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Se deduce que los analitos A, B, C tardan ms tiempo en eluirse si se usa una fase
mvil poco polar. Es decir, cuanto ms polar sea el analito, ms tardar en eluir.
Cromatografa de adsorcin: Es la propiedad que tienen ciertos solidos de
aumentar la concentracin en su superficie de otras sustancias. La separacin se
debe a las diferencias de adsorcin de los componentes de una mezcla sobre la fase
estacionaria. Esta fase estacionaria ha de ser un slido polar de gran superficie
(adsorbente). En este mtodo la fase mvil puede ser un gas o un lquido dando
lugar a la cromatografa gas-solido o liquido-solido.
El grado de adsorcin va a variar segn la naturaleza y superficie especifica de los
adsorbentes y naturaleza de los solutos.
Para que la separacin de los componentes de la mezcla sea efectiva, su velocidad
de migracin a lo largo de la columna debe ser suficientemente diferente y la longitud
de la columna adecuada.
Algunos adsorbentes comnmente utilizados son: gel de slice, almina, sacarosa y
almidn.
La fase mvil consiste en un disolvente o mezcla de disolventes, seleccionado en
base a su polaridad con el fin de optimizar la separacin de los componentes de la
muestra en la columna. La fase mvil se desplaza a lo largo de la fase estacionaria
debido a la fuerza de la gravedad.
Con respecto a la forma en que sucede el fenmeno; bsicamente se llena la
columna hasta un tercio de su altura con eluyente. A continuacin se prepara una
suspensin del adsorbente (fase estacionaria) en el eluyente (fase mvil) y se vierte
lentamente (para evitar la formacin de burbujas) en el interior de la columna. Esta
operacin se puede realizar en varias adiciones, aadiendo ms eluyente a la
suspensin a medida que sea necesario. Con el fin de favorecer una distribucin ms
uniforme del adsorbente en la columna, as como eliminar las pequeas burbujas que
se puedan haber formado, se puede golpear suavemente la pared externa de la
columna comn tubo de goma. La columna se llena hasta aproximadamente la mitad
de su altura, reservndose la parte superior para la fase mvil. Se abre la llave de la
columna y se deja fluir el eluyente hasta que la altura de ste en la columna quede
aproximadamente un milmetro por encima del adsorbente. La superficie de la fase
estacionaria debe presentar un aspecto uniforme, liso y perpendicular al eje
longitudinal de la columna. A lo largo del proceso cromatogrfico la columna nunca
debe secarse, esto es,la fase estacionaria debe encontrarse en todo momento
cubierta por la fase mvil, yaque de lo contrario la fase estacionaria se contraera y
agrietara.
La muestra se deposita (siembra) en la superficie superior del adsorbente
contenido en la columna con la ayuda de una pipeta. Si la muestra es lquida se
puede sembrar directamente, si es slida se siembra una solucin concentrada de la
misma en un disolvente adecuado (de baja polaridad). Para evitar que se deforme la
superficie del adsorbente durante la adicin, se puede depositar la muestra en la
pared interior de la columna permitiendo que resbale hasta la superficie del
adsorbente. Finalizada la adicin de la muestra se abre la llave de la columna y se
eluye hasta que la muestra sea adsorbida y el nivel del lquido quede
aproximadamente 1 mmpor encima de la superficie del adsorbente. Se lavan las
paredes internas de la columna (por las que se ha dejado resbalar la muestra) con un
poco de eluyente y se eluye de nuevo hasta que el nivel del lquido vuelva a quedar 1
mm por encima de la superficie del adsorbente.
Cromatografa inica: La cromatografa de intercambio inico es un mtodo
que permite la separacin de molculas basada en sus propiedades de carga
elctrica. Se compone de dos fases: la fase estacionaria o intercambiador inico, y la
fase mvil. La fase estacionaria insoluble lleva en la superficie cargas electrostticas
fijas, que retienen contra iones mviles que pueden intercambiarse por iones de la
fase mvil, la cual suele ser una disolucin acuosa con cantidades moderadas de
metanol u otro disolvente orgnico miscible con agua que contiene especies inicas
generalmente en forma de buffer. Los iones de sta compiten con los analitos por los
sitios activos de la fase estacionaria.
El principio bsico de la cromatografa de intercambio inico es que las molculas
cargadas se adhieren a los intercambiadores de forma reversible de modo que
dichas molculas pueden ser asociadas o disociadas cambiando el ambiente inico.
La separacin mediante intercambiadores inicos se realiza por lo general, en dos
fases: en la primera las sustancias a separar se unen al intercambiador utilizando
condiciones que originan una unin fuerte y estable; a continuacin, se eluye de la
columna con buffers de diferentes pH o diferente fuerza inica, compitiendo los
componentes del buffer con el material por los sitios de unin.
Cuando una muestra inica atraviesa estas columnas, los iones presentes sufren
una separacin debido a las diferentes reacciones que sufren al interactuar con la
fase estacionaria de las columnas analticas: aquellos componentes que son
retenidos con ms fuerza por la fase estacionaria se mueven lentamente con el flujo
de la fase mvil; por el contrario, los componentes que se unen ms dbilmente a la
fase estacionaria, se mueven con ms rapidez. Al salir de la columna, la muestra
pasa a travs de un detector (conductimtrico, amperomtrico, etc.) donde se
registra la seal obtenida respecto al tiempo de retencin. El resultado son unos
cromatogramas donde la posicin de los mximos nos indica el in presente y su
rea nos indican la cantidad existente de dicho in.
Componentes de un cromatgrafo:
Los equipos de cromatografa de lquidos de alta eficacia (HPLC) trabajan a grandes
presiones, por lo que son complejos y caros. Sus componentes fundamentales se
aprecian en el siguiente esquema:
Esquema-HPLC
Sistema de suministro y almacenamiento de fase mvil
Sistema de bombeo
Sistema de inyeccin de muestra
Columna cromatogrfica
Detector