Universidad de Chile

Facultad de Medicina
Escuela de Kinesiologa

DETERMINACIN DE LA CAPACIDAD
PROTECTORA DE ANTOCIANINAS DE UN
EXTRACTO DE VITIS vinifera EN AORTAS DE RATA
SOMETIDAS A ESTRS OXIDATIVO

AUTORES:
Isabel Margarita Muoz Muoz
Vctor Emanuel Soto Rojas

2005
 DETERMINACIN DE LA CAPACIDAD PROTECTORA DE
ANTOCIANINAS DE UN EXTRACTO DE VITIS vinifera EN
AORTAS DE RATA SOMETIDAS A ESTRS OXIDATIVO

Tesis entregada a la
UNIVERSIDAD DE CHILE
en cumplimiento parcial de los requisitos
para optar al grado de
LICENCIADO EN KINESIOLOGIA

FACULTAD DE MEDICINA

Por

Isabel Margarita Muoz Muoz

Vctor Emanuel Soto Rojas

2005

Director de Tesis: Profesor Asistente Sandro Bustamante Delgado, M. Sc.

Patrocinante de Tesis: Sra. Sylvia Ortiz Ziga, M. Sc.
 UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE MEDICINA

INFORME DE APROBACIN
TESIS DE LICENCIATURA

Se informa a la Escuela de Kinesiologa de la Facultad de Medicina que la

Tesis de Licenciatura presentada por los candidatos:

Isabel Margarita Muoz Muoz

Vctor Emanuel Soto Rojas

Ha sido aprobada por la Comisin Informante de Tesis como requisito para

optar al grado acadmico de Licenciado en Kinesiologa, en el examen de defensa
de Tesis rendido el Martes 4 de Enero del 2005.

DIRECTOR DE TESIS

Sandro Bustamante Delgado ............................................................

COMISIN INFORMANTE DE TESIS

NOMBRE FIRMA

Sra. Sylvia Ortiz Z. ............................................................

Sra. Soledad Bollo ............................................................

Sra. Gladys Tapia ............................................................

 AGRADECIMIENTOS

Nuestros ms sinceros agradecimientos a todos aquellos que colaboraron

de una u otra manera al desarrollo y trmino de esta tesis.
A todas nuestras ratas que sin ellas no podramos haber realizado esta
tesis, por su colaboracin para lograr hacer ciencia.
A Don Juan por estar siempre dispuesto a ayudarnos ante cualquier
problema y duda que pudiera suscitarse en el transcurso de cada uno de los
experimentos.
A los docentes Miguel Morales y Roberto Gallardo por su apoyo fsico y
moral, ante las dificultades.
Al Dr. Ramn Rodrigo que colabor con la revisin de nuestro anteproyecto
y proyecto, entregando sus conocimientos para encausar nuestra tesis.
A Anbal, Osvaldo, Don Jos y dems funcionarios de la biblioteca de
nuestra facultad, por su constante apoyo y disposicin en la bsqueda de material
bibliogrfico.
A nuestros compaeros de laboratorio, que nos apoyaron en variadas
ocasiones en el desarrollo de los experimentos.
Al encargado del agua destilada que siempre nos guard provisiones para
efectuar nuestra investigacin.
A mi compaero de tesis, por su motivacin, responsabilidad,
conocimientos ante este desafo que nos propusimos a comienzos de ao,
principalmente por ser una tesis que se desarroll en un rea en que los
Kinesilogos no presentan una relevante participacin.
A nuestras familias y amigos que nos animaron y recordaron que no en
todas las investigaciones se logra corroborar la hiptesis de trabajo y que an
siendo as, es un aporte a la ciencia.
Finalmente los agradecimientos a nuestro tutor que nos gui en cada paso
de nuestra investigacin, como tambin por su constante entrega de tiempo y
conocimientos.
Dedicado a mi madre, por darme su infinito cario y amor.

A mis abuelos, por ensearme a servir a los dems.

A Dios por protegerme cada da.

Al que amo, por ser mi alegra de cada da

Isabel Margarita

A Perro

Probeta
 INDICE

RESUMEN ....................................................................................................... i
SUMMARY ...................................................................................................... ii
ABREVIATURAS.............................................................................................iii

INTRODUCCIN ............................................................................................ 1
MARCO TERICO.......................................................................................... 3
Msculo liso.......................................................................................... 3
Especies reactivas de oxgeno ............................................................. 4
Estrs oxidativo .................................................................................... 5
Sistema antioxidante ............................................................................ 6
Polifenoles ............................................................................................ 7
Antocianinas ......................................................................................... 8
Vitis vinifera .......................................................................................... 8

OBJETIVOS .................................................................................................. 10
Generales ........................................................................................... 10
Especficos ......................................................................................... 10

HIPTESIS ................................................................................................... 11
VARIABLES .................................................................................................. 11
MATERIALES Y MTODO............................................................................ 12
Diseo de investigacin...................................................................... 12
Tipo de estudio ................................................................................... 12
Criterios de inclusin/exclusin .......................................................... 12
Animales............................................................................................. 12
Obtencin y preparacin de segmentos de aorta ............................... 12
Estabilizacin del aparato contrctil de la aorta.................................. 13
Contraccin inducida por Fenilefrina (FE) .......................................... 13
 Generacin de especies reactivas del oxgeno (EROs)
mediante electrlisis ........................................................................... 14
Grupos experimentales....................................................................... 14
Reactivos y soluciones ....................................................................... 15
Anlisis estadstico ............................................................................. 15

RESULTADOS .............................................................................................. 16
Contraccin inducida por Fenilefrina pre electrlisis .......................... 16
Contraccin inducida por Fenilefrina post electrlisis ......................... 16
Contraccin inducida por electrlisis .................................................. 17

DISCUSIN .................................................................................................. 18
CONCLUSIONES.......................................................................................... 21
PROYECCCIONES....................................................................................... 22
BIBLIOGRAFA ............................................................................................. 23

ANEXOS ....................................................................................................... 27
Anexo 1 Estructura qumica de las antocianinas ............................ 27
Anexo 2 Metabolismo del oxgeno .................................................... 28
Anexo 3 Generacin de radical hidroxilo ......................................... 29
Anexo 4 Generacin de radical superxido ..................................... 30
Anexo 5 Mecanismo de estabilizacin de EROs de
de los flavonoides ............................................................... 31
Anexo 6 Montaje del bao de rganos ............................................ 32

APENDICE .................................................................................................... 33
Tabla 1................................................................................................ 33
Figura 1 .............................................................................................. 34
Tabla 2................................................................................................ 35
Figura 2 .............................................................................................. 36
Figura 3 .............................................................................................. 37
 RESUMEN

La produccin de EROs es natural en distintos procesos metablicos. La

exposicin a niveles suprafisiolgicos de EROs, denominada estrs oxidativo,
puede provocar dao a las biomolculas de los tejidos. Cuando la capa de
msculo liso que compone los vasos es expuesta a EROs, el dao generado
provoca que el msculo liso disminuya su capacidad contrctil, con la consecuente
prdida de capacidad para regular el tono vasomotor.
Para contrarrestar los efectos deletreos del estrs oxidativo, existen
mecanismos antioxidantes endgenos que actan capturando las EROs. Sin
embargo, en ciertos estados patolgicos estos mecanismos se ven sobrepasados.
Una de las estrategias para disminuir el impacto negativo del estrs oxidativo ha
sido reforzar los mecanismos antioxidantes endgenos mediante la
suplementacin dietaria de compuestos antioxidantes o, la administracin
teraputica de medicamentos con accin antioxidante, como las vitaminas C y E y,
algunos compuestos polifenlicos, como los contenidos en extractos de V. vinifera.
El objetivo del presente estudio fue determinar si el extracto seco de Vitis
vinifera que contiene 0.02% p/p de antocianinas referido a malvidina 3-glicsido,
posee efectos protectores in vitro contra el estrs oxidativo producido por
electrlisis sobre anillos articos de rata y determinar su posible dependencia de la
concentracin.
No obstante lo anterior, nuestros resultados sugieren que el extracto usado
(250 ng/mL y 500 ng/mL) no demostr proteger los anillos articos sometidos a un
modelo fisiolgico de dao por EROs inducido por electrlisis, dao que si fue
prevenido por DMSO, un agente especfico para capturar anin superxido y
radical hidroxilo. Si bien ha sido demostrada la accin antioxidante de antocianinas
en diversos modelos fsico-qumicos in vitro, se sugiere ensayar su potencial
farmacolgico de proteccin al estrs oxidativo en otros modelos fisiolgicos.

PALABRAS CLAVE: V. vinifera, antocianinas, msculo liso vascular, estrs

oxidativo, aorta de rata.

i
 SUMMARY

EROs production is natural in different metabolic processes. The exposure

at supraphysiological levels of EROs, denominated oxidative stress, causes
damage to tissue biomolecules. When the smooth muscle layer that composes the
blood vessels is exposed to EROs, the generated damage causes that the smooth
muscle diminishes its contractile capacity, with the consequent loss of capacity to
regulate the vasomotor tone.
In order to resist the harmful effects of oxidative stress, endogenous
antioxidant mechanisms exist that act capturing the EROs. Nevertheless, in certain
pathological states these mechanisms are overwhelmed. One of the strategies to
diminish the negative impact of oxidative stress has been to reinforce endogenous
antioxidant mechanisms by supply of dietary antioxidant compounds or,
administration of therapeutic medicine with antioxidant action, like vitamins C and
E and, some poliphenolic compounds, like those contents in V. vinifera extracts.
The objective of the present study was to determine if the 0.02% malvidin-
3-glucoside anthocianyns-referred standardized extract has protective effects in
vitro against oxidative stress produced by electrolysis on rat aortic ring, and to
determine its possible dependency of the concentration.
Despite previous facts, our results suggest the used extract (250 ng/mL and
500 ng/mL) did not demonstrate to protect the aortic ring submissive a
physiological model of damage by EROs induced by electrolysis, damage that if it
were come up by DMSO, a specific agent to capture superoxide anion and
hydroxyl radical. Although anthocyanins antioxidant action has been demonstrated
in diverse physical-chemical models in vitro, it is suggested to try its
pharmacological potential of protection to oxidative stress in other physiological
models.

KEY WORDS: V. vinifera, anthocyanins, vascular smooth muscle, oxidative

stress, rat aorta .

ii
 ABREVIATURAS

Ca+2 : Ion calcio.

CIF : Contraccin inducida por fenilefrina.
CIE : Contraccin inducida por electrlisis.
FE : Fenilefrina.
DMSO: Dimetil sulfxido.
EvvA : Extracto seco de Vitis vinifera, variedad Cabernet Sauvignon, que contiene
0.02% p/p de antocianinas referido a malvidina 3-glicsido.
EROs : Especies reactivas del oxgeno.
ROS : Reactive oxygen species.
KHm : Solucin Krebs-Henseleit modificada.
O 2 - : Anin superxido.
OH : Radical hidroxilo.

iii
 INTRODUCCIN

La produccin de las EROs es un proceso natural, inevitable y constante;

un continuo biolgico, consecuencia de la vida en un ambiente aerbico. Todas las
clulas, independiente de su tipo, estn permanentemente produciendo EROs. El
dao que las EROs provocan en los diferentes tejidos depende del balance entre
su produccin y las defensas antioxidantes de que dispone el organismo. Si la
produccin de EROs es mayor que la capacidad antioxidante endgena, sta
puede llevar a daos irreparables en los tejidos. En el msculo liso vascular, la
exposicin a EROs provoca una vasoconstriccin inducida por EROs, mediada por
derivados del cido araquidnico; y una prdida de la capacidad contrctil del
msculo liso por alteracin de canales de Ca+2. Todo esto conlleva una prdida de
la capacidad de regulacin del tono vascular. Esto contribuye a la aparicin y
desarrollo de una serie de patologas cardiovasculares, entre otras,
ateroesclerosis, hipertensin arterial, trombosis profunda y enfermedad de
Alzheimer.
Los sistemas antioxidantes endgenos pueden ser reforzados mediante la
incorporacin en la dieta de compuestos antioxidantes que actan como
coadyuvantes frente al efecto deletreo de la exposicin a EROs. Existen
abundantes estudios cientficos que demuestran que compuestos polifenlicos
como los flavonoides, pueden actuar capturando estas EROs. Si bien la mayora
de los reportes se basan en la determinacin de su capacidad antioxidante en
ensayos in vitro, de carcter fsico-qumico, se ha extrapolado su potencial
beneficio en la proteccin cardiovascular, potencial que posee sustentacin en
estudios epidemiolgicos. No obstante, no hay suficiente evidencia experimental
que aporte antecedentes respecto de la capacidad de proteccin de flavonoides
ante estrs oxidativo en modelos fisiolgicos o funcionales.
Este estudio pretende determinar el efecto protector del EVvA frente al dao
provocado por EROs en el msculo liso vascular.
Se ha demostrado que otros compuestos del tipo flavonoide, como las
proantocianinas, poseen efectos protectores contra los efectos deletreos de las

1
EROs. Sin embargo, los altos costos del proceso de extraccin de las
proantocianinas no las convierte en alternativas atractivas para su uso
fitofarmacutico. Las antocianinas, en cambio, de estructura ms simple que las
anteriores, poseen un proceso de extraccin de menor complejidad y menor costo,
lo que hara ms atractivo del punto de vista farmacotcnico la fabricacin de un
fitofrmaco a partir de antocianinas, siempre y cuando, su eficacia farmacolgica
fuese al menos igual al perfil demostrado por las proantocianinas.
A diferencia de los frmacos alopticos, cuyos rangos teraputicos son muy
estrechos, los fitofrmacos tienen rangos muy amplios, por lo cual se hace menos
probable alcanzar la concentracin mnima txica, adems de poseer escasos
efectos secundarios.
La posible limitacin de la presente tesis est impuesta por el modelo
experimental, ya que ste se circunscribe a la evaluacin de la capacidad de
proteccin de EVvA ante la accin deletrea de O2.- y OH en un modelo funcional
in vitro. Por otra parte, no permite que los resultados obtenidos puedan ser
extrapolados directamente a modelos in vivo.

2
 MARCO TERICO

Msculo Liso
El msculo liso est formado por fibras musculares lisas que corresponden
a clulas uninucleadas, delgadas y aguzadas en los extremos, cuya longitud vara
entre 20 y 500 m. Existen distintos tipos de msculo liso: multiunitario y unitario,
siendo este ltimo el que se encuentra en las paredes vasculares (Guyton, 2001).
En la variedad unitaria de msculo liso, las fibras se encuentran asociadas en
capas o haces, gracias a lo cual pueden actuar como una sola, transmitiendo las
fuerzas generadas. Las uniones estrechas que presentan entre sus membranas
celulares permiten el paso de iones, mediante los cuales se propaga el potencial
de accin.
El aparato contrctil del msculo liso no posee una estructura fibrilar
definida como el msculo estriado (Berne, 1999). Si bien carece de troponina, hay
abundantes miofilamentos finos de actina que forman parte del citoesqueleto,
anclados a los cuerpos densos y reas densas de membrana. Estos miofilamentos
estn solapados alrededor de una proporcin menor de miofilamentos gruesos de
miosina, alineados aproximadamente a lo largo del eje celular en el sentido de
generacin de la fuerza. Este sistema puede atravesar las membranas
plasmticas de las clulas musculares (Guyton, 2001).
El proceso de contraccin del msculo liso est regulado por Ca+2 (Guyton,
2001; Berne, 1999; Karaki y cols., 1997). Existen cuatro mecanismos reguladores
del flujo de Ca+2 intracelular:
Activacin de canales de Ca+2 por receptores del sarcolema dependientes
de ligando que estimulan la liberacin de Ca+2 desde el retculo
sarcoplsmico.
Intercambio Na+/ Ca+2 .
Activacin de canales catinicos inespecficos.
Activacin de canales de Ca+2 voltaje dependientes (tipo L), ya sea por
potencial de accin, por depolarizacin inducida o por canales de calcio

3
 dependiente de ligando, siendo sta la va ms importante (Berne, 1999;
Karaki y cols., 1997).
La accin de los agonistas adrenrgicos como norepinefrina est medida
por todos estos mecanismos anteriormente mencionados para la movilizacin de
Ca+2, adems de sensibilizar los elementos contrctiles del msculo que son
sensibles a Ca+2, aumentando as la fuerza de contraccin a determinadas
concentraciones de Ca+2 intracelular (Karaki y cols., 1997).
La contraccin del msculo liso tiene dos fases: una rpida o transiente,
dependiente del Ca+2 liberado del retculo sarcoplsmico que induce la fase lenta o
de meseta dependiente de la entrada de Ca+2 extracelular. El aumento de Ca+2
intracelular permite la contraccin, porque al unirse a calmodulina se genera un
complejo que va a activar a la miosina quinasa de cadena ligera. La miosina
quinasa de cadena ligera, a su vez, fosforila a la miosina, permitiendo el
deslizamiento sobre la miosina y con esto se genera la contraccin muscular
(Karaki y cols., 1997).

Especies Reactivas de Oxgeno (EROs)

Las EROs son especies reactivas derivadas del oxgeno que incluyen
molculas qumicas radicalarias y no radicalarias, siendo estas ltimas, agentes
oxidantes que fcilmente pueden ser convertidas a radicales (Finkel y cols., 2000).
Las especies radicalarias se caracterizan por que su estructura atmica presenta
un electrn desapareado en su orbital externo, lo que le da una configuracin
espacial altamente inestable, como el anin superxido (O2.-) y el radical hidroxilo
(OH). Entre las especies no radicalarias mencionamos el perxido de hidrgeno
(H2O2), y el oxgeno singlete (102) (Halliwell y cols., 1999). Las especies
radicalarias del oxgeno tienen vida media corta debido a su gran reactividad por
su o sus electrones desapareados, los cuales interactan con molculas o
elementos que generalmente poseen electrones apareados, producindose una
oxidacin de las molculas estructurales de las clulas causando dao irreversible
(Pietta, 2000).

4
 Las reacciones univalentes que llevan a la formacin de las EROs se deben
a la reduccin sucesiva del oxgeno a anin superxido al incorporar un electrn, a
perxido de hidrgeno al aceptar 2 electrones y a radical hidroxilo al aceptar 3
electrones (Anexo 2) (Guyton, 2001).
Las EROs tienen diferentes funciones en los seres vivos, de los cuales son
elementos constitutivos (Peters y cols., 1999). Las funciones favorables son la
produccin de energa, fagocitosis, regulacin de crecimiento celular, seales
intercelulares y sntesis de importantes compuestos biolgicos. Dentro de las
reacciones deletreas estn las que afectan a lpidos de membrana
(lipoperoxidacin), dao oxidativo a protenas de tejidos y enzimas, por medio de
la modificacin de algunos amino cidos que son ms susceptibles; carbohidratos
y cidos nucleicos (Pietta, 2000; Cheeseman y cols., 1993).
En los seres vivos, las EROs pueden provenir de distintas fuentes. Durante
el metabolismo aerbico las clulas generan energa reduciendo al oxgeno
molecular hasta la formacin de agua. Esta reaccin, que ocurre en la mitocondria,
es catalizada por la citocromo c oxidasa, involucra la transferencia de cuatro
electrones al oxgeno sin formacin de intermediarios. Pero una pequea
proporcin del oxgeno, de 2 a 4%, puede aceptar un menor nmero de electrones
(Rodrigo y cols., 2003), donde en vez de la produccin de agua se forman como el
OH y el O2.- (Rodrguez y cols., 2001). En el plasma sanguneo se est generando
H2O2 continuamente a partir de la oxidacin del GSH y del ascorbato (Halliwell y
cols., 1999). Los macrfagos y neutrfilos activados liberan EROs para destruir
organismos patgenos dentro del proceso de fagocitosis (Market y cols., 1984).
Los peroxisomas y la enzima xantina oxidasa, que degradan estas sustancias,
EROs contenidas en alimentos de consumo habitual como caf, t, chocolate y
bebidas de cola (Pietta, 2000).

Estrs Oxidativo
Cuando el equilibrio entre radicales libres y antioxidantes se pierde en favor
de los primeros, se desencadenan procesos dainos que se asocian al desarrollo
de numerosas enfermedades, lo que se denomina estrs oxidativo (Finkel y cols.,

5
2000). Esto puede deberse a una disminucin de los sistemas antioxidantes, un
aumento de las especies prooxidantes o ambas (Sies, 1993).
A nivel molecular, se ha comprobado, en msculo liso, que las EROs
interfieren con la apertura de canales de Ca+2 voltaje dependientes de gran
conductancia unitaria, tanto en el nmero de canales como en su probabilidad de
apertura (Soto y cols., 2002), lo que alterara la integridad vasomotora y afectara
la maquinaria contrctil de los vasos.

Sistema antioxidante
A la permanente produccin de EROs que daan estructuras
biolgicas, el organismo atena estos efectos deletreos por medio de la accin
de sistemas antioxidantes.
Los antioxidantes son sustancias que se encuentran en pequeas
concentraciones en comparacin a un sustrato oxidable, que retrasa o inhibe
significativamente la oxidacin del sustrato, y tambin estabiliza las EROS
mediante la cesin de un H+ y las convierte en compuestos no radicalarios. Otras
definiciones hablan de antioxidante como cualquier sustancia que, al estar
presente en bajas concentraciones comparada a las de un sustrato oxidable,
previene o retarda la oxidacin de dicho sustrato y que protege a los sistemas
biolgicos frente a efectos potencialmente perjudiciales tanto de procesos como
reacciones que causan excesivas oxidaciones (Halliwell y cols., 1999).
Existen diferentes sistemas de defensa antioxidante en el organismo. Uno
de ellos est conformado por sistemas enzimticos como la superxido dismutasa,
catalasa y glutatin peroxidasa, siendo stas la primera defensa contra los
radicales libres que actan neutralizando a estas especies altamente reactivas en
molculas menos dainas para la clula. Otros sistemas, no enzimticos, estn
conformado por compuestos como caroteniodes, glutatin reducido y las vitaminas
C y E que estabilizan las EROs o tambin que provocan la quelacin de iones
metlicos de elementos de transicin como hierro y cobre, que al estar en estado
reducido potencian su autoxidacin y generacin de anin superxido (Anexo 4)
(Sies, 1993).

6
 Los antioxidantes aportados por la dieta disminuyen los efectos de las
EROs. Son variados los alimentos que estn constituidos por estas sustancia y
cada vez ms utilizados por las personas tanto por medio del consumo directo de
vegetales y frutas que los incluyen, como tambin por medio del uso de frmacos.
Entre los antioxidantes ingeridos por la dieta se destacan las vitaminas E y C, los
betacarotenos, procianidinas y polifenoles.

Polifenoles
Compuestos orgnicos que estructuralmente presentan un grupo -OH unido
a un anillo aromtico, que se conocen como compuestos fenlicos y aquellos en
que se repite este radical son conocidos como polifenoles.
Los compuestos de esta familia presentan variados efectos beneficiosos
para la salud: prevencin contra cncer (Hou, 2003), propiedades antiinflamatorias
(Youdim y cols., 2002), antialrgicas (Middleton y cols., 1992), antitumorales
(Bingham S., 1990), antimicrobianas (Nishino y cols., 1987), vasorelajantes
(Bustamante y cols., 2003) y antioxidantes (Youdim y cols., 2000; Serraino y cols.,
2003; Aldini y cols., 2003). Entre sus acciones antioxidantes encontramos la
inhibicin de la formacin de EROs por medio de la inhibicin de enzimas
productoras de EROs como la xantino oxidasa, o la quelacin de los elementos
traza involucrados en la produccin de EROs; el atrapamiento directo de EROs y
el up-regulation de los sistemas antioxidantes endgenos (Pietta, 2000).
Los polifenoles estabilizan las EROs al capturarlas formando el radical
aroxilo (FI-O), para luego reaccionar con un segundo radical, con lo cual
adquieren una estructura quinona estable (Anexo 6)(Pietta, 2000).
Los polifenoles ms estudiados provenientes de extracto seco
estandarizado de Vitis vinifera son antocianinas, procianidinas y proantocianidinas,
entre otros, los cuales son sustancias bioactivas. Estos actan atrapando los
radicales libres para luego tranformarlo en especies no radicalarias, por inhibicin
de la accin enzimtica de elastasa e hialuronidasa (Bustamante y cols., 2003).
Estudios clnicos demuestran que el uso teraputico de los polifenoles
provenientes de la Vitis vinifera, reducen la incidencia de enfermedades
cardiovasculares; disminuye el riesgo de insuficiencia cardiaca; alivio de sntomas

7
en pacientes con insuficiencia venosa (German y cols., 2000; Bustamante y cols.,
2003).

Antocianinas
Las antocianinas (del Griego anthos significa flores y kyanos azul) es el
pigmento ms importante de las plantas, visible al ojo humano.
Dentro de este grupo encontramos a las antocianinas, que se diferencian de
otros polifenoles por poseer azcares dentro de sus grupos funcionales y, en su
mayora, presentar varios grupos OH (Muoz y cols., 2003). Las diferencias
individuales entre los antocianinas dependen del nmero de grupos hidroxilo, la
naturaleza y nmero de azcares que estn unidos a la molcula, a la posicin de
esa unin y la naturaleza y nmero de cidos aromticos unidos al azcar en la
molcula (Kong y cols., 2003).
Las antocianinas poseen conocidas propiedades farmacolgicas utilizadas
para la terapia de un amplio espectro de enfermedades. Las investigaciones
realizadas con extractos de Vitis vinifera ricos en antocianinas, han mostrado que
disminuyen la fragilidad y permeabilidad capilar; tambin efectos antiinflamatorios
y actividad antiedema (Wagner, 1985).
El estudio de la capacidad antioxidante de las antocianinas provenientes de
vino tinto, muestran que son efectivos en el secuestro de EROs y tambin en la
inhibicin de la lipoperoxidacin (Ghiselli y cols., 1998; Jankowski y cols., 2000).
La capacidad antioxidante se relaciona con el nmero de grupos OH que
presenten y el lugar de la sustitucin (Wang y cols., 1997). A su vez las
antocianinas son compuestos muy sensibles a cambios de pH y temperatura
debido a la deficiencia del electrn en su estructura (Satu-Gracia y cols., 1997).

Vitis vinifera
Las antocianinas que forman parte del EVvA utilizado en este estudio
provienen de la Vitis vinifera, que es un arbusto trepador originario de la zona
mediterrnea y de Asia Menor, actualmente cultivada en casi todo el mundo. Se
caracteriza por su altura variable y sus ramas cilndricas. Sus hojas son de forma

8
variable, pero siempre lobuladas y ligeramente dentadas; su color vara en
tonalidad de verde, dependiendo de la variedad. Las flores, pequeas y poco
aparentes, son de color verdoso. El fruto (la uva) es una baya ovalada o redonda y
pulposa, puede ser de color verde, rojo-pardo y negro dependiente de la variedad.
En su interior encontramos las semillas. Son de las semillas y del orujo de la uva,
como del proceso de fermentacin del vino, en tinajas de roble, de donde se
extraen los compuestos bioactivos, entre las que hayamos antocianinas (Muoz y
cols., 2003).

9
 OBJETIVOS

Objetivo General

Determinar la capacidad de prevencin in vitro del efecto deletreo

provocado por EROS inducidas por electrlisis sobre la capacidad contrctil del
msculo liso vascular artico, mediante un extracto seco de Vitis vinifera, variedad
Cabernet Sauvignon, que contiene 0.02% p/p de antocianinas referido a malvidina
3-glicsido (EVvA).

Objetivos Especficos

1. Determinar y cuantificar la eficacia del EVvA en la prevencin de la accin de

las EROs inducidas por electrlisis sobre la capacidad contrctil del msculo
liso de los anillos articos.

2. Determinar si el efecto protector del EVvA sobre la capacidad contrctil de la

musculatura lisa de los anillos articos, inducido por EROs, es dosis
dependiente.

10
 HIPTESIS

H1 : El EVvA posee efecto protector contra la alteracin de la capacidad contrctil

del msculo liso vascular de aortas de rata, derivado de la accin deletrea
de EROs inducidas por electrlisis.
H0 : El EVvA no posee efecto protector contra la alteracin de la capacidad
contrctil del msculo liso vascular de aortas de rata, derivado de la accin
deletrea de EROs inducidas por electrlisis.
H2 : El efecto protector del EVvA sobre aorta de rata es dosis dependiente.
H0 : El efecto protector del EVvA sobre aorta de rata no es dosis dependiente.

VARIABLES

Variable Independiente: Dosis del extracto de Vitis vinifera.

Definicin Conceptual: Dosis a la cual esperamos observar efectos protectores
contra el dao vascular producido por EROs.
Definicin Operacional: 250 ng/mL y 500 ng/mL de EVvA.

Variable Dependiente: Capacidad contrctil del msculo liso vascular.

Definicin Conceptual: Mantencin dinmica del tono vascular normal, lo cual
implica la capacidad de control de la contraccin del msculo liso vascular.
Definicin Operacional: Alteracin de la capacidad de contraccin vascular,
posterior al dao inducido por EROs, seguido de una CIF.

Variables Desconcertantes
1. Estado fisiopatolgico de las ratas previo al ensayo experimental.
2. Proceso de extraccin y manipulacin de las aortas durante el desarrollo
de los ensayos experimentales.
3. Diferencias intra e intermanipulador.
4. Aplicacin correcta del protocolo experimental.

11
 MATERIALES Y MTODOS

Diseo de Investigacin
Experimental in vitro (Hernndez Sampieri, 2001).

Tipo de Estudio
Correlacional (Hernndez Sampieri, 2001).

Criterios de Inclusin/Exclusin.
Inclusin:
1. Peso de la rata de 350 g. 50 g.
2. Contraccin de anillos articos inducidas por FE, mayores a 500 mg. posterior
a la fase de estabilizacin.
Exclusin:
1. Los anillos articos que no cumplan con los criterios de inclusin.

Animales
Se utilizaron ratas machos Sprague-Dawley, de 350 g. 50 g. de peso
corporal, obtenidas del Bioterio Central de la Facultad de Medicina, Universidad de
Chile, mantenidas de acuerdo a las normas internacionales dadas por el National
Institute of Health (publicacin 85-23, revisin 1985) con agua y alimento
(Champion Nutricion Animal, Santiago, Chile) proporcionados ad libitum.

Obtencin y Preparacin de Segmentos de Aorta

Las ratas se sacrificaron sometindolas a una sobredosis del anestsico
Isofluorano (Zeneca Laboratories, Inglaterra), introducindolas en un recipiente de
acrlico y colocando dentro una matriz de algodn empapado en el anestsico. Se
esperaron 30 s y se constat que la rata no presentara signos vitales (reflejo
fotomotor, respuesta a estmulo tctil). Se les abri la cavidad torcica y se les
extrajo la arteria aorta, la cual fue sumergida en solucin Krebs-Henseleit
modificada (KHm), cuya composicin es la siguiente (mM): NaCl 122; KCl 4,7;
CaCl2 x 2 H2O 2,0; MgCl2 x 6 H2O 1,2; KH2PO4 1,2; NaHCO3 15,5; EDTA 0,021 y

12
Glucosa 11,5. La solucin se prepar en agua destilada y se ajust a un pH de
7,40 con HCl (10% v/v) NaOH (0,1 N).
El segmento de aorta se limpi del tejido conectivo y graso que lo rodea,
cuidando de no daar el endotelio. Del segmento inmediatamente inferior al arco
artico se cortaron cuatro anillos de una longitud aproximada de 2 a 3 mm. Dos
ganchos de acero inoxidable, atados cada uno a un hilo de seda de 15 cm de
longitud, fueron introducidos a travs del lumen de cada anillo artico, y stos
fueron llevados al interior de baos de vidrio de doble pared, termorregulados a
37C + 0,5C (Lauda Thermo-Temp). Cada lado del anillo artico fue fijado
mediante el hilo de sus ganchos, uno al fondo del bao y el otro a un transductor
de fuerza Grass FT-03 conectados a polgrafos Grass (modelos 7D y 5D) para la
determinacin de la contraccin isomtrica. La solucin KHm fue
permanentemente burbujeada con CO2-bioxide (95% O2 y 5%CO2, AGA Gases
Especiales, Santiago) (Apndice, Fig. 4).

Estabilizacin del Aparato Contrctil de la Aorta

Los anillos articos fueron sometidos a una tensin basal de 1,5 g. y se
estabilizaron en solucin KHm por un periodo de una hora, cambiando la solucin
cada quince minutos para evitar la acumulacin de metabolitos.
Los resultados se expresaron en unidades de fuerza (mN), para lo cual el
desplazamiento del registro poligrfico (mm) se multiplic por el factor 9,8x10-3.
Para hacer equivalente el desarrollo de tensin de los anillos de aorta de diferente
tamao, sus valores de tensin desarrollada (mN) fueron estandarizados al peso
seco (mg) de las aortas, para lo cual los segmentos articos fueron expuestos a
calor seco durante 3 das, una vez finalizado el ensayo.

Contraccin inducida por Fenilefrina (FE)

Despus del periodo de estabilizacin, los anillos articos se contrajeron
agregando 100 L de FE para lograr una concentracin final en el bao de 1M
con 10 mL de solucin KHm hasta alcanzar una contraccin mxima estable, para
luego relajar lavando el tejido con un cambio de solucin KHm. El procedimiento

13
de contraccin y relajacin se repiti de tres a cuatro veces, dejando un tiempo de
recuperacin de 20 minutos entre cada ciclo.

Generacin de Especies Reactivas del Oxgeno (EROs) Mediante Electrlisis

El procedimiento de generacin de EROs mediante electrlisis, se realiz
de acuerdo a Peters y cols. (2000). Para ello, se aplic un pulso de corriente
continua de 30 mA por 90 s, mediante una fuente de corriente constante de cuatro
canales (LSI Medical, EEUU) a travs de dos electrodos de platino de 7,5 mm de
longitud sumergidos en el bao de rganos.

Grupos Experimentales
Las ratas fueron asignadas aleatoriamente a cada uno de los grupos
experimentales y sometidas al protocolo de contraccin inducida por FE 1M
descrito anteriormente, como tambin a los procedimientos particulares indicados
para cada grupo.

Grupo 1: Control.
Estabilizacin, CIF, KHm por 50 minutos, CIF, KHm (N=5).

Grupo 2: Tratamiento 0 ng/mL (nulo).

Estabilizacin, CIF, KHm + 100 L vehculo (KHm) (15 min), Electrlisis (30 mA,
90 s), KHm (15 min), CIF, KHm (N=4).

Grupo 3: Tratamiento 250 ng/mL.

Estabilizacin, CIF, KHm + 100L EVvA (250 ng/mL, 15 min), Electrlisis (30 mA,
90 s), KHm (15 min), CIF, KHm (N=5).

Grupo 4: Tratamiento 500 ng/mL.

Estabilizacin, CIF, KHm + 100L EVvA (500 ng/mL, 15 min), Electrlisis (30 mA,
90 s), KHm (15 min), CIF, KHm (N=5).

14
Grupo 5: Tratamiento con DMSO.
Estabilizacin, CIF, KHm + 100L DMSO (100 mM, 15 min), Electrlisis (30 mA,
90 s), KHm (15 min), CIF, KHm (N=4).

Reactivos y Soluciones
El extracto seco de Vitis vinifera, variedad Cabernet Sauvignon,
estandarizado al 0.02% p/p de antocianinas referido a malvidina 3-glicsido, fue
obtenido del Laboratorio de Productos Naturales de la Facultad de Ciencias,
Universidad de Chile, mediante procedimientos estndares de extraccin de
flavanoles (Muoz, 2003). FE hidrocloruro, HCl, NaOH y todas las sales
necesarias para la preparacin de la solucin KHm fueron obtenidas del proveedor
local de Sigma-Aldrich Chemical (MO, EEUU). Las soluciones fueron preparadas
frescas el da de ensayo experimental en agua destilada. Se utiliz como vehculo
solucin KHm a 37C.
El DMSO (FLUKA, Alemania) se utiliz como estndar de capacidad de
captacin de EROs, segn lo descrito en la literatura (Peters y cols., 2000).

Anlisis Estadstico
Los resultados fueron expresados como el promedio de las
contracciones la desviacin estndar del promedio. Las diferencias entre de los
grupos experimentales, antes y despus del tratamiento, fueron determinadas con
la prueba de anlisis de varianza ANOVA seguido de la prueba a posteriori de
Bonferroni. Las diferencias dentro de los grupos experimentales, antes y despus
de la electrlisis, fueron determinadas con la prueba t de Student. La significancia
se estableci en p<0,05.

15
 RESULTADOS

Contracciones inducidas por FE pre Electrlisis

Las CIF pre electrlisis, en todos los grupos experimentales, mostraron un
comportamiento bifsico, con la fase dependiente de Ca+2 intracelular o rpida y la
fase dependiente de Ca+2 extracelular o lenta inalteradas. Los valores promedio
alcanzados fueron, grupo 1: 11,42 mN 3,77 mN; grupo 2: 9,05 mN 2,84 mN;
grupo 3: 4,99 mN 1,72 mN; grupo 4: 5,79 mN 1,81 mN y
grupo 5: 8,70 mN 2,24 mN (Apndice, Tabla 1 y Fig. 1).

Contracciones inducidas por FE post Electrlisis

Las CIF post electrlisis mostraron comportamientos distintos, segn el
tratamiento aplicado (Apndice, Tabla 1 y Fig. 1). En el grupo 1 no se vieron
alteradas las fases de la contraccin y tampoco se apreci una diferencia
estadsticamente significativa (p>0,05) de la CIF post electrlisis con respecto a la
CIF pre electrlisis, mostrando un valor promedio de 12,21 mN 3,89 mN, que
representa un 106,97% 7,30% de la CIF pre electrlisis
En los grupos de tratamiento, los grupos 2, 3 y 4, mostraron diferencias
estadsticamente significativas (grupo 2 p<0,01; grupos 3 y 4 p<0,001) de la CIF
post electrlisis con respecto a los valores de la CIF pre electrlisis, como
consecuencia de la accin de las EROs sobre el msculo liso vascular. Se
observ una alteracin del comportamiento bifsico de la contraccin, siendo la
fase lenta la que ms se comprometi al no poder mantenerse en el tiempo e
incluso descender a niveles cercanos a los basales. Tambin se observ que la
magnitud de la fuerza desarrollada por los anillos articos disminuy. El valor
promedio de las CIF post electrlisis mostrado por el grupo 2 es de
3,44 mN 0,82 mN, que representa el 38,78% 4,81% de la CIF pre electrlisis.
El valor promedio de las CIF post electrlisis mostrado por el grupo 3 es de
0,76 mN 0,39 mN, que representa un 17,90% 11,53% de la CIF pre electrlisis.
El valor promedio de las CIF post electrlisis mostrado por el grupo 4 es de
0,48 mN 0,50 mN, que representa un 8,26% 7,59%.

16
 En el grupo 5, la CIF post electrlisis no present diferencias
estadsticamente significativas (p>0,05) con respecto de la CIF pre electrlisis,
mostrando valores promedio de 8,52 mN 1,93 mN, lo que representa un
98,88% 6,26 % de la CIF pre electrlisis.

Contracciones Inducidas por Electrlisis

El grupo 2 fue el que present los mayores valores de CIE, con un
promedio de 3,87 mN 1,36 mN. Este valor ser empleado como referencia para
la comparacin con los otros grupos de tratamiento (Apndice, Tabla 2 y Fig. 2).
El grupo 3 no present una diferencia estadsticamente significativa
(p>0,05) con respecto al grupo 2. El valor promedio del grupo 3 fue de 2,09 mN
1,42 mN, lo que representa un 53,88% 36,75% de la CIE del grupo 2.
EL grupo 4 no mostr diferencia significativa (p>0,05) con respecto al grupo
2. El valor promedio del grupo 4 fue de 2,45 mN 1,32 mN, lo que representa
un 63,30% 34,21% de la CIE del grupo 2.
Al comparar los grupos 3 y 4 no se obtuvieron diferencias estadsticamente
significativas (p>0,05).
El grupo 5 mostr un valor promedio de 0,12 mN 0,15 mN, lo que
representa un 3,11% 3,89% de la CIE del grupo 2. Estos valores determinan una
diferencia estadsticamente significativa con todos los grupos de tratamiento con
EVvA (p<0,05).

17
 DISCUSIN

Los resultados esperados de los experimentos eran que el EVvA, y

especficamente las antoncianinas que ste contiene, protegiera a la musculatura
lisa vascular de los efectos deletreos de la exposicin a EROs generadas
mediante electrlisis, segn el modelo experimental empleado (Peters y cols.,
2000). Nuestra hiptesis se basaba en las abundantes referencias bibliogrficas
que mencionan la capacidad antioxidante de las antoncianinas (Wang y cols,
1997; Ghiselli y cols., 1998; Jankowski y cols., 2000; Khknen y cols, 2003;
Galvano y cols., 2004).
Segn nuestro resultados experimentales, el EVvA no mostr efecto
protector contra la alteracin de la capacidad contrctil del msculo liso vascular,
derivado de la accin deletrea de las EROs inducidas por electrlisis, en el
modelo experimental empleado (Peters y cols, 2000). El dao producido en este
modelo involucra una alteracin de los mecanismos de apertura de canales de
Ca+2 (Soto y cols., 2002; Li y cols, 2004), lo que se ve reflejado en la alteracin de
la curva de contraccin de los anillos articos, ya sea en la magnitud de la fuerza
desarrollada por los anillos o en la alteracin de una o ambas fases, rpida y/o
lenta, de la contraccin de la musculatura vascular (Anexo, Figura 3) y tambin un
fenmeno de contraccin inducida por electrlisis, mediado por derivados del
cido araquidnico (Peters y cols., 2000).
Con respecto a los grupos experimentales, ninguno de los grupos de
tratamiento con EVvA mostr efecto protector contra la accin deletrea de las
EROs generadas por electrlisis, tomando como referencia la accin deletrea
provocada por EROs en el grupo 2; la diferencia no fue estadsticamente
significativa. Los grupos 3 y 4 mostraron una diferencia significativa con el grupo 5,
que segn el modelo experimental, se utiliz como referencia de captacin de
EROs.
Segn estos resultados, el EVvA no posee efectos de proteccin contra el
estrs oxidativo provocado en el msculo liso vascular por las EROs generadas
por electrlisis, pese a que la evidencia actual indica que las antocianinas, que

18
estn contenidas en el extracto y que esperbamos seran los responsables de los
posibles efectos, si poseen actividad antioxidante. Ms an, se observa una
tendencia pro-oxidante del EVvA, reflejada en el aumento de la CIE a medida que
se aumenta la concentracin de EVvA empleada en los grupos experimentales.
Sin embargo, nuestros datos no arrojaron diferencias estadsticamente
significativas que permitan corroborar esta tendencia.
La presentacin en polvo del EVvA, sumada a la baja concentracin de
antocianinas del extracto, dificult la disolucin del EVvA para la obtencin de las
concentraciones requeridas en el bao de rganos. Debido a lo anterior, se
dificult la obtencin de concentraciones ms elevadas de antocianinas en el bao
de los anillos articos, pudiendo ser que a las concentraciones empleadas en los
grupos experimentales no fueron suficientes para que el efecto antioxidante se
expresara. Esto no implica que las concentraciones elegidas fueran inadecuadas,
ya que este ensayo fue la primera prueba que se realiz con el EVvA, y las
concentraciones de los grupos de tratamiento fueron seleccionadas tomando en
cuenta rangos de concentraciones en los cuales, segn la literatura las
antocianinas exhiben actividad antioxidante en una variedad de modelos in vitro
(Morazzoni y cols, 1991).
El desconocimiento de la composicin del EVvA proporcionado por la
Facultad de Ciencias dificulta la comparacin con extractos utilizados en otros
trabajos. El conocimiento de la composicin total de antocianinas y otros
compuestos polifenlicos presentes en el EVvA ayudaran a orientar a priori los
resultados, segn la cantidad en que estn presentes, y en base a ellos, afinar la
determinacin de las concentraciones adecuadas para alcanzar los efectos
esperados. Diversos trabajos muestran que las propiedades antioxidantes de
extractos o jugos de diferentes frutas dependen de las diferentes cantidades de
compuestos polifenlicos presentes en ellos y as tambin de las posibles
interacciones que se generen entre stos (Frankel y cols., 1995; Burns y cols.,
2000; Arnous y cols., 2001). Las antocianinas no escapan a este hecho;
pudindose sugerir que la capacidad antioxidante de una antocianina depende de
su estructura qumica (Wang y cols., 1997; Khknen y cols., 2003). La presencia

19
de una antocianina nica o una cantidad reducida, con baja capacidad
antioxidante, podra determinar la aparicin de efecto protector a concentraciones
demasiado elevadas de EVvA, que no pudieron ser alcanzadas por las razones
expuestas en el prrafo anterior.

20
 CONCLUSIONES

El EVvA no posee efecto protector contra la alteracin de la capacidad

contrctil del msculo liso vascular, derivado de la accin deletrea de las
EROs inducidas por electrlisis de aortas de rata en el modelo experimental
empleado; por lo tanto, se acepta H0.
De acuerdo a lo expresado en el punto anterior, tambin se acepta la
segunda H0 porque el efecto protector del EVvA sobre aorta de rata no es
dosis dependiente.

21
 PROYECCIONES

Muchos estudios se han realizado sobre extractos de diferentes vegetales

que poseen polifenoles, entre ellos antocianinas, esto debido a la constante
bsqueda de fitofrmacos para la prevencin y tratamiento de diferentes
patologas existentes, no siendo el estudio de la Vitis vinfera una excepcin. Es
por ello que deben realizarse ms investigaciones que respalden los efectos y que
ayuden a precisar los mecanismos de accin y las concentraciones a las cuales
los antocianinas son teraputicamente tiles. Todo ello para la produccin de
fitofrmacos provenientes de estos extractos que sean ms econmicos y con
menores efectos colaterales en comparacin de los medicamentos alopticos.

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26
 ANEXOS

Anexo 1
Estructura qumica de las Antocianinas

Azcar

La estructura qumica de la antocianinas se caracteriza por poseer dos anillos

aromticos, unidos por un puente de tres carbonos a los cuales pueden estar
unidos a uno o ms grupos hidroxilo, siendo esta la estructura bsica de todo
polifenol.
Lo que las caracteriza a las antocianinas es que poseen un oxgeno protonado; y
que presenta uno o ms grupos azcar unidos al carbono 3 del anillo C.
La capacidad antioxidante tiene directa relacin el nmero de grupos hidroxilos
unidos a los carbonos de los anillos, entre mayor numero de grupos OH mayor
capacidad antioxidante.

27
Anexo 2
Metabolismo del oxgeno

O2 + 1 O2- (radical anin

superxido)
2O2 + 2 + 2H+ O2 + H2O2 (perxido de hidrgeno)
O2 + 3 + 2H+ -OH + OH (hidroxilos)
O2 + 4 + 4H+ 2H2O (agua)
(Guyton, 2001)

28
Anexo 3
Generacin de radical hidroxlo

Reaccin de Fenton

Fe2+ + H2O2 Fe3++ -OH + OH

Reaccin de Haber-Weiss

Fe2+ Fe3+
O2- + H2O2 -OH + OH + O2

(Guyton, 2001)

29
Anexo 4
Generacin de radical superxido
Fe2+ + O2 Fe3+ + O2.-
Cu+ + O2 Cu2+ + O2.-

(Guyton, 2001)

30
Anexo 5
Mecanismo de estabilizacin de EROs de los flavonoides

ERO

Radical
Flavonoide Aroxilo

(Pietta, 2000)

31
Anexo 6
Esquema del montaje del bao de rganos

Los segmentos de aorta se montaron en baos de vidrio de doble pared,

sumergidos en solucin KHm, termorregulados a 37 + 0.5 C. El extremo inferior
se fijo al fondo del bao y el extremo superior a un transductor de fuerza (T.F.)
Grass FT-03 conectados a polgrafos Grass (modelos 7D y 5D). La solucin KHm
fue permanentemente burbujeada con CO2-bioxide (95% O2 ; 5% CO2).

32
 APNDICE

Tabla 1.
Tensin desarrollada por los anillos articos de rata, producida por
Fenilefrina, pre y post a la generacin de EROs inducida por electrlisis.

Contraccin Pre Electrlisis Contraccin Post Electrlisis

Grupo Tensin Tensin Tensin Tensin
Experimental Absoluta (mN) Relativa (%) Absoluta (mN) Relativa (%)

Grupo 1 (n=5) 11,43 3,76 100 12,20 3,88 106,97 7,30

Grupo 2 (n=4) 9,06 2,84 100 3,44 0,81* 38,78 4,81

Grupo 3 (n=5) 4,99 1,72 100 0,76 0,39** 17,90 11,53

Grupo 4 (n=5) 5,79 1,80 100 0,48 0,49** 8,26 7,59

Grupo 5 (n=4) 8,70 2,23 100 8,52 1,93 98,88 6,26

* = p<0,01
** = p< 0,001

33
 Contraccin pre electrlisis
Contraccin post electrlisis

Figura 1. Tensiones absolutas de las contracciones pre y post electrlisis

inducidas por FE 1M, en anillos articos de rata. Grupo 1: control (n=5), grupo 2:
tratamiento con 0 ng/mL de EVvA (n=4), grupo 3: tratamiento con 250 ng/mL de
EVvA (n=5), grupo 4: tratamiento con 500 ng/mL de EVvA (n=5), grupo 5:
tratamiento con DMSO 100 mM (n=4). Los valores representan el promedio su
desviacin estndar.
* = Diferencia significativa de la contraccin pre electrlisis con respecto a la
contraccin post electrlisis (p<0,01).
** = Diferencia significativa de la contraccin pre electrlisis con respecto a la
contraccin post electrlisis (p<0,001).
*** = Diferencia significativa de la contraccin pre electrlisis con respecto a la
contraccin post electrlisis (p<0,001).

34
Tabla 2.

Tensin absoluta desarrollada por los anillos articos de rata, inducida

porelectrlisis.

Contraccin Inducida por Electrlisis

Grupo Tensin
Experimental Absoluta (mN)
Grupo 1 (n=5) 0
Grupo 2 (n=4) 3,87 1,36
Grupo 3 (n=5) 2,09 1,42
Grupo 4 (n=5) 2,45 1,32
Grupo 5 (n=4) 0,12 0,15*

* = p<0,05

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Figura 2. Tensiones absolutas de las contracciones inducidas por electrlisis, en
anillos articos de rata de los grupos experimentales. Grupo 1: control (n=4) no
graficado por presentar valor = 0 mN, grupo 2: tratamiento con 0 ng/mL de EVvA
(n=4), grupo 3: tratamiento con 250 ng/mL de EVvA (n=5), grupo 4: tratamiento
con 500 ng/mL de EVvA (n=5), grupo 5: tratamiento con DMSO 100 mM (n=5). Los
valores representan el promedio su desviacin estndar.
* = Diferencia significativa de la contraccin inducida por electrlisis con respecto
al grupo 2 (p<0,05).

36
 CIF pre Electrlisis CIE CIF post Electrlisis

6
2
5
1 * 4

FE Lavado Incubacin Electrlisis FE

Figura 3. Curso temporal de un registro poligrfico de anillos articos de rata.

1 = Contraccin inducida por -adrenrgico generando un ascenso rpido (fase rpida o transiente), dependiente de
Ca+2 intracelular por apertura de canales de Ca+2 del retculo sarcoplsmico; 2 = mantencin de la contraccin o fase de
meseta, dependiente de Ca+2 extracelular; 3 = retiro del estmulo -adrenrgico por lavado con KHm, provocando la
relajacin del msculo liso vascular, 4 = Perodo de incubacin con el EVvA por 15 minutos; 5 = contraccin inducida por
electrlisis, por accin del las EROs sobre el cido araquidnico; 6 = contraccin inducida por -adrenrgico post
electrlisis. Se observa la fase rpida, a diferencia de la fase de meseta que no se logra mantener. Slo se mantiene una
contraccin que alcanza el 50% de la fase rpida.
* = corte del registro para mostrar los hechos relevantes para comprensin del protocolo.

Las contracciones fueron inducidas por fenilefrina 1 M, antes y despus de electrolisis (90 s., 30 mA).
FE = fenilefrina; Lavado = lavado con solucin KHm.

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