Estudo Da Produção Enzimática de Biodiesel

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEAR
CENTRO DE TECNOLOGIA
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUMICA
PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM ENGENHARIA QUMICA
EDILSON HOLANDA COSTA FILHO
ESTUDO DA PRODUO ENZIMTICA DE BIODIESEL

UTILIZANDO LEO RESIDUAL E ETANOL
Fortaleza Cear
2008
ESTUDO DA PRODUO ENZIMTICA DE BIODIESEL
UTILIZANDO LEO RESIDUAL E ETANOL
Dissertao de Mestrado submetida Coordenao do

Programa de Ps-graduao em Engenharia Qumica, da
Universidade Federal do Cear, como requisito parcial
para obteno do ttulo de Mestre em Engenharia Qumica.
Orientadora: Prof. Dra. Luciana Rocha Barros Gonalves
Fortaleza Cear
2008
C870e Costa Filho, Edilson Holanda
Estudo da produo enzimtica de Biodiesel utilizando leo residual e
etanol / Edilson Holanda Costa Filho, 2008.
97 f. ;il. color. enc.
Orientador: Profa. Dra. Luciana Rocha Barros Gonalves

rea de concentrao: Sistemas de reaes biotecnolgicas
Dissertao (mestrado) - Universidade Federal do Cear, Centro de
Tecnologia. Depto. de Engenharia Qumica, Fortaleza, 2008.
1. Lpase imobilizada 2. Esterificao 3. Transesterificao I. Gonalves,

Luciana Rocha Barros (orient.) II. Universidade Federal do Cear Programa
de Ps-Graduao em Engenharia Qumica
CDD 660
ESTUDO DA PRODUO ENZIMTICA DE BIODIESEL UTILZANDO LEO

RESIDUAL E ETANOL
Dissertao submetida Coordenao do Programa de Ps-Graduao em Engenharia

Qumica, da Universidade Federal do Cear, como requisito parcial para a obteno do grau
de Mestre em Engenharia Qumica na rea de Concentrao de Sistemas de Reaes
Biotecnolgicas.
Aprovada em 09 / 10 / 2008.
BANCA EXAMINADORA
Aos meus pais, Edilson e Zenir,
pelo apoio e incentivo
durante essa caminhada

AGRADECIMENTOS
A Deus, por simplesmente tudo.
As professoras Luciana e Andra, pela confiana, pela orientao e pela pacincia que
tiveram comigo durante esses dois anos.
A minha prima Denise, ao seu esposo Diniz e aos seus filhos Pedro e Mariana.
Obrigado por esses quase 11 anos os quais vocs dividiram comigo o vosso lar. Obrigado pela
pacincia. Uma parte do que sou hoje devo a vocs.
As minhas amigas Kelly, Louise e Izabelly, pela ajuda, pelos conselhos, pelas boas
gargalhadas que demos no laboratrio e, principalmente, pela pacincia que tiveram nos
momentos difceis.
Aos bolsistas do laboratrio de biotecnologia do Departamento de Engenharia

Qumica da UFC, especialmente a Ana Iraide pelas dvidas tiradas e pela lpase fornecida.
A NOVOZYMES, pelo fornecimento da lpase.
Ao professor Rinaldo dos Santos Arajo, do Centro Federal de Educao Tecnolgica

do Cear (CEFET), pelas dvidas tiradas e pelas anlises de cromatografia gasosa.
Ao aluno de mestrado Bruno Csar Barroso Salgado, do CEFET, pelas anlises de

cromatografia gasosa.
A empresa IRACEMA, pelo fornecimento do leo de algodo.
Ao Jackson, da Fundao Ncleo de Tecnologia Industrial do Cear (NUTEC), pelas

anlises de ndice de iodo.
A Rosilene, da empresa TECBIO, pelas dvidas tiradas.
Ao Estlio, do Laboratrio de Combustveis e Lubrificantes (LCL) pelas anlises de

densidade.
Ao CNPq, pela concesso da bolsa de estudos.

A todos que de certa forma contriburam, direta ou indiretamente, para a conquista de
mais essa vitria, incluindo todos os colegas, professores e funcionrios tcnico-
administrativos da UFC e do Departamento de Engenharia Qumica.
"No deixe que a saudade sufoque, que a rotina acomode, que o medo impea de tentar.
Desconfie do destino e acredite em voc. Gaste mais horas realizando que sonhando,
fazendo que planejando, vivendo que esperando
porque, embora quem quase morre esteja vivo, quem quase vive j morreu."
(Luiz Fernando Verssimo)
RESUMO
O biodiesel uma mistura de steres alqulicos de cidos graxos resultante da reao entre
leos vegetais e lcoois de cadeia curta, como metanol ou etanol, auxiliada por um
catalisador, que pode ser cido, bsico ou enzimtico. Entretanto, o alto custo da matria-
prima quando se utiliza leo vegetal de grau alimentcio tem inviabilizado economicamente a
produo desse biocombustvel. Por isso, as pesquisas com leo residual tem aumentado,
mostrando a viabilidade tcnica da produo de biodiesel a partir de resduos residenciais e
industriais. Outro fator que influencia a reao de produo de biodiesel o tipo de lcool. No
Brasil, o uso do etanol interessante desde que o nosso pas se tornou um dos maiores
produtores mundiais de etanol vegetal, um produto mais barato e menos txico que o metanol,
diminuindo assim a nossa dependncia do petrleo. O catalisador tambm exerce influncia
nesse tipo de reao. Os catalisadores mais usados industrialmente so as bases, mas quando o
leo vegetal tem um alto teor de cidos graxos livres, o que acontece, geralmente, com os
leos residuais, no possvel usar catalisador bsico por favorecer a formao de sabo e
diminuir o rendimento em steres. Nesse caso, usa-se um catalisador cido ou enzimtico.
Partindo dessa premissa, os resultados constantes nessa dissertao correspondem ao estudo
da produo enzimtica de biodiesel utilizando leo residual e etanol. Avaliou-se o
comportamento da lipase comercial imobilizada de Cndida antarctica tipo B (Novozym
435) na esterificao do cido olico comercial, estudando as variveis que influenciam no
processo. As variveis escolhidas foram: temperatura (30-50o C), razo molar cido:lcool
(1:1-1:6) e a concentrao de gua presente no meio (0-20%). As reaes foram conduzidas
em erlenmeyers de 250 mL fechados contendo 10 g de leo e a quantidade de lcool pr-
determinada pelo planejamento de experimentos, mantendo-se a agitao fixa em 200rpm e a
concentrao de enzima em 5% m/m baseada na massa de leo medida, obtendo-se uma
converso mxima de 88,36% na condio de maior razo molar, menor temperatura e menor
concentrao de gua. Entretanto, pelo estudo cintico conclu-se que no necessrio um
excesso de lcool para conseguir boas converses. Em seguida, avaliou-se o comportamento
de uma lpase do tipo B de Cndida antarctica imobilizada em quitosana na esterificao do
cido olico, observando um comportamento semelhante ao da Novozym 435 mas com uma
taxa inicial de reao mais lenta. Avaliou-se tambm o comportamento das duas lpases na
esterificao do leo de coco residual cido, observando uma boa estabilidade para ambos os
biocatalisadores que forneceram uma converso acima de 80% com 60 minutos de reao e
puderam ser reutilizados por no mnimo 10 vezes consecutivas sem perda considervel de
atividade. Para comparar o comportamento da Novozym 435 em dois meios distintos,
realizou-se um planejamento experimental fatorial com um leo de algodo residual de baixa
acidez livre, observando a mesma influncia negativa da temperatura e da razo molar entre
reagentes, mas com um tempo de reao maior, pois uma converso mxima de 82,66% s foi
atingida com 72 horas de reao. Para o clculo da converso, utilizou-se a reduo do ndice
de acidez quando a matria-prima tinha um alto teor de cidos graxos livres e o mtodo do
periodato de sdio na determinao da glicerina quando a matria-prima tinha uma baixa
acidez livre.
PALAVRAS-CHAVE: Biodiesel, leo residual, etanol, lipase imobilizada, esterificao,

transesteresterificao.
ABSTRACT
Biodiesel is a mixture of fatty acid alkyl esters produced by the reaction between vegetable
oils and short chain alcohols, like methanol and ethanol, using a catalyst that can be acid,
basic or enzymatic. However, the high cost of the raw material when refined vegetable oil is
used, have made biodiesel production economically unattractive. Therefore, research with
waste oils has increased, showing the technical viability of the production of biodiesel using
the residential and industrial residues as raw material. Another variable that has influenced
this type of reaction is the type of alcohol. In Brazil, the use of ethanol is interesting because
the country has become one of the top worldwide producers of ethanol from vegetables
sources, a cheaper and less toxic product than methanol, decreasing our petroleum
dependence. The type of catalyst also influences biodiesel production. Alkali is the catalysts
that is more often used in industry, but when the vegetable oil has a high acid value, it can not
be used because soap is produced, diminishing the esters yield. In this case an acid or an
enzyme is used as a catalyst. Based on the previous explanation, the results of this work
correspond to the study of enzymatic production of biodiesel using waste oil and ethanol. The
immobilized Candida antarctica lipase (Novozym 435) behavior was studied in the oleic acid
esterification, studying the effect of the variables that has influence in the process. The
variables chosen were: temperature (30 50oC), molar ratio acid:alcohol (1:1 1:6) and water
content (0 20%). The reaction were performed in closed reactors with a capacity of 250 mL
containing 10 g of oil, a known amount content of alcohol, pre-determined by experimental
design and enzyme content of 5% p/p, based on the oil mass. The reaction medium was kept
under constant stirring, 200 rpm. Maximum conversion of 88,36% was achieved when high
molar ration, the lower temperature and water content values were used. However, by the
kinetic study, it can be concluded that it is not necessary to use an alcohol excess to achieve
good conversions. After that, the behavior of Candida Antarctica lipase B immobilized in
chitosan was studied in acid oleic esterification. A slower initial rate of reaction was observed
in comparison to Novozym 435. The behavior of both lipases was also studied in the
esterification of waste coconut oil, showing good stability and giving a conversion of about
80% in 60 minutes. Both biocatalyst could be reused 10 times, keeping the same activity. In
order to compare the behavior of Novozym 435 in two different mediums, an experimental
design was performed with waste cotton oil, which had a low acid value. The same negative
influence of the temperature and molar ratio was observed, but with a high reaction time,
getting a maximum conversion of 82,66% in 72 hours of reaction. To calculate the
conversions, the decreasing of the acid value was used when the raw material had a high acid
value, and when the raw material had a low acid value the glycerol production was used.
KEY WORDS: Biodiesel, waste oil, ethanol, immobilized lipase, esterification,

transesterification.
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 2.1 Mecanismo da esterificao enzimtica com etanol ...................... 26

.........
FIGURA 2.2 Reao de transesterificao .......................................................... 27
FIGURA 2.3 Mecanismo da transesterificao enzimtica com etanol .............. 28
FIGURA 3.1 Fluxograma do procedimento experimental para a reao de

alcolise enzimtica do cido olico e do leo vegetal residual .... 50
FIGURA 4.1 Cromatograma do cido olico ...................................................... 57
FIGURA 4.2 Cromatograma do leo de coco residual ........................................ 58
FIGURA 4.3 Cromatograma do leo de algodo residual ................................... 59
FIGURA 4.4 Diagrama de Pareto indicando o efeito dos valores estimados

para as variveis estudadas no planejamento experimental 23 com
triplicata do ponto central da esterificao enzimtica do cido
olico .............................................................................................. 62
FIGURA 4.5 Valores preditos pelo modelo versus valores experimentais da

converso em steres etlicos obtidos pelo planejamento
experimental 23 com triplicata do ponto central da esterificao
enzimtica do cido olico ............................................................. 65
FIGURA 4.6 Superfcie de resposta representando a converso em funo da

razo molar entre os reagentes e concentrao de gua adicionada
ao meio ........................................................................................... 66
FIGURA 4.7 Influncia da temperatura na esterificao enzimtica do cido

olico com etanol utilizando Novozym 435 como catalisador na
razo molar 1:1 e concentrao de gua W=0% ............................ 67
FIGURA 4.8 Influncia da temperatura na esterificao enzimtica do cido

razo molar 1:6 e concentrao de gua W=0% ............................ 67
FIGURA 4.9 Influncia da razo molar cido:lcool na esterificao

enzimtica do cido olico com etanol utilizando Novozym 435
como catalisador na temperatura de 30 oC e na menor
concentrao de gua (W = 0%) .................................................... 69
FIGURA 4.10 Influncia da razo molar cido:lcool na esterifcao enzimtica

do cido olico com etanol utilizando Novozym 435 como
catalisador na temperatura de 50 oC e na menor concentrao de
gua (W = 0%) ............................................................................... 69
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 4.11 Influncia da concentrao de gua na esterifcao enzimtica do

cido olico com etanol utilizando Novozym 435 como
catalisador na temperatura de 30 oC e na menor razo molar (R =
1:1) ................................................................................................. 71
FIGURA 4.12 Influncia do aumento da concentrao de lcool com o aumento

da concentrao de gua na esterificao enzimtica do cido
temperatura de 30 oC ...................................................................... 73
FIGURA 4.13 Comparao do comportamento da Lipase de Candida Antarctica

Tipo B Imobilizada em Quitosana com a Novozym 435 na
etanlise do cido olico na temperatura de 30 oC, razo molar
cido:lcool 1:1 e sem adio de gua
........................................................................................................... 74
FIGURA 4.14 Comparao do comportamento da Novozym 435 na reao de

etanlise do cido olico com a etanlise do leo de coco residual
na temperatura de 30 oC, razo molar cido:lcool 1:1 e sem
adio de gua .................................................................................. 75
FIGURA 4.15 Estabilidade operacional da Novozym 435 e da Lipase de Candida

Antarctica Tipo B Imobilizada em Quitosana na reao de
etanlise do leo de coco residual na temperatura de 30 oC, razo
molar cido:lcool 1:1 e sem adio de gua
........................................................................................................... 76
FIGURA 4.16 Diagrama de Pareto indicando o efeito dos valores estimados para
as variveis independentes para o Planejamento fatorial 23 da
reao de alcolise enzimtica do leo de algodo residual ..... 78
FIGURA 4.17 Valores previstos pelo modelo versus valores experimentais

obtidos pelo pelo planejamento experimental fatorial 23 com
triplicata do ponto central para a reao de alcolise enzimtica do
leo de algodo .......................................................................... 80
FIGURA 4.18 Superfcie de resposta para a converso em funo da temperatura

e razo molar leo:lcool para alcolise enzimtica de leo de
algodo utilizando Novozymes 435 como catalisador . 81
FIGURA 4.19 Superfcie de resposta para a converso em funo da temperatura

e do tempo reacional para a alcolise enzimtica de leo de
algodo utilizando Novozymes 435 como catalisador ...... 82
LISTA DE TABELAS
TABELA 2.1 Comparao das propriedades fsico-qumicas .............................. 17
TABELA 2.2 Distribuio espacial das principais fontes de oleaginosas pelas

regies do Brasil .............................................................................. 21
TABELA 2.3 Comparao entre a catlise qumica e a catlise enzimtica para

produo de biodiesel ...................................................................... 31
TABELA 2.4 Classificao das enzimas de acordo com IUBMB ........................ 35
TABELA 3.1 Valores reais das variveis independentes para o Planejamento

Fatorial 23 utilizado para otimizar as condies da esterificao
enzimtica do cido olico utilizando uma lpase do tipo B de
Candida antarctica comercial como catalisador ............................ 51
TABELA 3.2 Valores reais das variveis independentes para o Planejamento

Fatorial 23 utilizado para otimizar as condies da etanlise
enzimtica do leo de algodo residual utilizando uma lpase do
tipo B de Candida antarctica comefcialcomo catalisador .............. 51
TABELA 4.1 Caracterizao fsico-qumica das matrias-primas lipdicas

utilizadas nas reaes de alcolise enzimtica ................................ 56
TABELA 4.2 Percentuais de cidos graxos para o cido olico ........................... 57
TABELA 4.3 Percentuais de cidos graxos para o leo de coco residual ............. 58
TABELA 4.4 Percentuais de cidos graxos para o leo de algodo residual ........ 59
TABELA 4.5 Resultados do Planejamento Fatorial 23 com triplicata do ponto

central tendo como varivel resposta a converso obtida na
esterificao enzimtica do cido olico utilizando uma lipase
comercial de Candida antarctica tipo B (Novozym 435) ............... 61
TABELA 4.6 Estimativa dos efeitos principais e suas interaes na converso

do cido olico a steres etlicos ..................................................... 63
TABELA 4.7 Anova para a reao de alcolise enzimtica do cido olico

utilizando Novozym 435 como catalisador ..................................... 64
LISTA DE TABELAS
TABELA 4.8 Converses obtidas na alcolise enzimtica do leo de algodo

residual de baixa acidez livre utilizando uma lipase comercial de
Candida antarctica tipo B (Novozym 435) ................................... 77
TABELA 4.9 Estimativa dos efeitos principais e suas interaes na converso

do leo de algodo a steres etlicos .............................................. 79
TABELA 4.10 ANOVA para a reao de alcolise enzimtica do leo de

algodo utilizando Novozym 435 como catalisador ...................... 80
TABELA 4.11 Caracterizao fsico-qumica dos steres etlicos ........................ 83

SUMRIO
1 INTRODUO ................................................................................................ 12
2 REVISO BIBLIOGRFICA ........................................................................ 16
2.1 Contexto Histrico ............................................................................................ 16
2.2 Matrias-primas ............................................................................................... 19
2.3 Mtodos de obteno de biodiesel ................................................................... 23
2.3.1 Microemulsificao ................................................................................ 24
2.3.2 Pirlise .................................................................................................... 24
2.3.3 Esterificao ............................................................................................ 25
2.3.4 Transesterificao ................................................................................... 27
2.4 Catlise enzimtica ........................................................................................... 32
2.4.1 Lipase ...................................................................................................... 33
2.4.2 Enzimas imobilizadas ............................................................................. 37
2.5 Consideraes finais ......................................................................................... 38
3 MATERIAIS E MTODOS ............................................................................ 40
3.1 Substratos e Catalisador .................................................................................. 40
3.2 Determinao da Atividade Hidroltica das Enzimas Imobilizadas ............ 41

3.3 Caracterizao Fsico-Qumica da Matria-Prima e do Biodiesel ............... 41
3.3.1 ndice de Acidez ..................................................................................... 42
3.3.2 Densidade ................................................................................................ 43
3.3.3 Teor de Umidade .................................................................................... 43
3.3.4 ndice de Iodo ......................................................................................... 44
3.3.5 Glicerina Livre, Combinada e Total ....................................................... 45
3.4 Caracterizao Cromatogrfica da Matria-Prima ...................................... 47
3.5 Alcolise Enzimtica do cido Olico e dos leos Vegetais Residuais

Utilizando Lipase como Catalisador ............................................................... 49
3.6 Clculo da Converso em steres Etlicos ..................................................... 52
3.7 Recuperao e Regenerao do Biocatalisador ............................................. 53
3.8 Neutralizao dos steres Etlicos Obtidos .................................................... 53
4 RESULTADOS E DISCUSSES ................................................................... 55
4.1 Caracterizao Fsico-Qumica da Matria-Prima ....................................... 55
4.2 Caracterizao Cromatogrfica da Matria-Prima ...................................... 56
4.3 Alcolise Enzimtica do cido Olico Utilizando Lipase Comercial de

Candida Antarctica Tipo B (Novozym 435) como Catalisador ..................... 60
4.3.1 Efeito da Temperatura ............................................................................ 66

4.3.2 Efeito da Razo Molar cido:lcool ..................................................... 68
4.3.3 Efeito da Concentrao de gua ............................................................ 70
4.4 Alcolise Enzimtica do cido Olico Utilizando Lipase de Candida

Antarctica Tipo B Imobilizada em Quitosana como Catalisador ................. 74
4.5 Alcolise Enzimtica do leo de Coco Residual Utilizando Novozym 435

como Catalisador .............................................................................................. 75
4.6 Ciclos de Atividade ........................................................................................... 76
4.7 Alcolise Enzimtica do leo de Algodo Residual Utilizando Novozym

435 como Catalisador ....................................................................................... 77
4.8 Caracterizao dos steres Etlicos ................................................................ 82
4.9 Concluses Parciais .......................................................................................... 83
5 CONCLUSES ................................................................................................ 85
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS .................................................................... 87
ANEXO ...................................................................................................................... 95
Captulo 1 Introduo Costa Filho, E.H. 12
1. INTRODUO
Diante das atuais perspectivas ambientais, o homem precisa se mobilizar em busca de

garantir um planeta habitvel para as prximas geraes. Alm disso, a grande maioria da
energia que a humanidade consome atualmente para os mais diversos fins advm do petrleo,
gs natural e carvo, mas essas fontes so esgotveis e poluentes, e o preo para sua aquisio
aumenta a cada dia. Por isso, surge na comunidade cientfica e na populao em geral, a
necessidade de desenvolver combustveis alternativos, renovveis, menos poluentes e a um
preo razovel. Nesse contexto, nasce o biodiesel, um combustvel ambientalmente correto,
substituto do diesel de petrleo, que pode ser produzido a partir de fontes renovveis como
leos vegetais, gorduras animais e leos utilizados para fritura de alimentos, resultando em
uma fonte permanente de gerao de energia (Demirbas, 2007; Ramos et al., 2003).
Quimicamente, ele definido como um derivado mono-alquil ster de cidos graxos

derivados de lipdeos de ocorrncia natural e uma das maneiras pela qual pode ser produzido,
juntamente com a glicerina, atravs da reao de alcolise de triacilgliceris (ou
triglicerdeos) com lcoois de cadeia curta, na presena de um catalisador cido, bsico ou
enzimtico (Al-Zuhair, 2005; Demirbas, 2007; Ramos et al., 2003; Rodrigues et al., 2007;
Vieira et al., 2006).
O biodiesel nasceu basicamente como uma soluo para a crise internacional do

petrleo, mas tambm e, principalmente, em virtude dos problemas ambientais que o nosso
planeta enfrenta na atualidade. Os benefcios ambientais que esse novo combustvel pode
trazer so imensos, tais como a reduo de at 78% das emisses de gs carbnico, que
absorvido pela fotossntese das prprias oleaginosas, reduo de 90% das emisses de
fumaas e de 98% de enxofre na atmosfera (Lin et al, 2007).
Com essas caractersticas, o biodiesel se tornou um produto de grande interesse entre

leigos e cientistas, sendo fonte de inmeras pesquisas e desenvolvido em vrios pases do
mundo, inclusive no Brasil, detentor da primeira patente mundial de produo industrial de
biodiesel e que deve aproveitar a experincia obtida com o Programa Nacional do lcool
(PROALCOOL) para facilitar a introduo desse biocombustvel na matriz energtica
brasileira e alcanar os benefcios esperados, sobretudo a gerao de emprego e renda, pois o
Estudo da Produo Enzimtica de Biodiesel Utilizando leo Residual e Etanol

biodiesel capaz de melhorar no s as condies ambientais, mas tambm a situao scio-

econmica de regies menos favorecidas. O nosso pas tem todas as condies de se tornar
um grande produtor de biodiesel, com a sua imensa extenso territorial e diversidade de
clima, que o torna uma potncia na produo de biomassa para fins energticos. A mamona, o
dend, a soja, entre outras, e, mais recentemente, os resduos industriais e residenciais, podem
ser abundantes fontes de energia e incluso social.
O biodiesel vem para substituir o leo diesel mineral e essa a motivao econmica
para produo desse bioproduto no nosso pas, uma vez que o diesel o derivado do petrleo
mais consumido no Brasil e que uma frao crescente desse produto vem sendo importada
anualmente (Ramos et al., 2003). Destaque-se que o Brasil importa cerca de 40 milhes de
barris de leo diesel, por ano, o que representa uma despesa em nosso balano de pagamentos
de pelo menos 1,2 bilhes de dlares (Holanda, 2004).
Uma outra caracterstica desse biocombustvel que deve ser ressaltada, que ele pode
ser usado em qualquer motor do ciclo diesel, com pouca ou nenhuma necessidade de
adaptao, o que no acontece com o uso direto dos leos vegetais como combustveis, pois,
devido a sua alta viscosidade, baixa volatilidade e combusto incompleta, alguns problemas
foram detectados, tais como: (a) ocorrncia de excessivos depsitos de carbono no motor; (b)
a obstruo nos filtros de leo e bicos injetores; (c) a diluio parcial do combustvel no
lubrificante; (d) o comprometimento da durabilidade do motor; e (e) um aumento
considervel em custos de manuteno (Akoh et al., 2007; Fukuda et al., 2001; Ramos et al.,
2003; Vieira et al., 2006; Yagiz et al., 2007).
Apesar de todos os benefcios que esto atrelados ao biodiesel, a sua produo

enfrenta problemas, principalmente quanto ao custo da matria-prima quando se utiliza leo
refinado. Sendo assim, o uso de leos residuais tem se mostrado interessante para produo de
biodiesel, uma vez que uma matria-prima mais barata, disposta incorretamente no meio
ambiente, usada normalmente para produo de sabo, massa de vidraceiro e rao para
animais e que no deve ser reutilizada por causar srios danos sade humana. Somente o
Japo contribui com cerca de 500.000 toneladas de leo residual por ano, contribuindo com o
aumento dos problemas ambientais se um efetivo sistema de coleta e reciclagem no for
implantado. J a China, por exemplo, produz mais de 20 mil toneladas de leo de fritura
anualmente, mas j h um sistema de coleta visando produo de biodiesel (Canakci, 2007;

Encinar et al., 2007; Samukawa et al., 2000; Wang et al., 2007). Um levantamento primrio
da oferta de leos residuais de fritura, suscetveis a serem coletados (produo > 100
Kg/ms), revela um valor da oferta brasileira superior a 30.000 toneladas anuais (Holanda,
2004).
Dados reportados na literatura comprovam a viabilidade tcnica da utilizao de

resduos industriais e residenciais para produo de biodiesel. Vrios autores mostram que os
motores que funcionaram com o biodiesel obtido de leo de fritura apresentaram um melhor
desempenho e a sua queima emite menos CO2, materiais particulados e gases do efeito estufa
(Kulkarni et al., 2006; Lebedevas e Vaicekauskas, 2006; Lin et al., 2007). Alm disso, o
processo de purificao do biodiesel feito a partir de matrias-primas residuais cidas mais
fcil, pois o subproduto da reao gua (Lucena, 2008).
Dentre os processos de produo de biodiesel, a alcolise alcalina com metanol o

processo mais usado comercialmente. Entretanto, apesar do baixo custo dos catalisadores
qumicos homogneos, essa rota de produo apresenta algumas desvantagens como a no
recuperao e reutilizao do catalisador, produo de sabo, difcil recuperao do glicerol,
um grande gasto energtico e a permanncia da dependncia do petrleo ao se utilizar
metanol (Al-Zuhair, 2007; Al-Zuhair et al., 2006; Iso et al., 2001; Wang et al, 2006).
Nesse sentido, como o biodiesel precisa ser de alta pureza para ser usado como
combustvel nos motores de combusto interna, a etanlise enzimtica apresenta-se como uma
rota de produo promissora por possibilitar a obteno de um produto mais puro, a fcil
recuperao do glicerol, a no produo de sabo, um menor gasto energtico, a fcil
recuperao e reutilizao do biocatalisador e a utilizao de etanol como lcool
transesterificante, um produto tambm obtido de uma fonte renovvel, menos txico do que o
metanol e com grande disponibilidade no Brasil, desde que se tornou um dos maiores
produtores mundiais. Alm disso, o uso de enzimas como catalisador da reao de alcolise
viabiliza o uso de matrias-primas com baixo valor agregado (elevado teor de cidos graxos
livres), pois a transesterificao alcalina exige que o leo vegetal seja isento de umidade e de
cidos graxos livres (no podendo exceder 1% FFA1), uma vez que a base pode reagir com os
cidos graxos, formando sabo e gua, o que dificulta a separao e purificao do biodiesel
(Dossat et al., 1999; Lucena, 2008; Shieh et al., 2003).
1
cidos graxos livres

Todavia, a biotransformao ainda no comercialmente competitiva com a catlise

convencional em virtude do alto preo das enzimas e da sua inativao por contaminao pelo
leo, pelo lcool ou pelos subprodutos formados durante a reao (Isso et al., 2001; Meher et
al., 2006; Ranganathan et al., 2007; Royon et al., 2007). Sendo assim, essa dissertao visa
estudar a produo enzimtica de biodiesel utilizando, primeiramente, cido olico comercial
e etanol para avaliar o comportamento da lipase na esterificao de substratos cidos e as
variveis que influenciam no processo. A importncia de se utilizar primeiramente o cido
olico comercial que, alm desse cido ser o mais comumente encontrado nos leos
residuais, ao partir de uma matria-prima pura, diminui-se a probabilidade de inativao da
enzima por contaminantes do leo residual, e avalia-se apenas a influncia das variveis
escolhidas, buscando otimizar o processo a fim de estabelecer as caractersticas para
aplicaes industriais.
Conhecendo-se as melhores condies de esterificao do cido olico, avaliou-se o

comportamento da lipase frente a leos residuais e a sua estabilidade operacional aps vrias
reaes consecutivas. Objetivou-se tambm comparar o comportamento da lipase em meios
com caractersticas fsico-qumicas distintas.

Captulo 2 Reviso Bibliogrfica Costa Filho, E.H. 16
2. REVISO BIBLIOGRFICA
Este captulo tem a finalidade de levantar o estado da arte inserido no contexto deste
projeto e visa identificar as lacunas que devem ser preenchidas com esse trabalho. Ele
dividido em cinco tpicos nos quais, inicialmente, procura-se contextualizar o biodiesel,
seguindo com uma descrio das matrias-primas e dos mtodos de obteno desse
biocombustvel, dando nfase a alcolise enzimtica, objeto de estudo dessa dissertao.
2.1. Contexto Histrico
Historicamente, durante a escassez do petrleo, os leos vegetais e seus derivados

foram usados como combustvel alternativo ao diesel do petrleo. O primeiro registro do uso
de leos vegetais como combustvel lquido na combusto interna de motores data de 1900
quando Rudolf Diesel usou leo de amendoim. Entretanto, devido ao baixo custo e alta
eficincia, o petrleo tornou-se a fonte de energia dominante e o diesel do petrleo foi ento
produzido para motores a diesel. Apesar disso, sendo o petrleo uma fonte finita, surge na
comunidade cientfica a necessidade de desenvolver energias alternativas. Assim, nos anos 30
e 40, os leos vegetais passaram a ser usados diretamente nos motores a diesel em situaes
de emergncia (Akoh et al., 2007; Ma et al., 1999; Pousa et al., 2007). No entanto, com essa
prtica, observou-se que a durabilidade do motor era comprometida devido a alta viscosidade,
baixa volatilidade e combusto incompleta dos leos vegetais in natura.
Sendo assim, iniciaram-se as primeiras transformaes qumicas nos leos vegetais, a

fim de torn-lo menos viscoso e mais eficiente. A pirlise foi o primeiro mtodo de
transformao utilizado, seguido da transesterificao e esterificao (Pousa et al., 2007), mas
a primeira patente mundial de produo industrial de biodiesel por transesterificao surgiu na
dcada de 80, no Brasil, de autoria do engenheiro qumico Expedito Jos de S Parente (Olga,
2005).

A descoberta do biodiesel por Expedito Parente se deu em 1977 quando ele observou
uma vagem de ing, cheia de leo, onde ele visualizou uns gros ligados, fomentando a
molcula do biodiesel, com os steres de cidos graxos. A partir da, ele iniciou as pesquisas
com leo de algodo e metanol. Aps a sntese, ele verificou que a viscosidade e as
caractersticas aparentes se assemelhavam s do leo diesel mineral e ento testou o seu
combustvel num motor velho emprestado por um amigo, surpreendendo-se com o bom
funcionamento do motor que no funcionava nem com o petrodiesel (Olga, 2005). A Tabela
2.1 mostra uma comparao das caractersticas do leo diesel mineral com as caractersticas
do biodiesel.
Tabela 2.1: Comparao das propriedades fsico-qumicas

Propriedade leo Diesel Biodiesel
Calor de combusto (MJ/Kg) 45,2 40,5
Viscosidade (cS a 40oC) 2,98 6,17
Enxofre (%) 0,15 < 0,01
Ponto de inflamabilidade (oC) 82 124
Nmero de cetano 49,2 59,7
Ponto de nvoa (oC) -14 -2
o
Ponto de orvalho ( C) -21 -10
Fonte: HOLANDA, 2004.
Diante dessa motivao, o engenheiro parte em busca de parcerias e em 1980 patenteia

sua metodologia de produo de biodiesel por transesterificao (Olga, 2005). No entanto, o
governo brasileiro no deu muita importncia descoberta do pesquisador, mesmo depois de
testes bem sucedidos feitos nos carros da Companhia Energtica do Cear e em um avio
militar brasileiro. Com a falta de interesse e de investimento do governo, a patente torna-se de
domnio pblico e o biodiesel passa a ser explorado em outras partes do planeta.
Na poca da descoberta de Parente, o governo brasileiro preocupava-se apenas com o

Programa Nacional do lcool PROALCOOL, implementado na dcada de 70 com o
objetivo de abastecer com etanol, de forma extensiva, veculos movidos normalmente a
gasolina (Holanda, 2004). No entanto, segundo o prprio Expedito, o lcool um combustvel
solitrio, s para veculos de passeio. No coletivo, no serve para caminho, nibus, trem,
para produo de energia eltrica... J o biodiesel, como sucedneo do diesel mineral, um

combustvel coletivo, muito mais plural. Dessa forma, o lcool no diminui nossa
dependncia do petrleo.
O PROALCOOL surgiu por uma necessidade de mercado. Na poca o acar estava

muito barato, e os usineiros precisavam de alternativas. Ento o programa do lcool no
nasceu pela necessidade energtica (Olga, 2005). O biodiesel, entretanto, ao invs de
concentrador de riquezas, um combustvel distribuidor de riquezas.
Diante dessas constataes a respeito do PROALCOOL, das turbulncias no mercado

internacional do petrleo e das preocupaes ambientais, o governo brasileiro cria em 2002 o
Programa Nacional do Biodiesel, PROBIODIESEL, que tem como principal objetivo
promover o desenvolvimento de tecnologias de produo e avaliar a viabilidade e a
competitividade tcnica, scio-ambiental e econmica do biodiesel para os mercados interno e
externo, bem como de sua produo e distribuio espacial nas diferentes regies do pas
(Moreira et al., 2006; Ramos et al., 2003). Esse programa resultado de estudos feitos por
comisses interministeriais em parceria com universidades e centros de pesquisa,
considerando a etanlise de leos vegetais como a principal rota de produo de biodiesel, em
virtude da grande capacidade de produo de etanol pelo Brasil (Pousa et al., 2007).
Em 2004, lanado o Programa Nacional de Produo e Uso de Biodiesel (PNPB),

cujo principal objetivo era a implementao de forma sustentvel, tanto tcnica, como
economicamente, da produo e uso do biodiesel, com enfoque na incluso social e no
desenvolvimento regional, via gerao de emprego e renda (Suarez et al., 2006). Esse
programa prope a introduo de biocombustveis derivados de leos e gorduras na matriz
energtica brasileira atravs da adio de 2% de biodiesel (B2) ao diesel consumido no Brasil
at 2008 e dentro de 15 anos as perspectivas so de que essa proporo passe para 20% de
biodiesel e 80% de diesel (B20), o que, em termos ambientais, resultar em uma reduo
significativa no padro de emisses de materiais particulados, xidos de enxofre e gases que
contribuem para o efeito estufa. Sendo assim, sua difuso, em longo prazo, proporcionar
maiores expectativas de vida populao e, como conseqncia, um declnio nos gastos com
sade pblica, possibilitando um redirecionamento de verbas para outros setores, como
educao e previdncia. Cabe aqui ainda ressaltar que a adio de biodiesel ao petrodiesel, em
termos gerais, melhora as caractersticas do combustvel fssil, pois possibilita a reduo dos

nveis de rudo e melhora a eficincia da combusto pelo aumento do nmero de cetano

(Moreira et al., 2006; Ramos et al., 2003).
Para garantir o cumprimento dessas metas, o governo federal incentiva a produo de

biodiesel atravs do fornecimento de um selo social para os produtores que adquirem a
matria-prima em cooperativas. Esse selo, alm de garantir isenes fiscais, melhora as
condies de financiamento em bancos pblicos (Pousa et al., 2007).
Alm do selo social, para estimular o mercado de biocombustveis antes da

obrigatoriedade de seu uso, o governo idealizou leiles de biodiesel, sob responsabilidade da
Agncia Nacional de Petrleo e Gs Natural, ANP, onde a PETROBRAS assegura a compra
do volume necessrio de Biodiesel para o B2 das empresas com o selo social. Houve cinco
leiles entre 2005 e 2006 (Pousa et al., 2007).
2.2. Matrias Primas
A matria-prima escolhida para a produo de biodiesel varia muito de acordo com a

regio. Qualquer lipdeo de origem animal ou vegetal deve ser considerado como adequado
para produo de biodiesel, dependendo da disponibilidade, custo, propriedades de
armazenamento e do desempenho como combustvel. A escolha da matria-prima pode sofrer
tambm influncia do governo que fornece incentivos fiscais para produo a partir de uma
determinada matria-prima em detrimento de outras. O Brasil, por exemplo, apesar de ser o
segundo maior produtor mundial de soja, incentiva a produo de biodiesel de leo de
mamona, devido o mercado para o leo de soja j ser bem estabelecido, enquanto o
aproveitamento do leo de mamona para o mercado de biodiesel poder facilitar a gerao de
renda nas regies mais pobres do pas, onde a soja no pode ser cultivada (Knothe et al,
2006).
O uso de leos vegetais e animais para produo de biodiesel tambm interessante

por se tratar de um composto renovvel e por seu uso sustentado no provocar danos ao meio
ambiente, contribuindo assim para o sucesso do protocolo de Kyoto. Recentes levantamentos
demonstram que apenas 2,2% da energia consumida no mundo proveniente de fontes

renovveis, o que evidencia um extraordinrio potencial para explorao de outras fontes.

Considerando-se apenas a biomassa proveniente de atividades agroindustriais, calcula-se que
o potencial combustvel desse material seja equivalente a, aproximadamente, 6.587 milhes
de litros de petrleo ao ano (Ramos et al., 2003).
Os leos vegetais so substncias hidrofbicas, obtidas pela prensagem ou por

extrao das sementes de oleaginosas, constitudos, principalmente, por triglicerdeos com
pequenas quantidades de mono e diglicerdeos, alm de cidos graxos livres, fosfolipdeos,
esteris, gua e outras impurezas que afetam a reao de transesterificao quando se usa
catalisador bsico ou cido, dificultando a separao do glicerol (co- produto). Eles so
lquidos a temperatura ambiente, altamente viscosos, com baixa volatilidade, carter
poliinsaturado e combusto incompleta, o que inviabiliza o seu uso direto nos motores
(Demirbas, 2007; Felizardo et al., 2006; Ma et al., 1999; Ramos et al., 2003).
O Brasil, um pas de grande biodiversidade, considerado um paraso para a produo

de biomassa para fins alimentares, qumicos e energticos. Estudos divulgados pelo National
Biodiesel Board encarregado da implementao do biodiesel nos Estados Unidos afirmam
categoricamente que o Brasil tem condies de liderar a produo mundial de biodiesel,
promovendo a substituio de, pelo menos, 60% do leo diesel consumido no mundo
(Holanda, 2004).
O aproveitamento energtico dos leos vegetais como combustvel, alm dos

benefcios ambientais j comprovados, pode favorecer lugares menos favorecidos com o
aumento da oferta de empregos, culminado com a valorizao do campo e do trabalhador
rural. A regio semi-rida do Brasil, por exemplo, que abrange quase todos os estados do
Nordeste e o norte de Minas Gerais, so regies bastante castigadas pelas secas e com um
grande nmero de pessoas vivendo na linha da pobreza. Nessa regio, as culturas energticas
podem se basear em lavoura de sequeiro, isto , sem irrigao. o caso da mamona e do
algodo, que podem conviver com regime pluviomtrico do semi-rido. Portanto, a grande e
forte motivao para um programa de biodiesel no Nordeste reside na possibilidade de
erradicar ou diminuir a misria do campo por meio de assentamentos familiares (Holanda,
2004). A Tabela 2.2 mostra as principais oleaginosas cultivadas nas cinco regies brasileiras.
Acredita-se que as regies mais carentes do Brasil podero vir a ser grandes
produtoras de biodiesel. A demanda mundial por combustveis de origem renovvel ser

crescente, e o Brasil tem potencial para ser um grande exportador mundial, principalmente no
contexto atual de mudanas climticas (Holanda, 2004).
Tabela 2.2: Distribuio espacial das principais fontes de oleaginosas pelas regies do Brasil
CENTRO-OESTE NORDESTE NORTE SUDESTE SUL
ALGODO X X X X
BABAU X X
COCO X
COLZA X X
DENDE X X
GIRASSOL X X X
MAMONA X X X
SOJA X X X X X
Fonte: RAMOS, et al., 2003.
Uma outra matria-prima que pode ser utilizada para produo de biodiesel so as
gorduras animais, mas ainda no h muitos estudos com esse substrato e os mtodos de
produo a partir dessas substncias so diferentes dos usados com leo vegetal devido s
gorduras possurem propriedades qumicas diferentes (so slidos a temperatura ambiente e
possuem uma quantidade maior de cidos graxos saturados) (Ma et al., 1999). Essa matria-
prima geralmente mais barata que os leos refinados porque, ao invs de um produto
primrio, representam um subproduto da agroindstria animal, e porque a demanda por este
produto menor do que a maioria dos leos vegetais mais comuns. Alm do elevado teor de
cidos graxos saturados, elas possuem ponto de fuso relativamente alto, uma propriedade
que, a baixas temperaturas, pode levar a precipitao e a um baixo desempenho do motor. Do
lado positivo, o biodiesel derivado de gorduras animais, devido ao seu alto teor de steres de
cidos graxos saturados, geralmente apresenta nmero de cetano superior ao observado em
biodiesel de leo vegetal (Knothe et al, 2006).
At aqui, conclui-se que o biodiesel totalmente benfico, preservando o meio

ambiente e contribuindo com o desenvolvimento econmico e social de regies carentes do
planeta. Apesar disso, h frentes que so contra o desenvolvimento desse biocombustvel,
alegando que ele compete com a produo de alimentos, que deve ser prioritria. Para se ter
uma idia, segundo uma matria constante no site do jornal nacional, o preo do leo de soja
aumentou para o consumidor final, mesmo o Brasil sendo o segundo maior produtor desse

gro em todo o mundo. Uma das justificativas dadas na reportagem que o leo de soja tem
sido usado para produo de biodiesel.
Contradies aparte, o biodiesel enfrenta uma grande barreira a sua comercializao: o

custo da matria-prima quando se usa leo refinado. O biodiesel produzido a partir de leos
vegetais de grau alimentcio no apresenta viabilidade econmica em relao ao petrodiesel,
mesmo usando o mais barato dos leos, uma vez que essa matria-prima que representa
cerca de 70 a 85% do custo total de produo (Bonetti et al., 2007; Knothe et al., 2006).
Da o grande nmero de pesquisas com leos usados em frituras industriais e

residenciais, uma matria-prima mais barata, cuja produo crescente em todo o mundo e
que , normalmente, disposta indiscriminadamente no meio ambiente, como nos esgotos das
cidades, contaminado guas, ou ento, integram a cadeia alimentar quando so vendidos como
complemento de rao animal, tornando-se assim a causa de muitos problemas de sade
humana, uma vez que, durante a fritura, alguns componentes nocivos so formados. (Costa
Neto et al., 2000; Felizardo et al., 2006; Kulkarni et al., 2006).
Devido ao grande nmero de estabelecimentos comerciais que fazem uso de leos e

gorduras, fica difcil fazer um levantamento preciso da disponibilidade desse resduo em
grandes centros urbanos. Muitos pases desenvolvidos tm estabelecido polticas que
penalizam a disposio de leo residual em esgotos. No Japo, por exemplo, 500.000
toneladas de leo residual so descartadas anualmente. Entretanto, em algumas cidades j h
um programa de coleta desses leos para transform-los em biodiesel e us-lo no transporte
pblico (Costa Neto et al., 2000; Felizardo et al., 2006; Kulkarni et al., 2006, Shimada et al.,
2002).
Vrios autores reportam a viabilidade tcnica e ambiental da utilizao de leo usado

para produo de biodiesel. Kulkarni et al. (2006), publicaram que os motores que
funcionaram com o biodiesel obtido de leo de fritura apresentaram um melhor desempenho e
a sua queima emite menos CO2, materiais particulados e gases do efeito estufa. Segundo
Costa Neto et al. (2000), a significativa reduo de fumaa, obtida em teste com biodiesel de
leo usado, demonstrou que vale a pena reutilizar o leo descartado de frituras para produo
desse biocombustvel, fornecendo um destino mais adequado para esse poluente. No entanto,
identificou-se tambm a necessidade de um eficiente sistema de coleta de leos usados para
que a substituio do leo diesel mineral por biodiesel de leo residual alcance o patamar

desejado, o que em termos gerais, ser de grande contribuio para o meio ambiente (Utlu et
al., 2007; Yagiz et al., 2007).
No estudo da produo de biodiesel a partir de leos residuais, verificou-se que os

leos apresentavam uma composio variada de cidos graxos livres, dos quais 40%
correspondiam ao cido olico. Dessa forma o cido olico um dos cidos carboxlicos que
ocorre em grandes quantidades na maioria dos lipdeos, sendo, portanto, responsvel por
grande parte da acidez livre em matrias residuais (Lucena, 2008).
Devido as transformaes qumicas e fsicas pelas quais os leos passam durante a

fritura, necessrio uma modificao das tecnologias existentes para produo de um
biodiesel de qualidade aceitvel. Os cidos graxos livres no so transformados em biodiesel
pela alcolise alcalina, o mtodo mais convencional. Por isso, matrias-primas cidas
requerem processamento distinto do empregado em leos e gorduras refinadas. A catlise
cida foi examinada, mas temperaturas muito altas, elevado excesso estequiomtrico de lcool
e longos tempos de reao foram necessrios (Al-Zuhair et al., 2007; Knothe et al, 2006). J a
catlise enzimtica apresenta-se como uma alternativa promissora para a alcolise de
matrias-primas com alto teor de cidos graxos livres (Akoh et al., 2007).
2.3. Mtodos de Obteno de Biodiesel
Em virtude da inviabilidade do uso direto de leos vegetais nos motores de injeo

direta e indireta, movidos a diesel, vrios estudos tm sido conduzidos para desenvolver
derivados de leos vegetais, cujas propriedades e desempenho se aproximem do leo diesel
mineral.
Dentre os principais mtodos de transformao de leos vegetais, destacam-se a

microemulsificao, a pirlise, a esterificao e a transesterificao.

2.3.1. Microemulsificao
Uma microemulso definida como uma disperso isotrpica, termodinamicamente

estvel, de leo, gua, surfactante e geralmente uma molcula pequena anfiflica, denominada
cosurfactante (Fukuda et al., 2001).
Apesar das microemulses apresentarem boas caractersticas, verificou-se que em

longo prazo provocam a decomposio de carbono no motor, combusto incompleta e
aumento da viscosidade dos leos lubrificantes (Urioste, 2004).
2.3.2. Pirlise
A pirlise, ou craqueamento trmico, um processo onde ocorre uma ruptura da

estrutura molecular original de um determinado composto pela ao do calor, na ausncia de
ar ou oxignio, a temperaturas superiores a 450 oC, geralmente auxiliado por um catalisador,
de modo a gerar molculas menores. Catalisadores tpicos para serem empregados na pirlise
so o xido de silcio SiO2 e o xido de alumnio Al2O3 (Holanda, 2004; Ma et al., 1999).
O equipamento para pirlise ou craqueamento trmico caro e os produtos resultantes

desse processo so de difcil caracterizao devido ao grande nmero de reaes que ocorrem
e devido ao grande nmero de produtos que so formados, tais como alcanos, alcenos,
alcadienos, cidos carboxlicos e aromticos, dependendo da fonte do leo vegetal
decomposto. Contudo, apesar dos leos vegetais pirolisados apresentarem concentraes
satisfatrias de enxofre, gua, sedimentos e cobre, so inaceitveis os nveis de cinzas,
resduos de carbono e o ponto de ignio alcanado. Embora o produto da pirlise seja
quimicamente semelhante ao diesel mineral, a remoo do oxignio durante o processo
trmico elimina qualquer benefcio ambiental do produto e geralmente produz um

combustvel mais prximo da gasolina que do diesel (Al-Zuhair et al., 2007; Fukuda et al.,
2001; Holanda, 2004; Ma et al., 1999; Ranganathan et al., 2007; Urioste, 2004).
2.3.3. Esterificao
Outro mtodo para produo de biodiesel atravs da reao de esterificao, em que

um cido graxo reage com um lcool, a elevadas temperaturas, e auxiliada por um
catalisador cido, geralmente cido sulfrico, fornecendo, alm dos steres alqulicos, gua
como subproduto. Esse processo de obteno de biodiesel , normalmente, muito utilizado
industrialmente como uma etapa de pr-tratamento para matrias-primas de elevada acidez
livre, geralmente leos residuais, efluentes graxos e matrias-primas com elevado teor de
cidos graxos na sua composio, como por exemplo, leo de babau (Marchetti et al., 2007).
No entanto, quimicamente, a reao de esterificao exige elevadas concentraes de

lcool para se alcanar converses significativas. Vrios pesquisadores do processo informam
que a mnima razo molar de lcool/cido graxo necessria deve ser de pelo menos 9:1, ou
seja, um excesso estequiomtrico de 800%, uma vez que a relao estequiomtrica entre o
cido graxo e o lcool de 1:1. Esse problema deve-se principalmente pela gua formada ao
longo da reao, pois desativa o catalisador (H+) presente no meio, favorecendo a reao
inversa de hidrolise. Entretanto, essa reao de esterificao tambm pode ser catalisada
enzimaticamente. Dados da literatura comprovam a viabilidade do uso de lipases na
esterificao de matrias-primas de elevada acidez livre em propores estequiomtricas e em
condies brandas de temperatura (Kulkarni et al., 2006). A seguir, a Figura 2.1 mostra o
mecanismo da esterificao enzimtica.

Figura 2.1 Mecanismo da esterificao enzimtica com etanol.
Inicialmente ocorre uma adio nucleoflica para formar o complexo enzima-substrato

(ES). O nuclefilo o oxignio da hidroxila da enzima que ataca o carbono da carbonila do
cido graxo, e o par de eltrons do grupamento amino da enzima captura o hidrognio da

hidroxila. Em seguida, o par de eltrons do oxignio do cido graxo no complexo enzima-

substrato captura o hidrognio do grupamento amino, liberando uma molcula de gua (grupo
abandonador) e formando um composto intermedirio enzima acetilada (E-Ac). Esse
composto intermedirio sofre ento o ataque do tomo de oxignio do lcool que adicionado
ao tomo de carbono da carbonila do composto intermedirio, e o par de eltrons do
nitrognio captura o hidrognio da hidroxila do lcool, formando o composto enzima
acetilada-lcool (E-AcA). Finalmente, o prton transferido do cido conjugado da amina
para o tomo de oxignio do complexo, liberando o ster alqulico e reconstituindo a enzima
(Al-Zuhair et al., 2007).
2.3.4. Transesterificao
A reao de transesterificao s acontece na presena de um catalisador, que pode ser

cido (esterificao), bsico ou enzimtico. A alcolise alcalina, cujo catalisador ,
geralmente, hidrxido de sdio ou de potssio, o processo mais usado industrialmente,
produzindo, alm do produto de interesse (steres alquilcos), subprodutos tais como glicerol
(tambm conhecido como glicerina), gua e sabo (Salis et al., 2005)
Figura 2.2 Reao de transesterificao, onde R representa a cadeia carbnica dos cidos graxos e R
a cadeia carbnica do lcool reagente.

Essa reao ocorre em etapas, tendo mono e diglicerdeos como produtos

intermedirios (Felizardo et al., 2006; Marchetti et al., 2007; Saad, 2005). A Figura 2.3, a
seguir, mostra o mecanismo da transesterificao enzimtica com etanol.
Fi
gura 2.3 Mecanismo da transesterificao enzimtica com etanol.

Comparando as Figura 2.1 e 2.3, o mecanismo basicamente o mesmo, sendo a

principal diferena o substrato e os produtos intermedirios produzidos. Na transesterificao,
o substrato um triglicerdeo (leo vegetal de baixa acidez livre) e ao invs de gua, os sub-
produtos formados so glicerol, diglicerdeos e monoglicerdeos.
Os lcoois preferencialmente usados nesse tipo de reao so lcoois de cadeia curta

tais como o metanol, etanol, propanol, butanol ou lcool amlico. Os lcoois mais utilizados
so o metanol e o etanol, principalmente pelo seu baixo custo, suas propriedades fsico-
qumicas (menor cadeia carbnica) e grande disponibilidade na Europa, Japo e Estados
Unidos (Lu et al., 2007; Ma et al., 1999; Marchetti et al., 2007; Urioste, 2004). Devido
elevada hidrofilicidade do metanol, ao se utilizar esse lcool, as reaes enzimticas so
efetuadas em meio solvente orgnico. Outra desvantagem do metanol que quando usado
em excesso pode inativar a enzima (Al-Zuhair et al., 2006).
No Brasil, o etanol tem fora natural desde que o pas se tornou um dos maiores
produtores mundiais, com uma tecnologia de produo bem estabelecida, grande capacidade
industrial, com plantas instaladas em todo o pas e devido ao fato de o etanol ser obtido de um
recurso renovvel (Faccio, 2004).
Apesar de o etanol ser menos reativo do que o metanol, ele tem a vantagem de ser
menos txico e de evitar a adio de solvente orgnico em reaes enzimticas, o que
viabiliza o processo de obteno de biodiesel com reduo de custos com solventes e com
consumo de energia (Urioste, 2004). Alm disso, ao se usar o etanol de origem vegetal, a
emisso de dixido de carbono decorrente da combusto do biodiesel reabsorvida na ntegra
pela fotossntese, durante o crescimento das prximas safras das biomassas das quais se
produz o lcool e o leo, ou seja, o etanol mais ambientalmente correto do que o metanol
(Akoh et al., 2007).
Apesar dos altos rendimentos conseguidos em um curto espao de tempo quando se

realiza uma transesterificao qumica, o alto gasto energtico com as elevadas temperaturas e
as dificuldades de recuperao do catalisador e dos subprodutos so as principais
desvantagens da rota qumica convencional (Lu et al., 2007; Shimada et al., 1999).

De acordo com a Figura 2.2, para que a reao de transesterificao ocorra

estequiometricamente, so necessrios 3 moles de lcool para cada mol de triglicerdeo. O
rendimento dessa reao depende de diversos fatores, tais como:
A razo molar entre o leo e o lcool, pois como a reao de transesterificao

reversvel, geralmente ela feita com excesso de lcool para favorecer a formao dos
steres alqulicos (Ma et al., 1999; Marchetti et al., 2007; Saad, 2005; Urioste, 2004).
Na catlise enzimtica, no entanto, alguns autores alcanaram boas converses na
proporo estequiomtrica, uma vez que o excesso de lcool pode provocar a
inativao da enzima (Kose et al., 2002, Oliveira et al., 2004; Samukawa et al., 2000);
A temperatura tambm outro fator importante que varia em funo dos tipos de leo
e do catalisador. A metanlise alcalina, por exemplo, ocorre entre 20-35 oC (Urioste,
2004). Em relao a catlise enzimtica, dependendo da fonte da enzima e do suporte
na qual ela foi imobilizada, temperaturas elevadas podem desnatura-la.
O tipo de catalisador. Os catalisadores possveis so os cidos (H2SO4, HCl, H3PO4),
as bases (KOH, NaOH) ou as enzimas (lipases). A catlise alcalina muito mais
rpida do que a cida, contudo, quando se utilizam leos residuais com elevado teor de
gua e de cidos graxos livres, a catlise cida mais indicada (esterificao) (Ma et
al., 1999; Urioste, 2004);
A concentrao de cidos graxos livres e de gua nos leos quando a reao
catalisada por catalisador bsico (NaOH). O contedo de gua e de cidos graxos
livres nos reagentes deve ser baixo, pois a reao inversa de hidrlise pode ser
favorecida e podem ser formados sabes no processo, o que aumenta a viscosidade
final do produto, dificulta a separao do glicerol e diminui o rendimento em steres
(Fukuda et al., 2001; Ma et al., 1999; Marchetti et al., 2007; Urioste, 2004);
Como j mencionado anteriormente, a reao de alcolise pode ser conduzida por

vrios tipos de catalisadores e, dependendo do catalisador escolhido, h vantagens e
desvantagens, e no que se refere ao uso de leos residuais de elevada acidez livre,
catalisadores alcalinos no so indicados, pois esses cidos neutralizam a ao cataltica e
favorecem a formao de sabo, diminuindo o rendimento da reao. Esse comportamento
dos catalisadores alcalinos frente a matrias-primas cidas confirmado no trabalho de Malta
et al. (2007). Segundo os resultados apresentados por esse autor, em nenhum momento o
produto da reao, ster etlico, foi obtido quando da utilizao de hidrxido de sdio, pois a

base, em todas as concentraes testadas, foi consumida na sua totalidade pelo excesso de
acidez. Entretanto, ao se utilizar lipases como catalisadores, obtiveram-se nveis de converso
de at 82%.
A produo de biodiesel por biotransformao, ou catlise enzimtica, tem sido alvo

de muitos estudos nos ltimos anos pela possibilidade concreta de recuperao e reutilizao
do catalisador ao usar enzima imobilizada, por permitir a recuperao simples do glicerol, por
eliminar os problemas de ndice de acidez com a total converso dos cidos graxos livres
presentes no glicerdeo (eliminando a etapa de pr-tratamento numa catlise convencional),
pelo uso de condies brandas no processo e pela tendncia de obteno de elevados
rendimentos em meios constitudos de leo e lcool em propores estequiomtricas,
comportamento este no observado na rota qumica (Akoh et al., 2007; Marchetti et al., 2007;
Vieira et al., 2006; Silva et al., 2004). Entretanto, o custo de produo desse catalisador
significativamente maior do que um catalisador qumico (Felizardo et al., 2006). A Tabela 2.3
mostra uma comparao entre a catlise qumica a catlise enzimtica.
Tabela 2.3: Comparao entre a catlise qumica e a catlise enzimtica para produo de biodiesel
Catlise Qumica Catlise Enzimtica
Temperatura de reao (oC) 60 - 70 30 40
cidos graxos livres no leo Produtos saponificados steres

no refinado
gua na matria-prima Interferncia na reao Interferncia na reao
Rendimento em steres Alto Alto

alqulicos
Recuperao do glicerol Difcil Fcil
Purificao de steres Lavagens consecutivas Nenhuma
Reutilizao do catalisador Nenhuma (quando catlise Fcil (quando

homognea) imobilizado)
Fonte: URIOSTE, D. 2004.

2.4. Catlise Enzimtica
Catlise enzimtica ou biotransformao refere-se a modificaes especficas ou

interconverses na estrutura qumica de uma substncia, realizadas por enzimas presentes nas
clulas ou na forma isolada (Dalla-Vecchia et al., 2004).
A aplicao de biocatalisadores na indstria objeto de muitas investigaes, devido

alta atividade cataltica em comparao com os catalisadores convencionais, a sua alta
especificidade e ao fato de atuarem com alta eficincia em condies reacionais bastante
suaves (Dalla-Vecchia et al., 2004).
O interesse industrial por tecnologias enzimticas vem aumentando gradativamente,

principalmente, nas reas de engenharia de protenas e enzimologia em meios no
convencionais, as quais ampliaram consideravelmente o potencial de aplicao das enzimas
como catalisadores em processos industriais. Entre os processos de maior interesse esto as
reaes de hidrlise, sntese e transesterificao de lipdeos por meio das lipases. As razes do
enorme potencial biotecnolgico dessa enzima incluem fatos relacionados com: i) sua alta
estabilidade em solventes orgnicos; ii) no requerem a presena de co-fatores; iii) possuem
uma larga especificidade pelo substrato e, iv) exibem uma alta enantiosseletividade (Carvalho
et al., 2003; Castro et al., 2004).
Embora, atualmente, as aplicaes industriais de lipases estejam concentradas nas

indstrias de detergentes, novas aplicaes vm se estabelecendo nos mais diversos campos,
tais como indstria farmacutica, qumica fina, cosmticos, oleoqumica, couros, polpa de
celulose e papel, tratamento de resduos industriais e mais recentemente na produo de
combustiveis. Alguns autores j afirmam que no futuro as lpases sero os catalisadores
escolhidos para produo de biodiesel (Akoh et al., 2007). As lipases vm, deste modo,
conquistando uma faixa crescente do mercado de enzimas industriais (Castro et al., 2004).
No que se refere produo de combustveis, um biocombustvel pode ser obtido a

partir de leos e gorduras atravs de modificaes qumicas dos cidos graxos (hidrogenao),
pela reverso da ligao ster (hidrlise) e reorganizao dos cidos graxos na cadeia
principal do triglicerdeo (transesterificao) (Castro et al., 2004).

Sem levar em considerao os outros processos existentes, como hidrogenao e

fracionamento, pode-se afirmar que as limitaes para obteno desses produtos esto
associadas aos tipos de catalisadores qumicos empregados, que so pouco versteis e
requerem altas temperaturas para atingir razovel velocidade de reao. Alm disso,
possuindo baixa especificidade, geralmente fornecem produtos de composio qumica mista
ou contaminada, que requerem uma etapa posterior de purificao, aumentando os custos de
produo (Castro et al., 2004).
Nesse sentido, o enfoque biotecnolgico apresenta-se com uma alternativa promissora

que atende aos apelos atuais da Qumica Verde, reduzindo o impacto ambiental pela
minimizao dos resduos gerados nos processos qumicos convencionais, fornecendo
maiores rendimentos, obtendo produtos biodegradveis com menor consumo de energia
(Castro et al., 2004; Silva et al., 2004).
Os leos e gorduras so matrias-primas versteis para aplicao da biotransformao,

sendo inmeros os processos implementados em escala comercial. A escolha do tipo de
biocatalisador efetuada entre os microrganismos vivos ntegros ou outros materiais
biolgicos como RNA, anticorpos ou enzimas isoladas ou contidas em clulas. O uso de
enzimas isoladas prefervel, quando existem limitaes com relao a permeabilidade do
substrato na membrana da clula, ou quando ocorrem reaes secundrias indesejveis
(Castro et al., 2004).
2.4.1. Lipase
As enzimas so substncias biodegradveis, que tornam os processos de produo

industrial mais eficientes e, geralmente, menos dispendiosos, proporcionado obteno de
produtos de qualidade superior. Elas so catalisadores biolgicos, desde a sntese de
intricados compostos at a quebra de complexas molculas. Como catalisadores, elas
permanecem intactas ao final da reao, quando imobilizadas e quando no so desnaturadas
por algum fator. As enzimas so altamente especficas (o que evita reaes paralelas

indesejveis) e, sendo protenas, so 100% biodegradveis, o que as torna ambientalmente

inofensivas.
No incio da utilizao de enzimas em processos industriais, elas tinham pouca

utilidade porque se acreditava que somente o meio aquoso era propcio para manter a
conformao estrutural cataliticamente ativa. Entretanto, sabe-se atualmente que muitas
enzimas (ou complexos enzimticos) so cataliticamente ativas em ambientes hidrofbicos,
com eficincia similar quela encontrada em solues aquosas, ou em certos casos at
superior. Acredita-se que as enzimas sejam cataliticamente ativas em meio orgnico porque
permanecem na sua forma original, e no se desdobram em meio no-aquoso. Apesar disso, as
enzimas necessitam de uma pequena quantidade de gua para reter sua conformao
tridimensional ativa, mesmo quando esto ligadas covalentemente a um suporte. A gua
contribui para integridade estrutural, polaridade do stio ativo e estabilidade da protena e
pode limitar a solubilidade de substratos hidrofbicos em torno da enzima.
Atualmente, mais de 3000 diferentes enzimas tem sido identificada e muitas isoladas
em sua forma pura. Vrias tem sido obtidas na forma cristalina e a seqncia de aminocidos,
bem como a estrutura tridimensional determinadas atravs de cristalografia de raios-X e
RMN-2D (Dalla-Vecchia et al., 2004).
A nomenclatura das enzimas feita baseada no substrato sobre o qual atuam,

acrescentando o sufixo ase. Por exemplo, as lipases so enzimas que atuam sobre os lipdeos.
A Unio Internacional de Bioqumica e Biologia Molecular (IUBMB) divide as enzimas em
seis grandes classes (Tabela 2.4), e cada uma em subclasses de acordo com o tipo de reao
que as mesmas catalisam (Saad, 2005).
De acordo com a Tabela 2.4, as lipases (triglicerol acil-hidrolases, EC 3.1.1.3) so

classificadas como hidrolases e atuam sobre a ligao ster presentes em acilgliceris,
liberando cidos graxos e glicerol, constituindo uma classe especial de estereases. A
diferenciao entre uma lipase e uma esterease (EC. 3.1.1.1) est no fato de que a primeira
catalisa reaes de substratos insolveis em gua, enquanto que uma esterease age em
substratos solveis (Cruz Junior et al., 2007; Linko et al., 1998).

Tabela 2.4 - Classificao das enzimas de acordo com a IUBMB

Nmero Classe Tipo de reao catalisada Subclasse
1 Oxidoredutases Reaes de oxidao e reduo de Hidrogenases, oxidases,
ligaes do tipo C-H, C-C, e C=C peroxidases, etc.
2 Transferases Transferncia de grupos aldedico, Transaldolases,

cetnico, acila, fosforila ou metila transcetolases, etc
3 Hidrolases Hidrlise de steres, amidas, lactonas, Esterases, lipases,

lactamas, epxidos, nitrilas, anidridos peptidases, fosfatases,
e glicosdeos etc.
4 Liases Adio-eliminao de grupos a dupla Descarboxilases,

ligao ou formao de duplas cetocidoliases,
ligaes por remoo de grupos hidroliases.
5 Isomerases Transferncia de grupos dentro da Racemases, epimerases,

molcula para produzir ismeros etc.
6 Ligases Formao e clivagem de ligaes C-C, Sintetases

C-S, C-O e C-N e steres de fosfato
Fonte: SAAD, E.B. 2005.
Entretanto, a diferenciao entre lipases e estereases ainda no est completamente

definida. Em 1958, Sarda e Desnuelle propuseram definir as lipases a partir de sua
caracterstica cintica, que a propriedade de ativao na presena de substratos insolveis
em gua e emulsionados, ou seja, na presena de uma interface lipdeo/gua. Segundo estes
autores, as lipases seriam ativadas na presena de steres emulsionados, enquanto as
estereases no apresentariam esta ativao, exercendo sua funo hidroltica sobre substratos
solveis em gua (Dalla-Vecchia et al., 2004).
As lipases so comumente encontradas na natureza em tecidos animais, vegetais e

microbianos, sendo produzida, preferencialmente, por fermentao usando vrias espcies de
microrganismos, tais como os fungos Aspergillus mucor, Rhizopus penicillium, Geotrichum
sp, por leveduras de Tulopis sp e Candida sp e bactrias como Pseudomonas sp,
Achromobacter sp e Staphylococcus sp. Em funo do baixo rendimento do processo
fermentativo, as lipases microbianas tinham tambm um custo bem mais elevado quando
comparado com outras hidrolases, como proteases e carboxilases. Entretanto, os recentes
avanos registrados na tecnologia do DNA tm permitido aos fabricantes de enzimas

colocarem no mercado lipases microbianas com atividade bem elevada, a um custo bem mais
acessvel. Atualmente, lipases microbianas so produzidas por diversas indstrias, como
Novozymes, Amano, Gist Brocades, entre outras. Uma publicao recente sobre a
disponibilidade comercial de lipases listou enzimas de 34 diferentes fontes, incluindo 18 a
partir de fungos e 7 de bactrias (Castro et al., 2004; Dalla-Vecchia et al., 2004).
O stio cataltico formado pela trade cataltica Ser-His-Asp/Glu, que se repete em

todas as estruturas e frequentemente protegido na molcula por uma tampa hidrofbica ou
lid que ao interagir com a interface lipdeo/gua sofre uma mudana conformacional,
expondo o stio ativo. A presena da tampa tampa na estrutura da enzima e a propriedade de
ativao interfacial passaram a ser fatores determinantes para a caracterizao das lipases.
Estudos de raio-X realizados por Uppenberg et al.(1994) com lipase de Cndida antarctica
revelou a existncia de uma tampa similar recobrindo a trade cataltica Ser-His-Asp (Petkar
et al., 2006; Uppenberg et al., 1994).
Mais recentemente, entretanto, observou-se que a presena da tampa no est

necessariamente correlacionada com a ativao interfacial, sendo que as lipases de
Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia glumae e Cndida antarctica B, que apresentam
tampa em suas estruturas, no sofrem ativao interfacial. Por outro lado, as cutinases,
enzimas consideradas lpases verdadeiras, no apresentam a tampa e no precisam da
interface para exercer a atividade hidroltica (Dalla-Vecchia et al., 2004). Esta observao
sugere que a presena de uma tampa dominante e a ativao interfacial no so critrios
adequados para classificar uma enzima como lipase. Portanto, a definio atual bastante
simples: uma lipase uma carboxiesterase que catalisa a hidrlise de acilglicerol de cadeia
longa (Castro et al., 2004).
As lipases so muito utilizadas em sntese orgnica devido a sua grande

disponibilidade e baixo custo. Alm disso no requerem cofatores, atuam em uma faixa de pH
relativamente grande, so muito estveis nesse meio, apresentam especificidade,
regiosseletividade, quimiosseletividade e enatiosseletividade. Possuem habilidade de catalisar
reaes de esterificaes, interesterificaes, aminlise e tiotransesterificao (Dalla-Vecchia
et al., 2004; Tinge et al., 2006).
As reaes lipolticas ocorrem na interface gua-lipdeo podendo, em alguns casos,

impedir que as cinticas das reaes enzimticas sejam descritas pelas equaes de Michaelis-

Menten, que s so vlidas se a reao cataltica ocorrer em fase homognea. A tcnica de

camada nica tem sido usada extensivamente e, mais recentemente, a tecnologia gota-leo foi
proposta para estabelecimento da cintica da lipase, que monitorada pela anlise automtica
do perfil de uma gota de leo suspensa em gua; a reduo na tenso superficial entre leo e
gua causada pela hidrlise da lipase medida em funo do tempo (Castro et al., 2004).
O estudo cintico da reao de alcolise de leos vegetais catalisada por lpase ainda
limitado na literatura, mas os resultados desses estudos so importantes para o projeto de
reatores adequados e eficientes e para o controle e otimizao do processo e dos efeitos das
mudanas nas condies operacionais. A maioria dos estudos cinticos constantes na
literatura prope um modelo Ping-Pong bi-bi com inibio competitiva pelo lcool
(considerando lcoois de cadeia curta) (Al-Zuhair et al., 2006).
CHULALAKSANANUKUL et al. (1993) estudaram o mecanismo cintico da reao

de esterificao catalisada por lipase de Mucor miehei imobilizada em resina aninica
(Lipozyme IM) tendo o cido olico e etanol como substratos e hexano como solvente. Os
autores propuseram tambm o mecanismo Ping-Pong bi-bi, com inibio por excesso de
etanol (Faccio, 2004).
2.4.2. Enzimas Imobilizadas
Em reaes qumicas e bioqumicas, o uso de enzimas puras pode ser dispendioso e

seu descarte aps o uso economicamente invivel. Alm disso, as enzimas esto sujeitas a
inativao por fatores qumicos, fsicos ou biolgicos, podendo ocorrer quando estocadas ou
durante o uso. Para que a catlise seja eficiente em um determinado processo, h necessidade
de proteg-la da interao com o solvente, meio no qual so realizadas algumas reaes, pois
o mesmo poderia provocar a inativao, impossibilitando a catlise da reao. Frente a este
problema, novas tcnicas de imobilizao tm sido desenvolvidas para fornecer a estabilidade
das enzimas e facilitar sua recuperao e reutilizao (Cruz Junior et al., 2007).
O principal interesse em imobilizar uma enzima obter um biocatalisador com

atividade e estabilidade que no sejam afetadas durante o processo, em comparao com sua

forma livre. Idealmente, a enzima imobilizada dever exibir uma atividade cataltica superior.
Alm disso, no devem ocorrer alteraes estruturais, bem como modificaes no stio ativo.
A imobilizao pode inibir ou aumentar a atividade e estabilidade da enzima, porm no
existe uma regra que prediga a manuteno destes parmetros aps o processo de
imobilizao (Dalla-Vecchia et al., 2004).
A imobilizao pode ocorrer atravs da adsoro ou ligao da enzima em um material

insolvel, pelo uso de uma reagente multifuncional atravs de ligaes cruzadas,
confinamento em matrizes formadas por gis polimricos ou encapsulao atravs de uma
membrana polimrica (Dalla-Vecchia et al., 2004).
Para ser efetivo na imobilizao, o suporte deve deixar a enzima acessvel aos
substratos, manter sua atividade por um longo perodo e permitir que o sistema
(suporte/enzima) seja regenerado ao final do processo, sem que ocorram perdas na atividade
enzimtica (Dalla-Vecchia et al., 2004).
Uma outra vantagem de se imobilizar enzimas a possibilidade de reutiliz-la ao final

do processo, o que, em termos de produo de biodiesel, interessante porque pode reduzir os
custos da produo com aquisio da enzima, uma vez que ela pode ser recuperada e
reutilizada e pode ser imobilizada em suportes baratos como a quitosana, por exemplo (Salis
et al., 2005).
2.5. Consideraes Finais
De acordo com a literatura, a biotransformao enzimtica de leo vegetal residual,

objeto de interesse dessa dissertao, apresenta, alm de todas as vantagens j mencionadas
anteriormente, o diferencial da matria-prima no necessitar de um pr-tratamento, que
consiste em utilizar primeiro um catalisador cido para converter os cidos graxos livres em
seus respectivos steres e diminuir o nvel desses cidos no leo, e depois realizar uma
transesterificao alcalina (Kulkarni et al., 2006).

Embora os processos de alcolise enzimtica para obteno de biodiesel ainda no

sejam comercialmente desenvolvidos, novos resultados tm sido reportados em artigos e
patentes. O aspecto comum desses estudos consiste na otimizao das condies de reao
(solvente, temperatura, pH, enzima, entre outros), a fim de estabelecer as caractersticas para
aplicaes industriais. Contudo, tanto o rendimento, como o tempo de reao e o custo do
biocatalisador ainda so desfavorveis se comparados com o sistema de reao por catlise
bsica (Castro et al., 2004).
Por tudo o que foi exposto nessa reviso bibliogrfica, o presente trabalho visa estudar
a produo enzimtica de biodiesel a partir de leo residual e etanol, verificando a influncia
das variveis de processo e a cintica de reao, buscando a otimizao e a reduo de custos
na obteno de um produto de alto valor agregado.

Captulo 3 Materiais e Mtodos Costa Filho, E.H. 40
3. MATERIAIS E MTODOS
Este captulo mostra os reagentes e o procedimento experimental empregado no estudo

da alcolise enzimtica do cido olico e do leo vegetal residual, bem como a metodologia
de caracterizao da matria-prima e de anlise das amostras de steres etlicos (Biodiesel).
3.1. Substratos e Catalisador
Como o objetivo deste trabalho foi a obteno de um biocombustvel proveniente de

uma matria-prima residual e, como geralmente esses resduos possuem um elevado ndice de
acidez livre, estudou-se primeiramente a influncia das variveis de processo da etanlise
enzimtica do cido olico, e para confirmar a viabilidade do uso de lipases nesse tipo de
reao, realizaram-se alguns experimentos com dois leos residuais de diferentes ndices de
acidez.
Portanto, trs tipos de material lipdico foram utilizados para a reao de alcolise
enzimtica visando obteno de steres etlicos. So eles: cido olico comercial para
sntese (VETEC), leo de coco residual resultante do processo de destilao do leo da
empresa DUCCO e leo de algodo residual resultante do processo de fritura de castanhas
da empresa IRACEMA. lcool etlico comercial (VETEC, 99,8% de pureza) tambm foi
utilizado como substrato em todos os experimentos.
Como catalisador, utilizou-se uma lipase comercial imobilizada de Candida antarctica

tipo B (Novozym 435), gentilmente cedida pela Novozyme do Brasil (Araucria PR), cuja
atividade hidroltica era de 491,98 U/g. Tambm usou-se como catalisador um derivado
produzido pelo Grupo de Pesquisa e Desenvolvimento de Processos Biotecnolgicos
(GPBIO) do Departamento de Engenharia Qumica da Universidade Federal do Cear. Esse
derivado consiste em uma lipase de Candida antarctica tipo B (CALB) imobilizada em
quitosana, ativada com glicidol, etilenodiamina e glutaraldedo, cujo excesso de umidade foi
retirado por secagem com hexano na presena 3% de acido butrico. As condies de

imobilizao, ativao e secagem desse derivado foram as condies otimizadas por Silva (
2007). Foram imobilizadas 6 mg de protena / g de suporte, apresentando uma atividade
hidrolitica de 369,36 U/g.
3.2.Determinao da Atividade Hidroltica das Enzimas Imobilizadas
A determinao da atividade hidroltica da enzima foi descrita por Silva (2007).

Segundo o autor, a atividade lipsica pode ser quantificada pela hidrlise do
paranitrofenilbutirato (pNPB) em 2-propanol a 25 C com adio de 0,01g de lipase. Para esta
reao, um volume de 29mL de tampo fosfato de sdio 100 mM, pH 8,0, foi adicionado a
1,0 mL de soluo de pNPB 15 mM em 2-propanol num reator encamisado, provido de
agitao, sendo a reao iniciada pela adio da enzima. A variao da absorbncia a um
comprimento de onda de 410 nm foi monitorado por 7,5 minutos, retirando-se, para isso,
aproximadamente 2 mL do sobrenadante a cada 1,5 minutos sendo lido imediatamente no
espectrofotmetro. Uma unidade de atividade (U) foi definida como a quantidade de enzima
necessria para hidrolisar 1 mmol de pNPB por minuto, e as atividades foram expressas em
U/g.
3.3.Caracterizao Fsico-Qumica da Matria-Prima e do Biodiesel
Os steres obtidos a partir da alcolise de uma matria-prima lipdica s podem ser

considerados como biodiesel se atenderem a algumas exigncias, ou seja, se estiverem dentro
das especificaes regulamentadas pela Agncia Nacional de Petrleo (ANP). Para verificar
se o produto obtido estava dentro dessas especificaes, foram empregadas vrias
metodologias analticas descritas pela American Oil Chemists Society (A.O.C.S.) e pela
American Society for Testing and Materials (ASTM). A seguir, descrevem-se as anlises
realizadas na caracterizao da matria-prima e dos steres etlicos obtidos por sntese
enzimtica.

3.3.1. ndice de Acidez
O ndice de acidez revela o estado de conservao do leo e corresponde ao nmero de

miligramas de hidrxido de potssio (KOH) necessrio para neutralizar os cidos graxos
livres de um grama de gordura (em mg KOH/g). A decomposio dos glicerdeos acelerada
por aquecimento e pela luz, e a rancidez quase sempre acompanhada pela formao de cido
graxo livre. leos com elevada acidez livre so imprprios para o consumo humano e para
sua utilizao como combustvel, uma vez que a acidez livre tem ao corrosiva sobre os
componentes metlicos do motor. (Dantas, 2006)
Os mtodos de anlise do ndice de acidez e da porcentagem de cidos graxos livres

empregados nessa dissertao foram os mtodos Cd 3d-63 e Ca 5a-40, respectivamente, que
so descritos pela American Oil Chemists Society (A.O.C.S.).
Para o clculo do ndice de acidez, inicialmente neutralizou-se o solvente (lcool

etlico comercial) com uma soluo de hidrxido de sdio (NaOH) 0,25 N, utilizando uma
soluo de fenolftalena 1% em lcool como indicador. Em seguida, mediu-se cerca de 1 g da
amostra a ser analisada em um erlenmeyer de 250 mL, adicionaram-se 50 mL de etanol
neutralizado e 2 ou 3 gotas de fenolftalena, titulando em seguida com a soluo de NaOH
0,25 N, at que uma colorao levemente rsea persistisse por 15 segundos. Para amostras
cujo ndice de acidez era muito baixo, utilizou-se uma soluo de NaOH 0,1 N.
Feito esse procedimento e anotado a massa da amostra analisada e o volume de NaOH

gasto na titulao, fizeram-se os clculos de acordo com as Equaes 3.1 e 3.2.
V F N 56,11 (3.1)
IA(mgKOH / g ) =
M
V F N 28,2 (3.2)
AG (%) =
M

onde IA o ndice de acidez; V o volume gasto de NaOH na titulao; F o fator da

soluo de NaOH (sempre prximo de 1); N a normalidade da soluo de NaOH (mol/L);
M a massa da amostra utilizada e AG a porcentagem de cidos graxos livres, expressa
como cido olico, em leos comuns, brutos e refinados.
3.3.2. Densidade
A densidade relativa a 20 oC das amostras foi determinada segundo a norma ASTM D-

4052, utilizando-se um densmetro digital da marca Anton Paar, modelo DMA 4500. Aps a
calibrao do equipamento com gua destilada, mediu-se 5 mL de amostra e preencheu-se a
clula do densmetro para fazer a determinao da densidade. A leitura foi realizada
diretamente no visor do equipamento a 20 oC em g/cm3.
3.3.3. Teor de Umidade
A quantidade de gua presente nas amostras de substratos e steres etlicos foi medida
segundo o mtodo ASTM D-1744, utilizando um titulador Karl-Fischer da marca Metrohm,
modelo 795 KTF Titrino, com capacidade de detectar umidade na ordem de ppm com
preciso de 0,03%. O procedimento consistiu, primeiramente, em calibrar a soluo Karl-
Fischer com gua destilada para determinao do fator de soluo. Adicionou-se, em seguida,
aproximadamente 1 g da amostra a ser analisada, e aps um determinado perodo de tempo, o
teor de umidade lido no software Vesuv datalogger 1999.

3.3.4. ndice de Iodo
O ndice de iodo o nmero de miligramas de iodo absorvidos por 100 g de gordura e

reflete o grau de insaturao da amostra analisada. Os resultados obtidos por esse mtodo
dependem de fatores tais como: tempo de contato, soluo utilizada na determinao e o
excesso de iodo presente na soluo (Lucena, 2008).
Para anlise das amostras constantes nessa dissertao, utilizou-se o mtodo Cd 1-25
sugerido pela American Oil Chemists Society (A.O.C.S.). O procedimento consistiu em pesar
de 0,2 g a 1,0 g da amostra em erlenmeyers de 250 mL de boca esmerilhada, adicionando-se
em seguida 15 mL de tetracloreto de carbono e 25 mL de soluo de Wijs (soluo comercial
de iodo em cido actico glacial e tetracloreto de carbono). Deixou-se essa mistura reagir ao
abrigo da luz e a temperatura ambiente por 1 hora. Decorrido esse perodo de tempo,
adicionaram-se 20 mL de soluo de iodeto de potssio e 150 mL de gua destilada, titulando-
se em seguida com soluo de tiossulfato de sdio 0,1 N at o aparecimento de uma colorao
levemente amarela, quando ento adicionaram-se 2 mL de soluo indicadora de amido e
continuou-se a titulao com tiossulfato de sdio at o desaparecimento da colorao azul.
Para o clculo do ndice de iodo, utilizou-se a Equao 3.3:
(V B VT ) 1,27 F (3.3)
II =
M
sendo VT o volume gasto na titulao com tiossulfato de sdio 0,1 N; VB o volume gasto na
titulao do branco; F o fator da soluo de tiossulfato de sdio e M a massa da amostra
em gramas.

3.3.5. Glicerina Livre, Combinada e Total
A glicerina, ou glicerol, um subproduto resultante da reao de alcolise de

triglicerdeos. feita uma distino de dois tipos de glicerina: a glicerina livre e a glicerina
combinada. A glicerina livre o glicerol propriamente dito, um trilcool resultante da quebra
da molcula de triglicerdeo e da combinao com o lcool transesterificante. A glicerina
combinada, por sua vez, pode-se dizer que o prprio triglicerdeo, ou seja, no leo, antes da
reao, h 100% de glicerina combinada e 0% de glicerina livre, pois se tem somente
triglicerdeo e no se tem nada de glicerol. A medida que a reao prossegue e a molcula de
triglicris vai sendo quebrada, formando os steres lineares e o glicerol, a quantidade de
glicerina combinada (triglicerdeo) diminui e a quantidade de glicerina livre (glicerol)
aumenta. Portanto, a converso da reao medida em termos da diminuio da glicerina
combinada ou da formao de glicerol.
A determinao da glicerina nas amostras de leo e biodiesel seguiu o mtodo do

periodato de sdio de acordo com as normas NTB A-0104 e NTB A-0204, descritas por
Menzel (2004). Esse mtodo tambm tem sido utilizado por outros autores (Oliveira et al.,
2004). Durante o processo de anlise, a amostra contendo glicerina (livre e/ou combinada) foi
saponificada, liberando glicerina da sua forma de ster. Em seguida a glicerina foi separada da
parte graxa, por extrao com gua acidulada. A glicerina foi dosada na parte aquosa cida.
Quando a amostra saponificada foi a amostra bruta, a glicerina dosada a glicerina total.
O procedimento consistiu em medir cerca de 3 g da amostra (leo e/ou biodiesel)

diretamente num funil de separao tarado e seco. Adicionaram-se, em seguida, 20 mL de
gua destilada e 0,5 mL de cido sulfrico (H2SO4) 1:4 v/v, agitando-se manual e
vigorosamente. Feito isso, esperou-se a separao de fases, recolhendo a fase aquosa inferior
em um erlenemeyer de 250 mL para dosagem da glicerina livre. Pesou-se essa fase e metade
dela adicionaram-se 50 mL de soluo de periodato de sdio 5,5 g/L, 4 g de bicarbonato de
sdio e 1 a 2 g de iodeto de potssio, titulando-se em seguida com soluo de arsenito de
sdio 0,1 N at o desaparecimento da colorao amarela. A porcentagem de glicerina livre foi
calculada segundo a Equao 3.4.

A fase superior, para anlise da glicerina combinada, foi transferida para um balo de
fundo chato com o auxilio de 20 mL de gua destilada e 5 mL de lcool etlico. Ao balo foi
adicionado 3 mL de hidrxido de sdio 50% e essa mistura foi levada para aquecimento sob
refluxo, at que a colorao ficasse translcida. Esfriou-se o balo e o seu contedo foi
transferido para um balo volumtrico de 250 mL completando o volume com gua. Do
contedo do balo, transferiu-se uma alquota de 50 mL para um funil de separao de 250
mL, adicionando-se em seguida 10 mL de tolueno p.a., duas gotas de indicador de azul de
bromofenol 0,1 % e 2 mL de cido sulfrico 1:4 v/v, agitando at que a colorao mudasse de
azul para amarelo. Deixou-se separar as camadas, recolhendo a fase aquosa inferior em um
erlenmeyer de 250 mL e adicionaram-se 50mL de soluo de periodado de sdio 5,5 g/L, 4 g
de bicarbonato de sdio e 1 a 2 g de iodeto de potssio, titulando-se em seguida com soluo
de arsenito de sdio 0,1 N at a mudana da colorao azul para amarela. As porcentagens de
glicerina combinada e total foram calculadas segundo as Equaes 3.5 e 3.6, respectivamente.
(Vb V1 ) T 0,1 M total (3.4)

GL(%) =
m M alquota
(Vb V2 ) T 25 (3.5)
GC (%) =
m A
(Vb V3 ) T 25 (3.6)
GT (%) =
m A
sendo GL porcentagem de glicerina livre; GC a porcentagem de glicerina combinada; GT

a porcentagem de glicerina total; m a massa da amostra de leo e/ou biodiesel; Vb o
volume do branco; V1 , V2 e V3 so os volumes gastos nas titulaes; T o ttulo da soluo
de arsenito; M total a massa total da fase aquosa utilizada na anlise da glicerina livre;
M alquota a metade da massa total e A corresponde aos 50 mL transferidos do balo
volumtrico para o funil de separao na dosagem da glicerina combinada e total.

3.4. Caracterizao Cromatogrfica da Matria-Prima
A composio qumica em cidos graxos do cido olico e dos leos vegetais

residuais foi determinada fazendo-se a transesterificao da matria-prima com metanol, e
identificando-se quali-quatitativamente, por cromatografia gasosa, os steres metlicos
purificados resultantes do processo.
O equipamento utilizado foi um cromatgrafo a gs da marca Thermo Focus GC

acoplado a um espectmetro de massa, com uma coluna adsorvedora Column Capillary RTX-
5MS. As dimenses da coluna eram 15 m de comprimento, 0,25 mm de dimetro interno e
0,25 m de espessura do filme lquido. O fluxo da coluna foi de 0,5 mL/min, a temperatura do
detector foi de 200 oC, a temperatura do injetor foi de 250 oC e a temperatura do forno iniciou
em 50 oC, mantendo-se nessa temperatura por 2 minutos quando passou a aumentar 4 oC/min
at atingir 250 oC. O gs de arraste foi gs hlio e o volume de amostra injetado foi de 1 L.
Para realizao da reao de transesterificao dos substratos, adotou-se o

procedimento descrito por Silva (2005), com algumas modificaes. Mediu-se 1 g de cido
olico/leo vegetal em um balo de fundo chato. Adicionaram-se 25 mL do reagente de
saponificao, agitou-se vigorosamente e colocou-se para aquecer, sob refluxo, por 30
minutos. Depois esfriou-se o balo e adicionaram-se 25 mL do reagente de esterificao,
agitando-se vigorosamente e colocado-se para aquecer, sob refluxo, por mais 30 minutos.
Passado esse tempo, esfriou-se o balo e transferiu-se o seu contedo para um funil de
separao com o auxlio de 25 mL de ter de petrleo. Observou-se a formao de 3 fases.
Descartaram-se as duas fases inferiores e fase superior adicionaram-se 20 mL de soluo
saturada de cloreto de sdio. Dessa vez observou-se a formao de duas fases. Descartou-se a
fase inferior e transferiu-se a fase superior (steres etlicos) para um becker com sulfato de
sdio (para retirada de resqucios de gua). Filtrou-se o sulfato de sdio, recolhendo a soluo
em outro becker. Deixou-se evaporar, a temperatura ambiente, de um dia para o outro, e s
ento a soluo resultante foi injetada no cromatgrafo.

Reagentes:
Reagente de saponificao soluo de KOH 0,5 mol/L em etanol anidro;

Reagente de esterificao 3,30 g de NH4Cl + 100 mL de etanol anidro + 3 mL de
H2SO4 concentrado;
Soluo salina soluo aquosa de NaCl 30%;
ter de petrleo
Aps obtido os percentuais de cidos graxos presentes nas amostras, a massa molar
mdia do cido olico e dos leos vegetais foi calculado de acordo com as Equaes 3.7 e 3.8,
respectivamente.
( PM AGi W AGi ) (3.7)

PMM cido =
100
( PM AGi W AGi ) (3.8)

PMM leo = 3
100
sendo PMM cido a massa molar mdia do cido olico; PMM leo a massa molar mdia do
leo vegetal; PM AGi a massa molar do cido graxo e WAGi a porcentagem de cido graxo
presente na amostra analisada.

3.5. Alcolise Enzimtica do cido Olico e dos leos Vegetais Residuais Utilizando
Lipase como Catalisador
A matria-prima lipdica utilizada em todos os experimentos no passou por nenhum

tratamento prvio, apenas por uma simples filtrao para retirada de materiais particulados
quando da utilizao dos leos residuais.
Os experimentos foram realizados em erlenmeyers de 250 mL fechados com tampa de

vidro. A quantidade de cido/leo foi mantida fixa em 10 g em todos os experimentos, bem
como a quantidade de lipase foi fixada em 5% p/p, baseada na massa de cido/leo medida.
As quantidades de etanol foram pr-estabelecidas pelo planejamento de experimentos. O
intervalo de estudo das variveis procurou abranger a maioria dos estudos constantes na
literatura referentes a reao de alcolise enzimtica de leos vegetais.
Depois de calculada as quantidades de lcool, os erlenmeyers, contendo os substratos

e o catalisador, foram colocados em um agitador rotativo, com controle digital de temperatura
e agitao (incubadora TE - 420), 200 rpm.
Decorrido o tempo de reao, tambm definido por um planejamento experimental

fatorial, as amostras foram filtradas (para recuperao e posterior reutilizao da enzima) e
colocadas em um funil de separao para separao das fases (decantao da gua quando da
utilizao do cido olico e do leo de coco e decantao da glicerina quando da utilizao do
leo de algodo). A fase superior, rica em steres etlicos, foi separada e analisada. Na Figura
3.1 est representado o fluxograma do procedimento experimental.

Agitador (200 rpm)

cido / leo + com controle de
Etanol + Enzima Filtrao
temperatura
Descarte da fase
inferior (mono, di e Separao das
triglicerdeos, glicerol, fases
agua e impurezas)
Fase superior
(steres etlicos)
Determinao da
converso
Figura 3.1 Fluxograma do procedimento experimental para a reao de alcolise enzimtica do cido olico e
do leo vegetal residual
As variveis escolhidas para serem estudadas variaram de acordo com a matria-prima

de partida. Quando da utilizao do cido olico, estudou-se a influncia da razo molar
cido:lcool, da temperatura do sistema reacional e da concentrao de gua, para um tempo
reacional de 8 horas. Quando a matria-prima de partida foi o leo de algodo, as variveis
escolhidas foram a razo molar leo:lcool, a temperatura e o tempo reacional, pois como se
trata de uma reao de transesterificao, uma vez que o leo de algodo apresentou um baixo
ndice de acidez, a literatura indica elevados tempos de reao. Para verificar o efeito das
variveis sobre a converso da reao, bem como encontrar as condies que maximizassem a
sntese de steres, um planejamento experimental fatorial com 2 nveis e 3 variveis, foi
realizado. As Tabelas 3.1 e 3.2 mostram os intervalos de estudo das variveis. Esses
intervalos foram definidos de modo a abranger a maioria dos estudos constantes na literatura.

Tabela 3.1 - Valores reais das variveis independentes para o Planejamento Fatorial 23 utilizado para otimizar as
condies da esterificao enzimtica do cido olico utilizando uma lpase do tipo B de Candida antarctica
comercial como catalisador.
Varivel Intervalo de estudo
Razo molar cido:etanol [R] 1:1-1:6
Temperatura [TR](oC) 30-50
Concentrao de gua [W] (% p/p) 0 - 20
Tabela 3.2 - Valores reais das variveis independentes para o Planejamento Fatorial 23 utilizado para otimizar as
condies da etanlise enzimtica do leo de algodo residual utilizando uma lpase do tipo B de Candida
antarctica comercial como catalisador.
Varivel Intervalo de estudo
Razo molar leo:etanol [R] 1:3-1:9
o
Temperatura [TR]( C) 30-50
Tempo [TO](h) 24-72
Vale ressaltar que os experimentos foram realizados randomicamente e com triplicata

do ponto central. Os dados experimentais foram analisados com o software Statistica 6.0.
Devido ao elevado ndice de acidez do leo de coco residual, escolheu-se a melhor

condio experimental obtida com o cido olico para realizar uma reao com esse leo e
confirmar a viabilidade do uso de lipases nesse tipo de reao.
Os experimentos realizados com a lpase imobilizada em quitosana tambm ocorreram

nas melhores condies obtidas tanto na alcolise do cido olico quanto do leo de coco para
se verificar a potencialidade do uso deste derivado preparado com um suporte de baixo custo.

3.6. Clculo da Converso em steres Etlicos
Quando a matria-prima de partida foi o cido olico e o leo residual cido, a

converso foi calculada acompanhando a reduo do ndice de acidez de acordo com a
Equao 3.9. Isso pode ser feito porque medida que os steres vo sendo formados, a
quantidade de cidos graxos livres diminui e, portanto, o ndice de acidez decresce. Segundo
Lucena (2008), essa metodologia consegue prever bem a converso em steres, obtendo-se
valores bem prximos quando comparados aos dados obtidos com a cromatografia gasosa.
IA IAF (3.9)
X (%) = 0 100
IA0
sendo IA0 o ndice de acidez do cido/leo e IAF o ndice de acidez do biodiesel.
Entretanto, quando a matria-prima de partida foi o leo de algodo residual, cujo

ndice de acidez estava dentro do limite necessrio para se realizar uma trensesterificao
alcalina, a converso foi calculada acompanhando a reduo da glicerina combinada pelo
mtodo do periodato de sdio na determinao da glicerina, descrito no item 3.3.5 (Oliveira et
al., 2004).
GLR (3.10)
X (%) = 100
GO
sendo GLR a glicerina liberada durante a reao e GO a glicerina combinada do leo antes
da reao.

3.7. Recuperao e Regenerao do Biocatalisador
Aps a reao, o biocatalisador foi filtrado a vcuo, recolhendo-se o biodiesel num

Kitassato e a lipase retida em um funil de porcelana com papel de filtro. O biocatalisador foi
ento lavado trs vezes com hexano p.a. e secado a vcuo, sendo reutilizado em seguida para
verificar a perda de atividade na reao de alcolise do material lipdico.
3.8. Neutralizao dos steres Etlicos Obtidos
Depois de obtidos os steres etlicos com a catlise enzimtica, observou-se que o

ndice de acidez no estava dentro do limite estabelecido pela Agncia Nacional de Petrleo
(ANP). Na tentativa de deixar a mistura de steres dentro da especificao no que se refere ao
ndice de acidez, fez-se uma neutralizao com uma amostra de glicerina resultante do
processo de transesterificao alcalina. Para tanto, segundo Souza (2008), dividiu-se o ndice
de acidez do biodiesel por 50,6 para obter o valor em meq/g. A esse resultado acrescentou-se
15% e o valor final correspondeu a 1 g de biodiesel. Partindo-se da quantidade de biodiesel
que se queria neutralizar, por uma regra de trs simples calculou-se a quantidade de biodiesel
a ser neutralizada em meq/g. Em seguida, calculou-se a alcalinidade livre da fase glicerina,
em meq/g, e esse valor corresponde a 1 g de glicerina. Como j se sabe a quantidade de
biodiesel, em meq/g, que se quer neutralizar, por uma regra de trs simples calculou-se a
quantidade, em gramas, de glicerina correspondente a quantidade de biodiesel a ser
neutralizada. Misturou-se, ento, o biodiesel com a glicerina, deixando sob agitao e
aquecimento at atingir a temperatura 120o C, permanecendo nessa temperatura por 30
minutos. Em seguida, colocou-se a mistura para decantao da glicerina, analisando a acidez
da fase superior que corresponde aos steres neutralizados.
Para anlise da alcalinidade livre da fase glicerina, mediu-se cerca de 2 g da amostra e

misturou-se com 25 mL de lcool etlico neutralizado com hidrxido de sdio 0,25 N,
utilizando uma soluo de fenolftalena 1% em lcool como indicador. Em seguida, titulou-se

a mistura com cido clordrico 0,1 N e calculou-se a alcalinidade livre de acordo com a
equao a seguir.
(VB V1 ) F N 3.11)
AL(meqKOH / g ) =
M
onde AL a alcalinidade livre; V1 o volume gasto de HCl na titulao; V B o volume

gasto com o branco; F o fator da soluo de HCl (sempre prximo de 1); N a
normalidade da soluo de HCl (mol/L) e M a massa da amostra utilizada.

Captulo 4 Resultados e discusses Costa Filho, E.H. 55
4. RESULTADOS E DISCUSSES
Este captulo apresenta os resultados obtidos na caracterizao e na reao de alcolise

enzimtica dos trs substratos descritos no captulo de materiais e mtodos, bem como as
caracterizaes dos steres etlicos obtidos aps a reao. Mostra tambm as discusses
desses resultados na tentativa de explic-los.
Para um melhor entendimento, o captulo foi dividido em 9 tpicos, iniciando pela

caracterizao fsico-qumica e cromatogrfica da matria-prima, que objetivou um melhor
conhecimento do material com o qual se trabalhou e um melhor entendimento de alguns
resultados. Depois, mostra-se o resultado da reao de alcolise enzimtica do cido olico
utilizando a Novozym 435 como catalisador, analisando a influncia da temperatura, da razo
molar entre os substratos e da concentrao de gua presente no meio. Em seguida, tem-se o
resultado da mesma reao agora utilizando uma lipase do tipo B de Candida antarctica
(CALB) imobilizada em quitosana, para verificar a potencialidade do uso de um derivado
produzido pelo Grupo de Pesquisas em Processos Biotecnolgicos (GPBIO) do Departamento
de Engenharia Qumica da UFC. Como o propsito dessa dissertao verificar a viabilidade
do uso de lipase na esterificao de leos residuais, o tpico seguinte mostra o resultado da
etanlise do leo de coco residual cido e o estudo de ciclos das duas lipases. Para comparar o
comportamento da lipase em dois meios distintos, o ltimo tpico apresenta o resultado do
planejamento experimental fatorial realizado com um leo residual de baixa acidez livre. Por
fim, o ltimo tpico desse captulo mostra a caracterizao fsico-qumica dos steres etlicos
obtidos.
4.1. Caracterizao Fsico-Qumica da Matria-Prima
A Tabela 4.1 mostra o resultado da caracterizao fsico-qumica das matrias-primas

lipdicas utilizadas neste trabalho.

Como pode ser observado na Tabela 4.1, o cido olico e o leo de coco residual
possuem um elevado ndice de acidez, o que inviabiliza o seu uso em reaes de alcolise
com catalisador bsico. Entretanto, o leo de algodo apresentou um baixo ndice de acidez.
Tabela 4.1- Caracterizao fsico-qumica das matrias-primas lipdicas utilizadas nas reaes de alcolise
enzimtica.
PROPRIEDADES cido olico leo de coco leo de algodo
residual residual
ndice de acidez (mg KOH/g) 191,62 195,08 1,79
Densidade a 20 oC (Kg/cm3) 893,4 917,36 918,74
ndice de iodo (g/100g) 92,50 7,21 105,08
Teor de umidade (%) 0,07 0,25 0,07
Glicerina livre (%) ND 0,03 0,068
Glicerina total (%) ND 3,17 8,408
Observa-se tambm que o cido olico e o leo de algodo residual apresentaram um

elevado ndice de iodo, indicando a forte presena de compostos insaturados (cido
palmitolico, cido linolico e cido olico), que confirmada pela anlise cromatogrfica,
descrita no tpico 4.2. A presena de insaturaes no recomendada porque ligaes duplas
e triplas so extremamente reativas e fazem tanto o leo quanto o biodiesel resultante
apresentarem uma baixa resistncia oxidao e uma maior tendncia em formar depsitos de
goma nos motores (Arajo et al, 2007; Lucena, 2008). J o leo de coco residual apresentou
um ndice de iodo bem menor, o que sugere a baixa presena de compostos insaturados,
confirmada tambm pela anlise cromatogrfica.
4.2. Caracterizao Cromatogrfica da Matria-Prima
Nas Tabelas 4.2, 4.3 e 4.4 esto listados os percentuais de cidos graxos obtidos por
cromatografia gasosa para o cido olico e para os leos vegetais residuais.

Com base na composio qumica (Tabela 4.2), a massa molar mdia do cido olico
282,47 g/mol.
Tabela 4.2 - Percentuais de cidos graxos para o cido olico.

cido Graxo Composio (%)
cido miristico (C14:0) 0,850
cido palmitoleico (C16:1) 2,020
cido palmtico (C16:0) 2,550
cido olico cis (C18:1) 94,40
A Figura 4.1 mostra o cromatograma do cido olico. Observa-se um pico bem

definido para o cido olico, com tempo de reteno de 12,2 minutos. Entretanto, outros picos
foram detectados, registrando a presena de outros cidos graxos, em menor quantidade,
indicando que a acidez constante na Tabela 4.1 no referente apenas ao cido olico.
Figura 4.1- Cromatograma do cido olico.

Tabela 4.3 - Percentuais de cidos graxos para o leo de coco residual.

cido caprlico (C8:0) 2,640
cido cprico (C10:0) 3,740
cido lurico (C12:0) 51,62
cido linoleico (C18:2) 0,510
cido olico trans (C18:1) 5,500
cido esterico (C18:0) 2,870
Com base na composio qumica e considerando que o leo de coco residual, devido
ao elevado ndice de acidez, constitudo majoritariamente por cidos graxos livres e no por
triglicerdeos, a massa molar mdia desse leo 217,60 g/mol.
A Figura 4.2 mostra o cromatograma do leo de coco residual com os picos mais
representativos e os seus respectivos tempos de reteno. O pico mais intenso, cujo tempo de
reteno 21,32 minutos, refere-se ao cido lurico (cido dodecanico), presente em maior
quantidade na amostra de leo.
Figura 4.2 - Cromatograma do leo de coco residual.

Tabela 4.4 - Percentuais de cidos graxos para o leo de algodo residual.

cido palmitoleico (C16:1) 0,22
cido linoleico (C18:2) 47,45
cido olico trans (C18:1) 4,66
cido esterico (C18:0) 2,98
Com base na Tabela 4.4, a massa molar mdia do leo de algodo residual 827,01
g/mol.
A Figura 4.3 mostra o cromatograma do leo de algodo residual com os picos mais
representativos e os seus respectivos tempos de reteno. O pico mais intenso, cujo tempo de
reteno 11,99 minutos, refere-se ao cido linolico, presente em maior quantidade na
amostra de leo.
Figura 4.3 - Cromatograma do leo de algodo residual.

4.3. Alcolise Enzimtica do cido Olico Utilizando Lipase Comercial de Candida

Antarctica Tipo B (Novozym 435) como Catalisador
Os resultados obtidos no planejamento experimental fatorial para a esterificao

enzimtica do cido olico comercial utilizando lipase comercial como catalisador so
apresentados na Tabela 4.5. O tempo de reao foi mantido fixo em oito horas para todos os
experimentos, uma vez que, em ensaios preliminares, observaram-se maiores converses em
steres nesse tempo, o que foi confirmado posteriormente ao se estudar a cintica de reao
(subtpicos 4.3.1, 4.3.2 e 4.3.3).
Baseado nesses valores, o erro experimental foi de, aproximadamente 0,68 %,

mostrando uma boa reprodutibilidade dos experimentos. Observando a Tabela 4.5, pode-se
ver que a maior converso de biodiesel foi de 88,36 % nas condies de menor temperatura
(30 oC), maior razo molar cido:lcool (1:6) e menor concentrao de gua (W = 0%).
Entretanto, como ser explicado posteriormente, a temperatura e a concentrao de gua
adicionada ao meio reacional tiveram um efeito no significativo e negativo, respectivamente,
na converso em steres e, apesar do efeito positivo da razo molar, no foi necessrio um
excesso estequiomtrico para obter converses razoveis.

Tabela 4.5 Resultados do Planejamento Fatorial 23 com triplicata do ponto central tendo como varivel
resposta a converso obtida aps 8 horas de esterificao enzimtica do cido olico utilizando uma lipase
comercial de Candida antarctica tipo B (Novozym 435).
Concentrao
Razo molar Temperatura
Experimento de gua Converso (%)
R T (oC)
W (% p/p)
1 1:1 30 0 87,31 0,68
2 1:6 30 0 88,36 0,68
3 1:1 30 20 78,30 0,68
4 1:6 30 20 86,80 0,68
5 1:1 50 0 86,34 0,68
6 1:6 50 0 87,90 0,68
7 1:1 50 20 75,30 0,68
8 1:6 50 20 82,70 0,68
9 (c) 1 : 3,5 40 10 86,95 0,68
10 (c) 1 : 3,5 40 10 85,04 0,68
11(c) 1 : 3,5 40 10 85,73 0,68
A partir dos dados da Tabela 4.5, fez-se a anlise estatstica utilizando o software
Statistica 6.0. Atravs do Diagrama de Pareto, mostrado na Figura 4.4, pode-se observar que a
varivel concentrao de gua e razo molar entre os reagentes cruzam a linha de nvel de
significncia de 95 %. Portanto, a razo molar cido:lcool e a concentrao de gua tiveram
efeito estatisticamente significativo na converso em steres, dentro do intervalo estudado
para cada varivel.

(3)Concentrao de gua -10,3415
(1)Razo molar 7,307375
1com3 5,399196
(2)Temperatura -2,57714
2com3 -1,53166
1com2com3 -1,12955
1com2 -,756692
p=,05
Efeitos estimados (valores absolutos)

Figura 4.4 Diagrama de Pareto indicando o efeito dos valores estimados para as variveis estudadas no
planejamento experimental 23 com triplicata do ponto central da esterificao enzimtica do cido olico.
A Tabela 4.6 mostra a estimativa dos efeitos do planejamento experimental realizado.

Pode-se observar que os valores de p obtidos para os fatores analisados so menores que 0,05,
exceto para a temperatura e para as interaes entre a temperatura e a razo molar entre os
reagentes, entre temperatura e concentrao de gua e para interao entre as trs variveis.
Logo, confirma-se que o nico parmetro sem efeito significativo dentro das faixas
experimentais estudadas foi a temperatura.

Tabela 4.6 Estimativa dos efeitos principais e suas interaes na converso do cido olico a steres etlicos.
Fatores Efeitos Desvio padro p
Mdia 84,47727 0,291615 0,000012
TR (oC) -1,76250 0,683898 0,123323
R 4,99750 0,683898 0,018217
W (%) -7,07250 0,683898 0,009221
TR * R -0,51750 0,683898 0,528226
TR*W -1,04750 0,683898 0,265286
R*W 3,69250 0,683898 0,032634
TR*R*W -0,77250 0,683898 0,375917
TR Temperatura; R Razo molar entre reagentes; W Concentrao de gua
Uma outra observao importante que se pode fazer da Tabela 4.6 que a
concentrao de gua apresentou um menor efeito, indicando ser ela a varivel mais
significativa no processo. Alm disso, o efeito dessa varivel foi negativo, o que j era
esperado uma vez que o excesso de gua favorece a reao de hidrlise do ster, diminuindo a
converso no equilbrio.
Sendo assim, a partir da anlise da regresso linear dos resultados obtidos, foi possvel
obter um modelo polinomial para descrever a converso em ster etlico, dentro dos intervalos
das variveis estudadas. A Equao 4.1 mostra o modelo de primeira ordem para as variveis,
considerando todos os coeficientes de regresso.
Converso(%) = 89,2440 (0,0536 TR )+ (0,0570 R) (0,6189 W ) (4.1)

3, 4257 0 , 0832 0 , 7975 0 , 2425
+ (0,0051 TR R)+ (0,00017 TR W )+ (0,13565 R W ) (0,00155 TR R W )

0 , 0193 0 , 0058 0 , 0563 0 , 0013
sendo TR a temperatura de reao, R a razo molar entre os reagentes e W a concentrao de

gua adicionada a mistura reacional.

A Tabela 4.7 mostra a anlise da varincia (ANOVA) para a varivel resposta

(converso) da reao de alcolise enzimtica do cido olico utilizando lipase Novozym 435
como catalisador.
Tabela 4.7 Anova para a reao de alcolise enzimtica do cido olico utilizando Novozym 435 como
catalisador.
Soma Graus de Mdia
Fonte de Variao Quadrtica Liberdade Quadrtica F
SQ d.f. MQ
Regresso 195,82 8 24,47 26,16
Erro 1,8709 2 0,9354
Total SS 197,69 10
R2 = 0,9479; F8;2;0,05=19,37
A partir da Tabela 4.7 observa-se que o coeficiente de determinao (R2), obtido pela
regresso 0,94. Por essa mesma Tabela 4.7, pode-se realizar o teste F para confirmar o
ajuste do modelo obtido. Segundo Rodrigues (2005), para que os parmetros do modelo
tenham significncia estatstica, o valor de F da regresso deve ser maior que o valor de F
tabelado. Comparando o valor de F da regresso com o tabelado (Ftabelado =19,37), verifica-se
uma regresso significativa. Portanto, os dados experimentais so bem representados pelo
modelo ajustado, ou seja, o modelo obtido para as variveis significativas pode ser utilizado
para predizer a converso em ster, dentro do intervalo estudado. Essa concluso tambm
confirmada pela Figura 4.5, que apresenta a comparao entre os valores observados
experimentalmente e aqueles preditos pelo modelo ajustado. Observa-se, pela anlise dessa
Figura 4.5, pouca disperso dos pontos que esto prximos a reta representativa, o que
comprova o bom ajuste do modelo.

90
88
86
Valores preditos 84
82
80
78
76
74
74 76 78 80 82 84 86 88 90
Valores observados
Figura 4.5 Valores preditos pelo modelo versus valores experimentais da converso em steres etlicos obtidos
pelo planejamento experimental 23 com triplicata do ponto central da esterificao enzimtica do cido olico.
A Figura 4.6 representa a superfcie de resposta para a converso em steres em funo

da razo molar e da concentrao de gua adicionada ao meio. Por ela, observa-se que o
aumento da concentrao de gua diminui a converso enquanto o aumento da concentrao
de lcool a favorece. Entretanto, o ganho de converso com o aumento da proporo entre os
reagentes muito pouco, o que indica a no necessidade de um excesso estequiomtrico.

88
86
84
82
80
78
76
74
Figura 4.6 Superfcie de resposta representando a converso em funo da razo molar entre os reagentes e
concentrao de gua adicionada ao meio.
Os tpicos seguintes apresentam uma discusso individualizada dos efeitos das

variveis estudadas.
4.3.1. Efeito da Temperatura (TR)
As Figuras 4.7 e 4.8 mostram a influncia da temperatura na cintica da reao de

esterificao do cido olico com etanol utilizando lipase Novozyme 435 como catalisador.
A literatura indica que a temperatura tima da lipase abaixo de 70 oC (Faccio, 2004).

Segundo Gao et al (2006), ao estudarem a imobilizao de lipase em resina macroporosa e
sua aplicao na sntese de biodiesel em meios quase anidros, concluram que a temperatura
tima de reao de uma lipase imobilizada foi 40 oC. Acima desse valor a taxa de converso
de biodiesel diminui rapidamente at a provvel desativao da enzima.

100
90
80
70
60
Converso (%)
50
40
30
o
30 C
20 o
50 C
10
0
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
Tempo (min)
Figura 4.7- Influncia da temperatura na esterificao enzimtica do cido olico com etanol utilizando
Novozym 435 como catalisador na razo molar 1:1 e concentrao de gua W=0%.
100
90
80
70
60
Converso (%)
50
40
30
o
30 C
20 o
50 C
10
0
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
Tempo (min)
Figura 4.8- Influncia da temperatura na esterificao enzimtica do cido olico com etanol utilizando
Novozym 435 como catalisador na razo molar 1:6 e concentrao de gua W=0%.

Neste trabalho, a temperatura no influenciou a converso, dentro do intervalo

estudado, o que pode ser observado nas Figuras 4.7 e 4.8, que mostram a cintica da reao na
menor concentrao de gua (W = 0%) e nas razes molares 1:1 e 1:6, respectivamente. Por
elas percebe-se que, apesar de um ligeiro favorecimento da converso nos primeiros minutos
de reao com o aumento da temperatura, a converso no equilbrio muito similar para
ambas as temperaturas, e a velocidade de reao, especialmente quando se usa razo molar
cido:lcool 1:1, praticamente a mesma, atingindo o equilbrio quase ao mesmo tempo. Pela
Figura 4.7 observa-se que para ambas as temperaturas uma converso acima de 80%
atingida com 60 minutos de reao. J pela Figura 4.8, uma converso acima de 80%
conseguida com a temperatura de 50oC somente aps 120 minutos de reao. Portanto, no
necessrio um auto gasto energtico com o aumento da temperatura, uma vez que possvel
obter uma boa converso numa temperatura prxima a ambiente (30oC) e a uma velocidade
praticamente igual a da temperatura de 50oC.
4.3.2. Efeito da Razo Molar cido:lcool (R)
As Figuras 4.9 e 4.10 mostram o efeito da razo molar na esterificao enzimtica do

cido olico com etanol utilizando Novozyme 435 como catalisador.
Apesar do efeito positivo apresentado pela varivel razo molar cido:lcool, observa-
se pelas Figuras 4.9 e 4.10 que nos primeiros minutos de reao o aumento de R torna a
reao mais lenta e embora as converses no equilbrio sejam maiores na condio de maior
razo molar, os valores so muito prximos, indicando a no necessidade de um excesso
estequiomtrico, tornando o processo enzimtico, nesse aspecto, mais vantajoso do que a
catlise qumica convencional.

100
90
80
Converso (%) 70
60
50
40
[1:1]
30 [1:6]
[1:12]
20
10
0
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
Tempo (min)
Figura 4.9- Influncia da razo molar cido:lcool na esterificao enzimtica do cido olico com etanol
utilizando Novozym 435 como catalisador na temperatura de 30 oC e na menor concentrao de gua (W = 0%).
100
90
80
70
60
Converso (%)
50
40
[1:1]
30 [1:6]
[1:12]
20
10
0
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
Tempo (min)
Figura 4.10- Influncia da razo molar cido:lcool na esterifcao enzimtica do cido olico com etanol
utilizando Novozym 435 como catalisador na temperatura de 50 oC e na menor concentrao de gua (W = 0%)
Esses resultados esto de acordo com o que vem sendo reportado na literatura.
Trubiano et al (2007), ao estudarem a influncia das condies operacionais e das limitaes

da transferncia de massa externa na sntese de steres de cidos graxos utilizando uma lipase
de Candida antarctica, verificaram o mesmo efeito para a razo molar. Esses autores
estudaram vrias razes molares e verificaram que a medida que a quantidade de lcool
aumentava, a converso em steres progredia mais lentamente e a converso no equilbrio
aumentava. Nesse estudo eles verificaram a existncia de uma razo molar mxima na qual
acima desse valor a taxa inicial de reao comeava a diminuir, o que sugere a existncia de
uma razo molar tima.
Wang et al (2007), ao estudarem a produo enzimtica de biodiesel a partir de leos

residuais cidos, tambm observaram que uma quantidade excessiva de lcool diminui a
velocidade inicial de reao e tem um efeito negativo na lipase. Em comum acordo com
vrios autores, esse comportamento da lipase frente ao excesso estequiomtrico de lcool
pode ser explicado por efeitos inibitrios, uma vez que, devido a elevada polaridade de
lcoois de cadeia curta como o etanol, por exemplo, ao entrar em contato com a enzima o
lcool pode ficar adsorvido no suporte no qual a enzima foi imobilizada, formando uma
camada limite aquosa em torno do biocatalisador, deixando o stio ativo da enzima
inacessvel.
4.3.3. Efeito da Concentrao de gua (W)
De acordo com a Figura 4.4, o aumento da concentrao de gua no meio reacional

teve um efeito negativo na converso em steres dentro do intervalo estudado, ou seja, no
equilbrio, medida que a quantidade de gua aumentou a converso de biodiesel diminuiu.
Esse efeito tambm observado claramente na Figura 4.11, que mostra a cintica da reao de
esterificao do cido olico com etanol utilizando Novozym 435 como catalisador na
temperatura de 30 oC e na razo molar cido:lcool de 1:1.

100
90
80
70
60
Converso (%)
50
40
30
W = 0%
20 W = 20%
10
0
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
Tempo (min)
Figura 4.11- Influncia da concentrao de gua na esterificao enzimtica do cido olico com etanol
utilizando Novozym 435 como catalisador na temperatura de 30 oC e na menor razo molar (R = 1:1)
Sabe-se que as lipases necessitam de uma certa quantidade de gua para manter a sua
conformao tridimensional ativa, mesmo quando a enzima est covalentemente ligada a um
suporte, uma vez que a gua interage com os grupos hidroflicos localizados na superfcie da
enzima levando a conformao aberta da lipase. Entretanto, existe uma concentrao mnima
de gua em meios quase anidros na qual acima desse valor a taxa de converso decresce
significativamente, facilitando a hidrlise do ster (Gao et al, 2006; Trubiano et al, 2007;
Yahya, et al, 1998).
De acordo com os resultados obtidos por Foresti et al (2007), em reaes de

esterificao e hidrlise, a quantidade de gua afeta a converso de equilbrio assim como a
distribuio dos produtos no meio. Particularmente para esterificaes, medida que a
concentrao de gua aumenta, a converso no equilbrio diminui, o que pode ser resultado da
gua agindo como substrato na reao inversa de hidrlise.
Entretanto, observando a Figura 4.11, percebe-se um ligeiro favorecimento da

converso, nos primeiros minutos de reao, com o aumento da concentrao de gua
presente no meio. Esse comportamento tambm foi observado por Foresti et al (2007) e por
Foresti et al (2008), que explicaram que a adio de elevadas quantidades de gua mistura
de substratos promoveu a formao de duas fases lquidas, aumentando significativamente o

rendimento em steres etlicos em condies distantes do equilbrio. Isso acontece porque o

sistema lquido bifsico formado logo no incio da reao com a adio da gua faz com que a
gua produzida pela reao de esterificao seja extrada para fase aquosa, tornado a fase
orgnica rica em ster, pois devido a sua alta hidrofobicidade, eles permanecem nessa fase.
No caso de reaes feitas em sistemas com W = 0%, as baixas converses medidas no incio
da reao foram conseqncia de ambas hidratao insuficiente do biocatalisador e um
contnuo aumento da quantidade de gua dentro da fase reagente. No incio, toda a gua
produzida permanece em uma nica fase, favorecendo a hidrlise do ster, mas a medida que
a quantidade de gua aumenta, ocorre uma ruptura de fase, fazendo com que toda a gua
acumulada migre para a fase aquosa, reduzindo a taxa de reao inversa e favorecendo a
sntese de ster. Por isso a converso no equilbrio na condio de menor quantidade de gua
foi maior.
Portanto, o ponto chave para explicar o aumento da taxa inicial de converso com a
elevao da quantidade de gua a formao de um sistema lquido bifsico logo no incio.
Se a gua adicionada ao sistema reacional for alta o suficiente para a formao de duas fases
lquidas, a converso medida nos primeiros minutos de reao aumenta, pois o sistema
bifsico promove a migrao da gua formada durante a reao da fase orgnica para a fase
aquosa, tornado a fase orgnica rica em ster.
A Figura 4.12 mostra a influncia do aumento da quantidade de lcool na maior

concentrao de gua. Por ela percebe-se que quando se aumenta a quantidade de gua
juntamente com a quantidade de lcool, a converso no equilbrio maior.

100
90
80
70
60
Converso (%)
50
40
30
20
Razo molar cido:lcool (1:1)
10 Razo molar cido:lcool (1:6)
0
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
Tempo (min)
Figura 4.12- Influncia do aumento da concentrao de lcool com o aumento da concentrao de gua na
esterificao enzimtica do cido olico com etanol utilizando Novozym 435 como catalisador na temperatura de
30 oC.
O fato do aumento da quantidade de gua ser menos prejudicial reao de

esterificao com o aumento da quantidade de lcool pode ser explicado pelo fato de que na
proporo estequiomtrica a gua presente no meio mais significativa do que a concentrao
de lcool, favorecendo a reao inversa de hidrlise do ster. J com um excesso de lcool
presente no meio, a gua fica solubilizada com o lcool e por isso, alm da converso no
equilbrio ser maior, a velocidade de reao menor, pois no h a formao do sistema
bifsico logo no inicio. Entretanto, importante salientar que o aumento na concentrao de
lcool e gua no permitiu uma melhora na converso, j que a maior converso no equilbrio
(87 %) foi obtida na condio de menor concentrao de gua e menor razo molar entre
substratos.

4.4. Alcolise Enzimtica do cido Olico Utilizando Lipase de Candida antarctica Tipo
B Imobilizada em Quitosana como Catalisador
A Figura 4.13 mostra a comparao dos resultados obtidos na reao de esterificao

do cido olico com etanol utilizando o derivado de quitosana e a Novozym 435, como
catalisador. De acordo com esta Figura, observa-se que a converso no equilbrio
praticamente a mesma. Entretanto, a velocidade de reao no incio menor quando se
utilizou o derivado de quitosana como catalisador.
100
90
80
70
60
Converso (%)
50
40
30 comercial
20
quitosana
10
0
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
Tempo (min)
Figura 4.13 - Comparao do comportamento da Lipase de Candida Antarctica Tipo B Imobilizada em

Quitosana com a Novozym 435 na etanlise do cido olico na temperatura de 30 oC, razo molar cido:lcool
1:1 e sem adio de gua.
Esta observao pode ser explicada por dois motivos. Primeiramente, a quantidade de
enzima imobilizada por grama de suporte para o derivado de quitosana menor do que para a
Novozym 435, ou seja, a carga do derivado de quitosana menor, tornando a velocidade de
reao mais lenta. Uma outra explicao possvel o problema difusional causado pela
ativao do derivado com glutaraldedo. Segundo Foresti et al (2007), as baixas converses

obtidas com os derivados tratados com glutaraldedo podem ser explicadas pelo fato do acesso
ao stio ativo da lipase ter ficado bloqueado pela ligao qumica estabelecida entre a lipase e
a quitosana ativada durante o processo de imobilizao, que pode ter envolvido aminocidos
do stio ativo, provocando restries estricas, ou mudanas conformacionais imprprias,
levando a uma reduo da atividade enzimtica.
4.5. Alcolise Enzimtica do leo de Coco Residual Utilizando Novozym 435 como
Catalisador
A Figura 4.14 mostra uma comparao do comportamento da Novozym 435 na reao

de esterificao do cido olico e do leo de coco residual cido.
100
90
80
70
60
Converso (%)
50
40
30
cido olico
20 leo de coco residual
10
0
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
Tempo (min)
Figura 4.14- Comparao do comportamento da Novozym 435 na reao de etanlise do cido olico com a
etanlise do leo de coco residual na temperatura de 30 oC, razo molar cido:lcool 1:1 e sem adio de gua.
Essa comparao foi realizada para observar se o leo residual no desnaturava a

enzima, e como se pode observar pela Figura 4.14, a Novozym 435 comportou-se de maneira

semelhante na reao de esterificao do leo de coco residual com etanol, provando a

potencialidade do uso dessa lipase para obteno de steres a partir de matrias-primas cidas.
4.6.Ciclos de Atividade
A Figura 4.15 mostra as converses obtidas aps 11 reaes de etanlise do leo de

coco residual utilizando a mesma amostra de enzima, tanto para a Novozym 435 como para o
derivado de quitosana. Ambas as lipases foram apenas lavadas com hexano e secadas a vcuo
antes da reutilizao.
100
90
80
70
Converso (%)
60
50
40
Novozyme 435
30 Derivado de quitosana
20
10
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Ciclos
Figura 4.15- Estabilidade operacional da Novozym 435 e da Lipase de Candida Antarctica Tipo B Imobilizada
em Quitosana na reao de etanlise do leo de coco residual na temperatura de 30 oC, razo molar cido:lcool
1:1 e sem adio de gua.
Os resultados mostram a estabilidade das lipases, comprovando a viabilidade da

catlise enzimtica para produo de biodiesel a partir de substratos de elevada acidez livre,
uma vez que o alto custo da enzima um dos fatores mais importantes na catlise enzimtica,
restringindo a produo industrial de biodiesel por essa rota alternativa. Esses resultados

tambm esto de acordo com o que outros autores observaram. Wang et al (2007),
verificaram a manuteno da atividade da Novozyme 435 aps dez ciclos consecutivos.
4.7. Alcolise Enzimtica do leo de Algodo Residual Utilizando Novozym 435 como
Catalisador
Os resultados obtidos no planejamento de experimentos encontram-se na Tabela 4.8.

Baseado nesses valores, o erro experimental foi de aproximadamente 2,19%, mostrando uma
boa reprodutibilidade dos experimentos. Observando a Tabela 4.7, pode-se ver que a maior
converso de biodiesel foi de 82,66 % em 72 horas de reao nas condies de menor
temperatura (30 oC) e na menor razo molar lcool:leo (3:1).
Tabela 4.8 Converses obtidas na alcolise enzimtica do leo de algodo residual de baixa acidez livre
utilizando uma lipase comercial de Candida antarctica tipo B (Novozym 435).
Experimento Razo Molar Temperatura Tempo Converso
R T R(oC) TO (h) (%)
1 1:3 30,0 24 45,00 2,19
2 1:3 50,0 24 79,00 2,19
3 1:9 30,0 24 41,70 2,19
4 1:9 50,0 24 31,79 2,19
5 1:3 30,0 72 82,66 2,19
6 1:3 50,0 72 76,19 2,19
7 1:9 30,0 72 73,89 2,19
8 1:9 50,0 72 50,35 2,19
9 (c) 1:6 40,0 48 68,87 2,19
10 (c) 1:6 40,0 48 64,51 2,19
11 (c) 1:6 40,0 48 62,88 2,19

A partir dos dados da Tabela 4.8, fez-se a anlise estatstica utilizando o software
Statistica 6.0. Atravs do Diagrama de Pareto, mostrado na Figura 4.16, podemos observar que
a varivel razo molar, tempo reacional e as interaes entre razo e temperatura e entre
temperatura e tempo cruzam a linha de nvel de significncia de 95 %. Portanto, razo molar
lcool:leo e o tempo reacional, bem como as interaes entre a temperatura e o tempo e entre
razo molar e temperatura tiveram efeito estatisticamente significativo na converso em
steres. Apesar de no significativa, a temperatura teve um efeito negativo, indicando que esta
enzima tem um comportamento timo em condies brandas de temperatura. A razo molar
tambm apresentou um efeito negativo, apontando para uma possvel inativao enzimtica
pelo excesso de lcool. J o tempo reacional apresentou um efeito positivo, o que leva a
concluso de que quanto maior o tempo de reao maior a converso.
(3)Tempo 10,13636
(1)Razo -10,0795
1com2 -7,22097
2com3 -6,40627
1com2com3 3,178269
1com3 1,882805
(2)temperatura -,701019
p=,05
Efeitos estimados (valores absolutos)
Figura 4.16- Diagrama de Pareto indicando o efeito dos valores estimados para as variveis independentes para
o Planejamento fatorial 23 da reao de alcolise enzimtica do leo de algodo residual.

Nesse momento j se pode observar que, apesar de um tempo bem maior ser
necessrio para se alcanar boas converses com o leo de algodo, os efeitos das variveis
estudadas foram semelhantes aos efeitos dos fatores analisados no planejamento experimental
com o cido olico. A Tabela 4.9 mostra a estimativa dos efeitos do planejamento
experimental realizado com o leo de algodo. Pode-se observar que os valores de p obtidos
para os fatores analisados so menores que 0,05, exceto para a temperatura e para a interao
entre razo molar e tempo e para a interao entre as trs variveis. Logo, confirma-se que o
nico parmetro sem efeito significativo dentro das faixas experimentais estudadas foi a
temperatura.
Tabela 4.9 Estimativa dos efeitos principais e suas interaes na converso do leo de algodo a steres
etlicos.
Fatores Efeitos Desvio padro p
Mdia 61,51 0,90 0,000214
R -21,28 2,11 0,009700
TR (oC) -1,48 2,11 0,555875
TO (h) 21,40 2,11 0,009593
TR * R -15,24 2,11 0,018644
R*TO 3,975 2,11 0,200430
TR*TO -13,52 2,11 0,023510
TR*R*TO 6,71 2,11 0,086365
TR Temperatura; R Razo molar entre reagentes; TO Tempo
Considerando os coeficientes de regresso linear obtidos, intervalo de confiana de

95% e quatro casas decimais, foi possvel escrever o modelo matemtico de primeira ordem
correspondente a varivel resposta (converso) de acordo com a Equao 4.3.
Converso(%) = 96,4573+ (14,2383 R)+ (4,1450 TR )+ (2,5256 TO ) (4.3)

21, 7548 3, 2440 0 , 5278 0 , 4055
(0,4778 R TR ) (0,1588 R TO ) (0,0561 TR TO )+ (0,0047 TR R TO )

0 , 0786 0 , 0604 0 , 0098 0 , 0014

sendo TR a temperatura de reao, R a razo molar entre os reagentes e TO o tempo

reacional.
O ajuste do modelo escolhido pode ser confirmado pela Figura 4.17, que mostra a
comparao entre os valores reais e aqueles obtidos pelo modelo, observando-se uma
aglomerao dos pontos prximo a reta representativa.
90
80
70
Valores preditos
60
50
40
30
30 40 50 60 70 80 90
Valores observados
Figura 4.17 Valores previstos pelo modelo versus valores experimentais obtidos pelo pelo planejamento
experimental fatorial 23 com triplicata do ponto central para a reao de alcolise enzimtica do leo de algodo.
Tabela 4.10 ANOVA para a reao de alcolise enzimtica do leo de algodo utilizando Novozym 435 como
catalisador.
Soma Graus de Mdia
Fonte de Variao Quadrtica Liberdade Quadrtica F
SQ d.f. MQ
Regresso 2839,143 8 354,89 39,83
Erro 17,829 2 8,91
Total SS 2856,972 10
R2 = 0,97246; F8;2;0,05=19,37

Pela Tabela 4.10 (ANOVA), que mostra a anlise de varincia e o teste F, novamente
confirma-se que o modelo escolhido representa os dados experimentais, uma vez que o valor
de F da regresso foi maior que o valor de F tabelado (19,37).
A seguir, analisou-se a superfcie de resposta, Figura 4.18, para se avaliar o efeito da

razo molar leo:lcool na converso da reao. Por ela, percebe-se que os melhores
resultados foram conseguidos nas condies de menor razo molar, o que est de acordo com
o que vem sendo reportado na literatura (Kose et al., 2002; Oliveira et al., 2004). Isso
acontece porque, provavelmente, o excesso de lcool provoca inativao da enzima.
80
70
60
50
40
Figura 4.18- Superfcie de resposta para a converso em funo da temperatura e razo molar leo:lcool para
alcolise enzimtica de leo de algodo utilizando Novozymes 435 como catalisador.
Segundo Chen e Wu (2003), ao estudarem mtodos de regenerao da atividade de

uma lipase de Candida antarctica, que fora inativada pelo excesso de lcool durante a reao
de alcolise de leo de soja, essa inativao pode ser explicada pela imiscibilidade entre
triglicerdeos e lcoois de cadeia curta (metanol e etanol). Alm disso, o suporte no qual a
enzima foi imobilizada pode ter adsorvido compostos polares como o etanol, o que, em
elevadas concentraes desse lcool, promove a formao de uma camada estagnada desse
reagente em torno da partcula de enzima imobilizada, impedindo a entrada de triglicerdeo ao
stio ativo da enzima.

A Figura 4.19 mostra o efeito do tempo reacional na converso da reao. Por ela
percebe-se que as maiores converses ocorreram nos maiores tempos e nas menores
temperaturas, o que era esperado, uma vez que quanto mais tempo os reagentes
permaneceram em contato, maior foi a converso. No entanto, o tempo necessrio para se
obter boas converses ainda foi alto se comparado com a catlise qumica e com a
esterificao de substratos de elevada acidez livre.
80
70
60
50
40
Figura 4.19- Superfcie de resposta para a converso em funo da temperatura e do tempo reacional para a
alcolise enzimtica de leo de algodo utilizando Novozymes 435 como catalisador.
4.8.Caracterizao dos steres Etlicos
Como o interesse dessa dissertao foi a obteno de steres etlicos a partir de uma
matria-prima residual, e diante dos bons resultados conseguidos com a esterificao do leo
de coco residual cido utilizando o derivado de quitosana, a Tabela 4.11 apresenta a
caracterizao dos steres produzidos pela reao de alcolise do leo de coco utilizando uma
lpase de Cndida antarctica tipo B imobilizada em quitosana como catalisador, na condio
de menor temperatura (30oC), menor razo molar leo:lcool (1:1) e sem adio de gua.

Tabela 4.11- Caracterizao fsico-qumica dos steres etlicos.

PROPRIEDADES steres etlicos Limite ANP
ndice de acidez (mg KOH/g) 25,40 0,50
Densidade a 20 oC (Kg/m3) 879,96 850-900
ndice de iodo (g/100g) 6,74 **
Teor de umidade (%) 0,05 0,05
Glicerina livre (%) 0,015 0,02
Glicerina total (%) 0,204 0,25
**Vide anexo A
Comparando a caracterizao dos steres etlicos obtidos com os limites permitidos

pela resoluo 7 da Agncia Nacional de Petrleo (ANP), percebe-se que o nico parmetro
que no ficou dentro da especificao foi o ndice de acidez. Entretanto, aps submeter a
mistura de steres etlicos a uma neutralizao com a glicerina resultante do processo de
produo de biodiesel por transesterificao com catalisador bsico, o ndice de acidez
reduziu para 0,76 mg KOH/g, ficando muito prximo do limite exigido pela ANP.
4.9.Concluses Parciais
Tendo por base os resultados apresentados e discutidos nesse captulo, uma concluso
que se pode chegar que a utilizao da lpase de Cndida antarctica tipo B imobilizada para
produo de biodiesel mais vivel quando da utilizao de substratos cidos, uma vez que os
melhores resultados foram conseguidos com matrias-primas desse tipo e com uma taxa de
reao comparvel a esterificao com catalisador cido.
Segundo Lucena (2008), uma converso em torno de 87 % em ster metlico a partir

da metanlise de cido olico comercial com cido sulfrico foi conseguida com 60 minutos
de reao, a uma temperatura de 90o C, razo molar cido:lcool de 1:3 e com adsoro da
gua formada durante o processo. J com os ensaios sem adsoro de gua, uma converso
mxima de 88,18 % em ster metlico foi atingida a uma temperatura de 110o C e razo molar
entre reagentes de 1:9. Enquanto isso, os resultados dessa dissertao mostram que a

esterificao enzimtica do cido olico comercial com etanol forneceu uma converso de
87,3 % com 60 minutos de reao, a uma temperatura de 30o C, na proporo estequiomtrica
e sem adsoro de gua.

Captulo 5 Concluses Costa Filho, E.H. 85
5. CONCLUSES
Esse trabalho teve como objetivo verificar a potencialidade do uso de lipase

imobilizada, especialmente uma lipase imobilizada pelo Grupo de Pesquisa em Processos
Biotecnolgicos (GPBIO) do Departamento de Engenharia Qumica da UFC, na reao de
modificao de leos vegetais residuais, verificando a influncia das variveis do processo e a
cintica de reao, bem como uma comparao do comportamento da lipase em dois leos
com caractersticas fsico-qumicas diferentes.
De acordo com o estudo realizado, algumas concluses podem ser apresentadas,

dependendo do catalisador e do substrato utilizado.
Os resultados dessa dissertao demonstraram que ambos os biocatalisadores

utilizados apresentaram boa eficincia na esterificao de matrias-primas cidas, com a
enzima imobilizada em um suporte de quitosana pelo GPBIO apresentando atividade
comparvel a lipase comercial.
O emprego do planejamento experimental fatorial mostrou-se eficiente no estudo das

variveis que influenciam a converso da reao. Nos dois planejamentos empregados, os
efeitos das variveis foram praticamente os mesmos, com exceo de um tempo de reao
maior quando da utilizao do leo de algodo, cuja principal diferena em relao aos outros
substratos foi o seu baixo ndice de acidez livre. Esse resultado nos levou a concluir que
mais vivel o emprego de lipase para produo de biodiesel quando se utiliza resduos
gordurosos com altos teores de cidos graxos livres.
Os resultados dos planejamentos e da cintica de reao encontrados nessa dissertao

demonstram que, dentro do intervalo estudado, a temperatura, a razo molar entre os
substratos e a concentrao de gua adicionada ao meio tiveram um efeito negativo na
converso em steres.
As condies amenas exigidas pela catlise enzimtica tornam essa rota alternativa
promissora, apesar dos custos da aquisio do biocatalisador ainda serem elevados.
Entretanto, diante dos bons resultados obtidos com o derivado de quitosana, os insumos com a
produo do catalisador podem diminuir, uma vez que a quitosana um suporte barato.

Captulo 5 Concluses Costa Filho, E.H. 86
Os resultados dos planejamentos possibilitaram a proposta de um modelo emprico

que demonstrou uma boa concordncia com os dados experimentais, obtendo-se, em 8 horas
de reao, uma converso mxima de 88,36% para a esterificao do cido olico e, em 72
horas de reao, 82,66% de converso para a transesterificao do leo de algodo residual.
A avaliao do nmero de ciclos em que a enzima imobilizada poderia ser utilizada

sem perda considervel de atividade foi realizada, concluindo que a enzima pode ser
reutilizada por no mnimo 10 vezes aps o primeiro uso, o que no acontece com os
catalisadores qumicos convencionais que, sendo homogneos, no so separados ao final do
processo.
Sendo assim, os resultados dessa dissertao indicam a possibilidade do uso de lipases

em reaes de alcolise de leos vegetais residuais cidos objetivando a produo de
biodiesel, tornando possvel o uso de matrias-primas de baixo valor agregado, contribuindo,
dessa forma, para reduo da poluio ambiental, tanto por produzir um combustvel
ambientalmente correto como por dar um destino mais nobre a um produto sem serventia e
que despejado no meio ambiente indiscriminadamente.

Referncias Bibliogrficas Costa Filho, E.H. 87
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Anexos Costa Filho, E.H. 95
ANEXO
Resoluo ANP N 7, de 19.3.2008 - DOU 20.3.2008
REGULAMENTO TCNICO N 7/2008 (Especificao do Biodiesel-B100).
CARACTERSTICA UNIDADE LIMITE MTODO

ABNT ASTM EN/ISO
NBR D
Aspecto - LII (1) - - -
3
Massa especfica a 20 C kg/m 850-900 7148 1298 EN ISO
3675 - EN
14065 4052 ISO 12185
2
Viscosidade Cinemtica a 40C mm /s 3,0-6,0 10441 445 EN ISO
3104
Teor de gua, mx. (2) mg/kg 500 - 6304 EN ISO
12937
Contaminao Total, mx. mg/kg 24 - - EN ISO
12662
Ponto de fulgor, mn. (3) C 100,0 14598 93 EN ISO
3679
-
Teor de ster, mn % massa 96,5 15342 - EN 14103
(4) (5)
Resduo de carbono (6) % massa 0,050 - 4530 -
Cinzas sulfatadas, mx. % massa 0,020 6294 874 EN ISO
3987
Enxofre total, mx. mg/kg 50 - 5453 -
- EN ISO
20846
EN ISO
20884
Sdio + Potssio, mx. mg/kg 5 15554 - EN 14108
15555 EN 14109
15553 EN 14538
15556
Clcio + Magnsio, mx. mg/kg 5 15553 - EN 14538
15556
Fsforo, mx. mg/kg 10 15553 4951 EN 14107
Corrosividade ao cobre, 3h a 50 - 1 14359 130 EN ISO
C, mx. 2160

Nmero de Cetano (7) - Anotar - 613 EN ISO

5165
6890
(8)
Ponto de entupimento de filtro a C 19 (9) 14747 6371 EN 116
frio, mx.
ndice de acidez, mx. mg KOH/g 0,50 14448 664 -
- - EN 14104
(10)
Glicerol livre, mx. % massa 0,02 15341 6584 -
(5) (10)
EN 14105
- - (10)
- EN 14106
(10)
Glicerol total, mx. % massa 0,25 15344 6584 -
(5) (10)
EN 14105
- - (10)
Mono, di, triacilglicerol (7) % massa Anotar 15342 6584 -
(5) (10)
-
15344
(5) EN 14105
(10)
Metanol ou Etanol, mx. % massa 0,20 15343 - EN 14110
ndice de Iodo (7) g/100g Anotar - - EN 14111
Estabilidade oxidao a 110C, h 6 - - EN 14112
mn.(2) (10)
Nota:
(1) LII Lmpido e isento de impurezas com anotao da temperatura de ensaio.
(2) O limite indicado deve ser atendido na certificao do biodiesel pelo produtor ou
importador.
(3) Quando a anlise de ponto de fulgor resultar em valor superior a 130C, fica dispensada a
anlise de teor de metanol ou etanol.
(4) O mtodo ABNT NBR 15342 poder ser utilizado para amostra oriunda de gordura
animal.

(5) Para biodiesel oriundo de duas ou mais matrias-primas distintas das quais uma consiste
de leo de mamona:
a) teor de steres, mono-, diacilgliceris: mtodo ABNT NBR 15342;
b) glicerol livre: mtodo ABNT NBR 15341;
c) glicerol total, triacilgliceris: mtodo ABNT NBR 15344;
d) metanol e/ou etanol: mtodo ABNT NBR 15343.
(6) O resduo deve ser avaliado em 100% da amostra.
(7) Estas caractersticas devem ser analisadas em conjunto com as demais constantes da tabela
de especificao a cada trimestre civil. Os resultados devem ser enviados pelo produtor de
biodiesel ANP, tomando uma amostra do biodiesel comercializado no trimestre e, em caso
de neste perodo haver mudana de tipo de matria-prima, o produtor dever analisar nmero
de amostras correspondente ao nmero de tipos de matrias-primas utilizadas.
(8) Poder ser utilizado como mtodo alternativo o mtodo ASTM D6890 para nmero de
cetano.
(9) O limite mximo de 19C vlido para as regies Sul, Sudeste, Centro-Oeste e Bahia,
devendo ser anotado para as demais regies. O biodiesel poder ser entregue com
temperaturas superiores ao limite supramencionado, caso haja acordo entre as partes
envolvidas. Os mtodos de anlise indicados no podem ser empregados para biodiesel
oriundo apenas de mamona.
(10) Os mtodos referenciados demandam validao para as matrias-primas no previstas no

mtodo e rota de produo etlica.

Estudo Da Produção Enzimática de Biodiesel

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEAR

EDILSON HOLANDA COSTA FILHO

ESTUDO DA PRODUO ENZIMTICA DE BIODIESEL

Dissertao de Mestrado submetida Coordenao do

Orientadora: Prof. Dra. Luciana Rocha Barros Gonalves

Orientador: Profa. Dra. Luciana Rocha Barros Gonalves

1. Lpase imobilizada 2. Esterificao 3. Transesterificao I. Gonalves,

ESTUDO DA PRODUO ENZIMTICA DE BIODIESEL UTILZANDO LEO

Dissertao submetida Coordenao do Programa de Ps-Graduao em Engenharia

pelo apoio e incentivo

durante essa caminhada

A Deus, por simplesmente tudo.

Aos bolsistas do laboratrio de biotecnologia do Departamento de Engenharia

A NOVOZYMES, pelo fornecimento da lpase.

Ao professor Rinaldo dos Santos Arajo, do Centro Federal de Educao Tecnolgica

Ao aluno de mestrado Bruno Csar Barroso Salgado, do CEFET, pelas anlises de

A empresa IRACEMA, pelo fornecimento do leo de algodo.

Ao Jackson, da Fundao Ncleo de Tecnologia Industrial do Cear (NUTEC), pelas

A Rosilene, da empresa TECBIO, pelas dvidas tiradas.

Ao Estlio, do Laboratrio de Combustveis e Lubrificantes (LCL) pelas anlises de

Ao CNPq, pela concesso da bolsa de estudos.

PALAVRAS-CHAVE: Biodiesel, leo residual, etanol, lipase imobilizada, esterificao,

KEY WORDS: Biodiesel, waste oil, ethanol, immobilized lipase, esterification,

FIGURA 2.1 Mecanismo da esterificao enzimtica com etanol ...................... 26

FIGURA 2.3 Mecanismo da transesterificao enzimtica com etanol .............. 28

FIGURA 3.1 Fluxograma do procedimento experimental para a reao de

FIGURA 4.1 Cromatograma do cido olico ...................................................... 57

FIGURA 4.2 Cromatograma do leo de coco residual ........................................ 58

FIGURA 4.3 Cromatograma do leo de algodo residual ................................... 59

FIGURA 4.4 Diagrama de Pareto indicando o efeito dos valores estimados

FIGURA 4.5 Valores preditos pelo modelo versus valores experimentais da

FIGURA 4.6 Superfcie de resposta representando a converso em funo da

FIGURA 4.7 Influncia da temperatura na esterificao enzimtica do cido

FIGURA 4.8 Influncia da temperatura na esterificao enzimtica do cido

FIGURA 4.9 Influncia da razo molar cido:lcool na esterificao

FIGURA 4.10 Influncia da razo molar cido:lcool na esterifcao enzimtica

FIGURA 4.11 Influncia da concentrao de gua na esterifcao enzimtica do

FIGURA 4.12 Influncia do aumento da concentrao de lcool com o aumento

FIGURA 4.13 Comparao do comportamento da Lipase de Candida Antarctica

FIGURA 4.14 Comparao do comportamento da Novozym 435 na reao de

FIGURA 4.15 Estabilidade operacional da Novozym 435 e da Lipase de Candida

FIGURA 4.17 Valores previstos pelo modelo versus valores experimentais

FIGURA 4.18 Superfcie de resposta para a converso em funo da temperatura

FIGURA 4.19 Superfcie de resposta para a converso em funo da temperatura

TABELA 2.1 Comparao das propriedades fsico-qumicas .............................. 17

TABELA 2.2 Distribuio espacial das principais fontes de oleaginosas pelas

TABELA 2.3 Comparao entre a catlise qumica e a catlise enzimtica para

TABELA 2.4 Classificao das enzimas de acordo com IUBMB ........................ 35

TABELA 3.1 Valores reais das variveis independentes para o Planejamento

TABELA 3.2 Valores reais das variveis independentes para o Planejamento

TABELA 4.1 Caracterizao fsico-qumica das matrias-primas lipdicas

TABELA 4.2 Percentuais de cidos graxos para o cido olico ........................... 57

TABELA 4.5 Resultados do Planejamento Fatorial 23 com triplicata do ponto

TABELA 4.6 Estimativa dos efeitos principais e suas interaes na converso

TABELA 4.7 Anova para a reao de alcolise enzimtica do cido olico

TABELA 4.8 Converses obtidas na alcolise enzimtica do leo de algodo

TABELA 4.9 Estimativa dos efeitos principais e suas interaes na converso

TABELA 4.10 ANOVA para a reao de alcolise enzimtica do leo de

TABELA 4.11 Caracterizao fsico-qumica dos steres etlicos ........................ 83

2 REVISO BIBLIOGRFICA ........................................................................ 16

2.1 Contexto Histrico ............................................................................................ 16

2.2 Matrias-primas ............................................................................................... 19

2.3 Mtodos de obteno de biodiesel ................................................................... 23

2.3.1 Microemulsificao ................................................................................ 24