrificans la eficiencia energtica del crecimiento: es de 0,56
para un determinado medio y condiciones de cultivo, y que por cada 1,515 c-moles de sustrato
consume 1 mol de oxgeno.
Calcule:
En la seccin anterior se han planteado las relaciones estequiomtricas que existen en loscultivos
microbianos y cmo a travs de ellas es posible obtener informacin del destino que tiene la FCE.
Es necesario adems, conocer la cintica del crecimiento de las clulas o microorganismos
(biomasa) y la velocidad de formacin de los productos deseados, lo que permitir realizar estudios
posteriores de diseo de biorreactores
Hay una cierta cantidad de sustrato, FN y oxgeno que se consumen para producir biomasa y
productos. Se deber conocer la velocidad con la que se consume sustrato (r s) para producir biomasa
y producto, la velocidad con la que se forma el microorganismo (r x), la velocidad con la que se
consume oxgeno (ro2), etc.
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Las velocidades especficas brindan informacin acerca de cul es la actividad metablica de los
microorganismos (o de la biomasa) durante el cultivo. La velocidad especfica es la velocidad
alcanzada por unidad de catalizador y no depende de la cantidad de clulas o catalizador presente.
Es frecuente que las velocidades especficas varen durante el cultivo y es muy comn que por
ejemplo el valor de al principio del cultivo difiera del que se encuentra en estadios posteriores. Lo
mismo vale para qs, qo2, etc.
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El modelo cintico mas difundido que relaciona la velocidad especfica de crecimiento microbiano
() y la concentracin de un nutriente que condiciona el crecimiento, denominado sustrato limitante
(S), es la ecuacin de Monod. El sustrato limitante del crecimiento (S) es aquel componente del
medio que primero se agota, puede ser la FCE, la FN, el oxgeno u otro oxidante como los nitratos.
La ecuacin de Monod, sigue una expresin similar a la de Michaelis-Menten porque supone que un
nico sistema enzimtico controla el consumo de sustrato y que dicho sistema determina la
velocidad de crecimiento de biomasa. La ecuacin de Monod ajusta una amplia gama de resultados
experimentales y es la expresin ms empleada para el diseo de fermentadores.
Monod propuso (1942) la siguiente expresin que relaciona con S, basndose en la cintica
enzimtica.
Siendo:
Efecto de la concentracin de
sustrato limitante en la velocidad
especfica de crecimiento.
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De la representacin grfica de la ecuacin de Monod, se observa que:
a) Cuando el sustrato limitante se encuentra en suficiente cantidad, es decir cuando S >> Ks,
la velocidad especfica de crecimiento es mxima y constante, = m, en ese momento se
dice que el sustrato est en concentracin saturante y no es limitante del crecimiento. El
cultivo se encuentra en la zona de cultivos irrestrictos, es decir cultivos saturantes de
sustrato. Por analoga con la ecuacin de Michaelis-Menten =m siempre que S sea
mayor que aproximadamente 10 KS.
b) Cuando la concentracin del sustrato limitante en el medio de cultivo (S), est en el orden
de Ks, la velocidad de crecimiento () depende de la concentracin externa de ese sustrato,
por lo tanto m y los cultivos que operan bajo ese rgimen se llama cultivos restrictos.
Es decir que para que la velocidad de crecimiento est controlada por la concentracin de algn
nutriente del medio (S), la concentracin de ese nutriente debe estar en el orden de Ks.
La ecuacin de Monod (ec. a.2) se puede linearizar tomando los recprocos para obtenerla
expresin:
Graficando 1/ versus 1/S, produce una lnea recta con pendiente Ks/m, abscisa al origen -1/Ks y
ordenada al origen m
Puesto que los valores de Ks en un cultivo celular son generalmente muy bajos la determinacin
precisa de este parmetro a partir de datos de un reactor discontinuo es bastante difcil. Una mejor
estimacin de Ks puede realizarse utilizando un cultivo continuo de clulas, tal como se ver en
temas posteriores.
La velocidad especfica mxima (m) es constante pero depende del pH, temperatura, medio de
cultivo. Para un microorganismo dado, si fijo el pH, la temperatura y el medio de cultivo, m ser
constante mientras el sustrato limitante est en exceso.
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Bacterias ~ 0.9 h-1
Levaduras ~ 0.45 h-1
Hongos ~ 0.25 h-1
Como todas las reacciones qumicas, el crecimiento microbiano es afectado por la temperatura,
segn la ecuacin de Arrhenius, un aumento de la temperatura resulta en una mayor velocidad de
reaccin. Esto implica un aumento de m con la temperatura. Por otra parte aumentos posteriores de
temperatura inactivan las enzimas que catalizan las reacciones, con lo que el valor de m decrece
rpidamente.
Siendo:
A: constante
Ea: energa de activacin. 15 20 Kcal/mol.
R: constante de los gases (1,98 cal/mol .K)
T: temperatura absoluta (K).
Cada reaccin qumica individual es afectada por la temperatura, por lo que un incremento de esta
resulta en una mayor velocidad de reaccin (segn la ec. de Arrhenius). Esto se traduce en un
aumento de m con la temperatura. Por otra parte, aumentos posteriores de temperatura inactivan las
enzimas que catalizan las reacciones, con lo que el valor de m disminuye rpidamente. La
temperatura ptima resulta de la interaccin de estos dos efectos. Los microorganismos estn
divididos en tres clases dependiendo de su temperatura ptima de crecimiento: psicrfilos (Top < 20
C), mesfilos (20< Top < 50 C) y termfilos (Top >50 C). En la Figura 2.3 se representan los
valores de m para las tres clases de microorganismos, en funcin de la temperatura.
La Temperatura tambin afecta la velocidad de formacin de producto pero la Top y la Ea suelen ser
distintas. Tambin influye sobre el YX/S porque para T >Top, la energa de mantenimiento es mayor
por lo tanto baja YX/S.
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Los microorganismos tienden a crecer en un intervalo limitado de pH. Cada microorganismo tiene
un pH ptimo para el crecimiento. En general las bacterias tienen un pH ptimo cercano a 7, y los
hongos y levaduras de alrededor de 5. Esto solamente es una generalizacin puesto que ciertas
bacterias crecen, aunque con menor rapidez, a valores de pH tan bajos como 2 (lactobacillus).
El pH ptimo suele ser distinto para el crecimiento que para la formacin de producto. Durante las
fermentaciones es a menudo necesario controlar el pH, particularmente cuando se forman productos
cidos como el cido lctico, actico y ctrico o cuando los mismos sustratos de crecimiento son
cidos o bases, de modo que al consumirse, el pH del medio cambiar de manera importante. Un
ejemplo es el uso de NH4OH como FN
El crecimiento dar como resultado el consumo de NH3 dejando un protn en el medio, el cual
causa que el pH disminuya. Por tal motivo, es frecuente incluir en el medio sustancias que acten
como tampn (buffer) a fin de evitar que el pH se aleje del ptimo
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En la Tabla.se presenta la clasificacin de algunos productos de fermentacin.
Molculas generalmente sencillas, que participan de los caminos metablicos esenciales. Son
productos que estn asociados directamente a la generacin de energa en la clula, se forman como
productos finales del metabolismo energtico. Por lo general su sntesis est asociada con el
crecimiento microbiano anaerbico, de manera que el producto se forma durante las vas catablicas
que participan en la produccin de energa, de ATP. Son ms baratos y sencillos de producir.
Donde:
Siendo:
El primer trmino del segundo miembro expresa la formacin de producto debida al crecimiento y el
segundo la formacin de producto debida a los requerimientos energticos para mantenimiento.
Son metabolitos que estn parcialmente asociados al crecimiento microbiano. Son aquellos
productos en los que su sntesis puede comenzar despus de un perodo de crecimiento debido a la
acumulacin de algunos metabolitos primarios y posteriormente relacionarse con el crecimiento.
Pertenecen a este grupo los aminocidos, nucletidos., vitaminas, cido ctrico, etc. Se forman
durante la fase de desaceleracin y estacionaria.
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Velocidad de consumo de sustrato
Las clulas consumen sustrato del medio ambiente y lo canalizan en diferentes rutas metablicas.
Parte del sustrato se destina al crecimiento, es decir a producir biomasa. Si en el cultivo se produce
algn metabolito extracelular otra parte del sustrato se utilizar para la produccin de ese
metabolito, tambin se consume sustrato para generar la energa necesaria para las actividades de
mantenimiento (tales como recambio de material celular, transporte de nutrientes, mantenimiento de
gradientes de concentracin, reparacin de estructuras y movilidad)
Considerando un instante muy pequeo de tiempo y dividiendo la ecuacin. a.8 por dt se obtiene:
En algunos cultivos, no existe formacin de producto extracelular. Por ejemplo la misma biomasa
es el producto en la fabricacin de levadura de panadera y de protenas de origen unicelular. En
ausencia de formacin de producto se supondr que todo el sustrato que entra a la clula se utiliza
para el crecimiento y funciones de mantenimiento.
La ecuacin que representa el consumo de sustrato para crecimiento celular se puede calcular a
partir de la ecuacin de rendimiento de biomasa:
Despejando rs
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Pirt (1965) ha propuesto la siguiente ecuacin para la velocidad de consumo de la FCE teniendo en
cuenta el consumo para crecimiento y el mantenimiento celular:
Siendo:
En esta ecuacin aparece el trmino de mantenimiento que representa un consumo de sustrato que
no redunda en formacin de ningn producto, ni de biomasa, es simplemente un consumo de
sustrato que se metaboliza totalmente para la obtencin de energa para las funciones de
mantenimiento celular. Es decir que los microorganismos consumirn una cierta cantidad de FCE,
no para crecer, sino para el mantenimiento de sus funciones vitales tales como recambio de material
celular, mantenimiento de gradientes de concentracin, gradientes de pH y movilidad. Si no tiene
ese requerimiento mnimo satisfecho viene la muerte y la lisis, el microorganismo comienza a
autolizarse. La ecuacin de Pirt se aplica a todos aquellos sustratos que estn implicados en la
obtencin de energa por ejemplo la FCE, el oxgeno, el ATP.
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Donde:
Si se grafica: 1/Yx/s en funcin de 1/ se tiene una lnea recta de pendiente ms y ordenada al origen 1/
Yx/s.
Los rendimientos verdaderos se pueden calcular mediante los balances de electrones o por el
conocimiento de la estequiometria de la reaccin y corresponden a los rendimientos mximos
tericos vistos anteriormente.
El consumo de sustrato en clulas que forman productos depender de si la formacin del producto
se encuentra o no asociada al metabolismo energtico.
Cuando se forman productos en las rutas de generacin de energa, es decir productos asociados al
crecimiento (ej. en cultivos anaerobios), la sntesis del producto es una consecuencia del crecimiento
y del mantenimiento celular. En estos casos, en la clula, no existe un flujo de sustrato separado para
la sntesis del producto sino que el producto se forma a partir del sustrato utilizado para el
crecimiento y para el mantenimiento (Figura).
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Siendo
Yp/s: el rendimiento verdadero de producto a partir de sustrato y rp la velocidad volumtrica
de formacin de producto.
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