Ayusa Estructura Protica

NDICE MEMORIA
ndice memoria ..........................................................................................1

Resumen ...................................................................................................5
Resum.......................................................................................................7
Abstract ....................................................................................................9
Agradecimientos ....................................................................................... 11
Captulo 1: Protenas Globulares ........................................................ 13
1.1. Interpretacin de las estructuras de las protenas por rayos-X .......... 13
1.1.1. Estructuras cristalinas............................................................ 14
1.1.2. Conservacin de sus conformaciones nativas ............................ 15
1.1.3. Percepcin ms eficaz en forma simplificada ............................. 15
1.2. Determinacin de la estructura proteica mediante resonancia
magntica nuclear bidimensional (2D-NMR)............................................. 16
1.3. Estructura Terciaria..................................................................... 16
1.3.1. Hlices y hojas ................................................................. 16
1.3.2. Variacin de la polaridad en las cadenas laterales...................... 17
1.3.3. Ordenacin por eficacia .......................................................... 17
1.3.4. Dominios en los polipptidos................................................... 18
1.3.5. Estructuras supersecundarias ................................................. 19
1.3.6. Patrones de plegamiento de protenas...................................... 20
Captulo 2: Estabilidad de las Protenas.............................................. 21
2.1. Fuerzas electrostticas ................................................................ 21
2.1.1. Interacciones inicas ............................................................. 22
2.1.2. Interacciones dipolo-dipolo ..................................................... 22
2.2. Fuerzas por enlace de hidrgeno................................................... 23
2.3. Fuerzas hidrofbicas.................................................................... 24
2.4. Desnaturalizacin de las protenas ................................................ 27
Captulo 3: Caracterizacin y Purificacin de Protenas ...................... 29
3.1. Extraccin y purificacin .............................................................. 30
3.2. Caracterizacin........................................................................... 32
Captulo 4: Aminocidos ..................................................................... 33
4.1. Aminocidos estndar ................................................................. 33
4.1.1. Propiedades generales ........................................................... 34
-1-
Cristina Ayuso Aixa
4.1.2. Enlaces de los pptidos .......................................................... 35

4.1.3. Clasificacin y caractersticas .................................................. 36
4.1.4. Propiedades cido-base.......................................................... 38
4.1.5. La nomenclatura ................................................................... 41
4.2. Actividad ptica .......................................................................... 44
4.2.1. Clasificacin ......................................................................... 44
4.2.2. Convencin de Fisher............................................................. 45
4.2.3. Sistema Cahn-Ingold-Prelog ................................................... 47
4.2.4. Quiralidad y bioqumica.......................................................... 48
4.3. Aminocidos no estndar ............................................................. 49
4.3.1. Derivados aminocidos en las protenas ................................... 49
4.3.2. Papeles especializados de los aminocidos................................ 50
Captulo 5: Protenas y Aminocidos Experimentales ......................... 51
5.1. Albmina de suero bovino, BSA .................................................... 51
5.1.1. Caractersticas ...................................................................... 52
5.1.2. Funciones de la albmina ....................................................... 52
5.1.3. Causas de la deficiencia de la albmina.................................... 52
5.1.4. Tipos de albmina ................................................................. 53
5.2. Desoxiribonucleasa, DNAsa .......................................................... 53
5.2.1. Tipos de Desoxiribonucleasas.................................................. 54
5.2.2. Determinacin de desoxiribonucleasas ..................................... 54
5.3. Aminocidos aromticos .............................................................. 55
5.3.1. Fenilalanina .......................................................................... 55
5.3.2. Triptfano ............................................................................ 56
5.3.3. Tirosina................................................................................ 57
Captulo 6: Tcnicas Utilizadas ........................................................... 59
6.1. Espectrofotometra...................................................................... 59
6.1.1. El espectro electromagntico .................................................. 59
6.1.2. La radiacin electromagntica y su interaccin con la materia .... 61
6.1.3. Absorcin y emisin de radiacin por parte de la materia. .......... 62
6.1.4. Ley de Bouguer - Lambert - Beer ............................................ 62
6.1.5. Aplicacin de espectrofotometra ............................................. 66
6.1.6. Espectrofotmetro................................................................. 67
6.1.7. Partes del espectrofotmetro .................................................. 68
6.1.8. Aplicaciones de la espectrofotometra visible y ultravioleta ......... 69
6.2. La derivada ................................................................................ 70
-2-
Estudio y funcin de protenas receptoras de membrana: espectroscopia ultravioleta derivada
6.2.1. Definicin de derivada como un lmite ...................................... 73

6.2.2. Segunda derivada ................................................................. 74
6.2.3. Espectroscopia derivada en los espectros de absorcin: ............. 75
6.2.4. Segunda derivada de espectroscopia ....................................... 77
6.2.5. Cuarta derivada de espectroscopia .......................................... 78
Captulo 7: Software e Instrumentacin ............................................. 79
7.1. RasMol ...................................................................................... 79
7.2. Vision Pro .................................................................................. 82
7.3. Thermo Scientific Evolution 300.................................................... 83
7.4. Autoclave................................................................................... 84
Captulo 8: Mtodo Experimental........................................................ 87
8.1. Reactivos ................................................................................... 87
8.2. Instrumentacin ......................................................................... 87
8.3. Procedimiento experimental ......................................................... 88
8.3.1. Procedimiento....................................................................... 89
Captulo 9: Resultados Experimentales............................................... 91
9.1. Protena BSA (Albumin Serum Bovine)........................................... 91
9.1.1. Desnaturalizacin trmica ...................................................... 91
9.1.2. Desnaturalizacin cido- Base ................................................ 94
9.2. Protena DNAsa (Deoxyribonuclease I Pancreas Bovine)................... 96
9.2.1. Desnaturalizacin Trmica ...................................................... 96
9.2.2. Desnaturalizacin cido Base ............................................... 98
9.3. Comparacin de la evolucin graficada con la estructura primaria de las
protenas. ......................................................................................... 100
9.3.1. Estructura primaria de BSA. ................................................. 100
9.3.2. Esctructura primaria de DNAsa.............................................. 102
Captulo 10: Conclusiones................................................................. 107
Captulo 11: Evaluacin Econmica .................................................. 109
11.1. Costes de material y energa ................................................... 109
11.2. Costes de personal ................................................................. 110
11.3. Costes amortizaciones ............................................................ 111
Captulo 12: Bibliografa ................................................................... 113
12.1. Referencias bibliogrficas ........................................................ 113
12.2. Bibliografa de Consulta .......................................................... 114
-3-
RESUMEN
La presente memoria forma parte de un proyecto ms grande que se realiza en
el Departamento de Biotecnologa de la Escuela Superior de Agricultura de
Barcelona (ESAB) de la Universidad Politcnica de Catalua.
En el citado proyecto se propone el estudio de dos sistemas de membrana: el
receptor de Neuroquinina NK1 de mamferos, y la permeasa de melibiosa de
E.coli. Dado que esas sustancias pueden contener aminocidos aromticos, se
expone una puesta en marcha, donde el mtodo, describe un enfoque
alternativo para el estudio de la estructura de la protena utilizando la deteccin
de radiacin ultravioleta (UV), donde los cambios de la absorbancia mxima de
los aminocidos aromticos y cadenas laterales son inducidos por la
desnaturalizacin trmica o cido-base.
El mtodo se basa en la hiptesis de que a medida que se desnaturalice la
protena irn sobresaliendo al exterior otros grupos de aminocidos aromticos
que en un principio no eran detectables.
Se ha investigado el potencial de la segunda derivada de los espectros de los
rayos UV, en funcin de la temperatura y de cambios de pH en dos protenas de
diferentes propiedades fsicas y qumicas para representar cadenas laterales
totalmente expuestas. Se demuestra que los pequeos cambios en la longitud de
onda mxima de la regin espectral de Phe, Tyr y Trp en la presencia de la
especificada desnaturalizacin puede ser medido con fiabilidad, y que la
magnitud y la direccin del rastreo de picos se ven influidos por varios factores,
como el tamao de la protena, carga, el medio o ambiente y la accesibilidad de
los grupos aromticos de los disolventes.
La evaluacin de los datos empricos UV espectral a la luz de la informacin
conocida de la protena estructural, muestra que el cambio aplicado a las
interacciones en protenas, revela la informacin de cuando se produce dicha
influencia en la estructura de la cadena y en el comportamiento de los
aminocidos aromticos.
-5-
RESUM
La present memria parteix d'un projecte ms gran que es realitza en el
Departament de Biotecnologia de l'Escola Superior d'Agricultura de Barcelona
(ESAB) de la Universitat Politcnica de Catalunya.
En el citat projecte es proposa l'estudi de dos sistemes de membrana: el receptor
de Neuroquinina NK1 de mamfers, i la permeasa de melibiosa d'E.coli. Ats que
aquestes substncies poden contenir aminocids aromtics, s'exposa una
engegada, on el mtode, descriu un enfocament alternatiu per a l'estudi de
l'estructura de la protena utilitzant la detecci de radiaci ultraviolada (UV), on
els canvis de l'absorbncia mxima dels aminocids aromtics i cadenes laterals
sn induts per la desnaturalizacin trmica o cid-base.
El mtode es basa en la hiptesis de que a mida que es desnaturalitzi la protena
aniran sobresortint a lexterior altres grups daminocids aromtics que en un
principi no eren observables.
Se ha investigat el potencial de la segona derivada dels espectres dels raigs UV,
en funci de la temperatura i de canvis de pH en dos protenes de diferents
propietats fsiques i qumiques per a representar cadenes laterals totalment
exposades. Es demostra que els petits canvis en la longitud dona mxima de la
regi espectral de Phe, Tyr y Trp en la presencia de la especificada
desnaturalitzaci pot ser mesurat amb fiabilitat, i que la magnitud i la direcci
del rastreig de pics es veuen influts per diferents factors, com la dimensi de la
protena, carga, el medi o ambient i la accessibilitat dels grups aromtics dels
dissolvents.
Lavaluaci de les dades empriques UV espectral a la llum de la informaci
coneguda de la protena estructural, mostra que el canvi aplicat a les
interaccions en protenes, revela la informaci de quan es produeix dita
influencia en la estructura de la cadena i en el comportament dels aminocids
aromtics.
-7-
ABSTRACT
The present report forms a part of a project bigger that is realized in
Biotecnologa's Department of the High school of Agriculture of Barcelona (ESAB)
of the Technical University of Catalonia.
This research project proposes the study of two membrane systems: the
mammalian neurokinin NK1 receptor, and the melibiose permease from E.coli.
Provided that these substances can contain aromatic amino acids, a putting is
exposed in march, where the method, it describes an alternative approach to the
study of protein structure using derivate absorbance in the ultraviolate region
where changes in the maximum absorbance of aromatic amino acids and side
chains are induced by thermal or acid-basic denaturalization.
It has been investigated the potential of the second derivative of UV spectra,
depending on temperature and pH changes in two proteins (Bovine Serum
Albumin and Desoxyribonuclease I).
We show that small changes in the wavelength maximum of the spectral region
of Phe, Tyr and Trp in the presence of the specified distortion can be measured
reliably, and that these changes are influenced by several factors as for example
the protein size, protein charge, or the environment and accessibility to different
solvents.
-9-
AGRADECIMIENTOS
En primer lugar quisiera expresar mi profundo agradecimiento al Dr. Francesc
Sepulcre y al Prof. Antonio Gmez, por brindarme la oportunidad de participar
en este proyecto, realizado en el Departamento de Biotecnologa de la Escuela
Superior de Agricultura de Barcelona (ESAB) de la Universidad Politcnica de
Catalua.
En segundo lugar, dar las gracias a las personas que ocupan la consergera en la
Escuela Superior de Agricultura, por su esfuerzo en memorizar nuestra
presencia, facilitando y recordando las llaves de los laboratorios de los cuales
hacimos uso, aunque nuestra estancia fuera tan slo de unos meses.
Muy especialmente, agradezco a Sheila Bentez su dedicacin ya que sus
consejos e indicaciones han servido para resolver muchas dudas surgidas en el
desarrollo del mismo.
A mi compaero Sergi Muoz agradecerle todas las horas compartidas dentro y
fuera del laboratorio, los momentos y la experiencia adquirida, ha sido ms que
un placer trabajar conjuntamente.
Agradecer tambin a todos mis profesores, desde el colegio hasta la universidad,
que han hecho posible alcanzar el nivel de conocimientos tcnicos necesarios
para realizar este proyecto.
Y por supuesto a todos mis compaeros y amigos dentro y fuera de la
universidad, su apoyo es de un valor incalculable.
Muchas gracias a todos.
- 11 -
CAPTULO 1:
PROTENAS GLOBULARES
Las protenas globulares comprenden un grupo de sustancias muy diferentes

que, en su estado nativo, aparecen como molculas esferoidales compactas. Los
enzimas son protenas globulares, lo mismo que las protenas de transporte y los
receptores. En esta seccin se considerarn las estructuras terciarias de las
protenas globulares. Sin embargo, la mayor parte del conocimiento estructural
detallado de las protenas, y por ello una gran extensin de su funcin, proviene
de la determinacin de la estructura cristalina por rayos-X.
1.1. Interpretacin de las estructuras de las

protenas por rayos-X
La cristalografa de rayos-X es una tcnica que da directamente imgenes de las
molculas. Deben emplearse rayos-X para conseguirlo porque, de acuerdo con
los principios de la ptica, la incertidumbre en la localizacin de un objeto es
aproximadamente igual a la longitud de onda de la radiacin empleada para
observarlo (las longitudes de onda de los rayos-X y las distancias del enlace
covalente son ambas de ~ 1,5 ; las molculas individuales no pueden
percibirse en un microscopio de luz porque la luz visible tiene una longitud de
onda mnima de 4000 ). No existe, sin embargo, ningn artificio como un
microscopio de rayos-X, porque no existen lentes para rayos- X. En vez de ello,
para percibirla, se expone un cristal de la molcula que se trata de visualizar a
un haz paralelo de rayos-X monocromtico y se registra la imagen de difraccin
consiguiente sobre una pelcula fotogrfica o por un contador de radiacin.
Seguidamente se expondrn algunos de los problemas especiales asociados con
la interpretacin de las estructuras de las protenas por cristalografa de rayos-
X.
La accin de los rayos-X se ejerce, casi exclusivamente, sobre los electrones, no
sobre el ncleo. Una estructura de rayos-X es, por tanto, una imagen de la
densidad electrnica del objeto en estudio. Estos mapas de densidad electrnica
- 13 -
Cristina Ayuso Aixa
pueden presentarse como una serie de secciones paralelas a travs del objeto.
En cada seccin, la densidad electrnica est representada por los contornos del
mismo modo que se representa la altitud en un mapa topogrfico. Al apilar estas
secciones, trazadas sobre transparencias, se obtiene un mapa de densidad
electrnica tridimensional. Sin embargo, el anlisis estructural moderno se lleva
a cabo con ayuda de computadores grficos, en los cuales los mapas de densidad
electrnica muestran el contorno en las tres dimensiones.
1.1.1. Estructuras cristalinas

Las molculas en los cristales de las protenas, al igual que en otras sustancias
cristalinas, se hallan dispuestas en redes tridimensionales que se repiten con
regularidad. Los cristales de protena se diferencian, sin embargo, de los de las
molculas orgnicas e inorgnicas ms pequeas en que se hallan muy
hidratados; contienen, tpicamente, del 40 al 60 % de agua en volumen. El
disolvente acuoso de cristalizacin es necesario para la integridad estructural de
los cristales de protena. Ello es debido a que se necesita el agua para la pureza
estructural de las propias protenas nativas.
El elevado contenido de disolvente de los cristales de protena les confiere una
consistencia blanda, como de gelatina, de modo que sus molculas carecen de la
ordenacin rgida caracterstica de los cristales de molculas pequeas como las
de NaCl o de glicina. Las molculas situadas en un cristal de protena se
encuentran desordenadas de un modo tpico, que asciende a unos pocos
angstroms, de tal forma que el mapa de densidad electrnica correspondiente
carece de informacin respecto a los detalles estructurales de menor tamao. Se
dice, por tanto, que el cristal posee un lmite de resolucin del referido tamao.
Los cristales de protena muestran limites de resolucin comprendidos entre 2 a
3,5 , aunque pocos se hallan ms ordenados (poseen un poder de resolucin
mayor) y muchos se hallan ms desordenados (tienen una resolucin menor).
De la misma manera que un mapa de densidad electrnica de una protena debe
interpretarse refirindolo a sus posiciones atmicas, la exactitud y la factibilidad
del anlisis de la estructura del cristal dependen del lmite de resolucin del
cristal.
La mayor parte de las estructuras de los cristales de protena estn escasamente
definidas para que sus densidades electrnicas sean capaces de revelar con
claridad, las posiciones de cada uno de los tomos individuales. No obstante, la
forma caracterstica del esqueleto del polipptido permite, habitualmente, que
puedan trazarse, lo cual a su vez permite deducir las posiciones y las
orientaciones de sus cadenas laterales. Pero las cadenas laterales de forma y de
tamao comparables como son las de Leu, Ile, Thr y Val, no pueden diferenciarse
con un grado razonable de confianza (los tomos de hidrgeno, que slo poseen
un electrn, no son visibles en las estructuras de las protenas por rayos-X), de
modo que una estructura de una protena no puede dilucidarse solamente de su
mapa de densidad electrnica. Debe conocerse la estructura primaria de la
protena, lo que permite adaptar la secuencia de los restos aminocidos, por
observacin visual, al mapa de densidad electrnica.
Los refinamientos matemticos pueden reducir entonces los errores de las
posiciones atmicas en la estructura del cristal a unos 0,1 (en comparacin, los
- 14 -
errores en las determinaciones de la estructura por rayos-X en las molculas

pequeas pueden ser tan pequeos como 0,001 ).
1.1.2. Conservacin de sus conformaciones nativas

Cul es la relacin existente entre la estructura de una protena en un cristal y
la que exhibe en disolucin que es donde funcionan normalmente la mayor parte
de las protenas?
Varias lneas de evidencia indican que las protenas cristalizadas adoptan con
mucha proximidad las mismas estructuras que tienen en disolucin:
1. La molcula de una protena en un cristal se halla esencialmente en disolucin

debido a que est baada por el disolvente de cristalizacin en toda su
superficie con excepcin de unas pocas zonas, generalmente pequeas, en las
que establece contacto con molculas de protena vecinas.
2. Una protena puede cristalizar en una o varias formas o "hbitos",

dependiendo de las condiciones de cristalizacin, que se diferencian en cmo
se hallan dispuestas las molculas de protena en el espacio que las relaciona
entre s. En varios casos, cuando se han analizado independientemente las
diferentes formas de cristalizar de la misma protena, las molculas han
mostrado, virtualmente, las mismas conformaciones. Es evidente que las
fuerzas de empaquetamiento en el cristal no afectan mucho a la estructura de
las molculas de la protena.
3. La evidencia ms fuerte de que las protenas cristalizadas poseen estructuras

relevantes bio1gicamente es, sin embargo, la observacin de que muchos
enzimas son catalticamente activos en el estado cristalino. La actividad
cataltica de un enzima es muy sensible a las orientaciones relativas de los
grupos que intervienen en el enlace y en la catlisis. Los enzimas cristalizados
activos deben poseer, por tanto, conformaciones que se parezcan
estrechamente a las que exhiben en disolucin.
1.1.3. Percepcin ms eficaz en forma simplificada

Los varios centenares de tomos diferentes del hidrgeno de una protena,
aunque sea pequea, convierten la comprensin de la estructura detallada de
una protena en un esfuerzo considerable. El mtodo ms instructivo para
estudiar la estructura de una protena es el examen directo del modelo del
esqueleto (bolas y varillas).
Desgraciadamente este tipo de modelos es raramente asequible y las fotografas
de ellos son demasiado confusas para que resulten tiles. Una alternativa
prctica es el diagrama espacial obtenido por computador en el que el esqueleto
del polipptido se halle representado solamente por sus tomos de C y se
incluyan unas pocas cadenas laterales clave nicamente. Otra posibilidad es una
versin artstica de un modelo de protena que se ha simplificado y distorsionado
ligeramente con objeto de mejorar su claridad visual. Puede obtenerse un nivel
ulterior de abstraccin representando la protena en un dibujo que ponga de
manifiesto su estructura secundaria.
- 15 -
Cristina Ayuso Aixa
1.2. Determinacin de la estructura proteica

mediante resonancia magntica nuclear
bidimensional (2D-NMR)
La determinacin de las estructuras tridimensionales de protenas globulares
pequeas en solucin acuosa ha sido posible gracias al desarrollo, durante la
pasada dcada, de la espectroscopia de NMR bidimensional (2D) (y ms
recientemente de tcnicas 3D y 4D). Estos anlisis mediante NMR, proporcionan
las distancias intraatmicas entre protones especficos que estn separados por
una distancia < 5 en la protena nativa. Estas distancias, junto con
restricciones geomtricas conocidas, como distancias y ngulos de los enlaces
covalentes, planaridad de los grupos, quiralidad y radios de Van der Waals, se
usan para calcular la estructura tridimensional de la protena.
Actualmente, esta tcnica de rpido desarrollo posee una precisin que, en el
mejor de los casos, es ms o menos comparable a la de una estructura cristalina
de rayos-X con una resolucin de 2 a 2,5 . Por ahora, est limitada a protenas
de menos de unos 200 restos de aminocidos. En la mayor parte de los casos en
que se conocen tanto la estructura cristalina de rayos-X como la de NMR para
una protena determinada, las dos estructuras son compatibles. Los mtodos de
NMR, adems proporcionan un medio de verificacin mutua con las tcnicas de
rayos-X, pueden determinar las estructuras de protenas y otras macromolculas
difciles de cristalizar. Adems, dado que la NMR puede registrar movimientos
durante escalas temporales que abarcan diez rdenes de magnitud, puede ser
usada para el estudio del plegamiento y dinmica de las protenas.
1.3. Estructura Terciaria

La estructura terciaria de una protena es su disposicin espacial; es decir, el
plegamiento de los elementos estructurales secundarios, junto con las
disposiciones espaciales de sus cadenas laterales. La mioglobina de la esperma
de ballena fue la primera estructura de una protena por rayos-X que se puso de
manifiesto al final de los aos 50. Su cadena polipeptdica efecta un recorrido
tortuoso, como el de un gusano, por el que estos investigadores se vieron
sorprendidos e indicaron su desacuerdo con esta falta de regularidad estructural.
En los aos siguientes se describieron casi 200 estructuras de protenas. Cada
una de ellas es singular y representa una entidad muy complicada. No obstante,
sus estructuras terciarias muestran diversos rasgos sobresalientes comunes,
como se ver ms adelante.
1.3.1. Hlices y hojas

Los tipos principales de elementos estructurales secundarios, las hlices y las
hojas plegadas, aparecen corrientemente en las protenas, pero en
proporciones y combinaciones variables. Algunas protenas, tal como la
mioglobina, estn constituidas solamente por hlices , separadas por enlaces
cortos que las conectan,que poseen una conformacin arrollada. Otras, como
ocurre con la concanavalina A, poseen una proporcin grande de hojas pero
- 16 -
carecen de hlices . Sin embargo, la mayor parte de las protenas poseen

cantidades significativas de ambos tipos de estructura secundaria (por trmino
medio, ~ 27 % de hlice y 23 % de hoja ).
1.3.2. Variacin de la polaridad en las cadenas laterales

Las estructuras primarias de las protenas globulares carecen, en general, de
secuencias que se repiten o seudorrepetitivas, que son las responsables de las
conformaciones regulares de las protenas fibrosas.
Las cadenas laterales de los aminocidos en las protenas globulares se hallan,
no obstante, distribuidas espacialmente de acuerdo con sus polaridades:
1. Los restos no polares Val, Leu, Ile, Met y Phe aparecen, casi siempre, en el
interior de una protena, fuera del contacto con el disolvente acuoso.
2. Los residuos polares con carga Arg, His, Lys, Asp y Glu se hallan situados,
casi invariablemente, en la superficie de una protena, en contacto con el
disolvente acuoso. Ello es debido a que la inmersin de un ion en el interior,
virtualmente anhidro, de una protena da por resultado la prdida, no
compensada, de gran parte de su energa de hidratacin. Son raros los casos
en que estos grupos aparecen en el interior de una protena y habitualmente
desempean una funcin qumica especfica como la de promover la catlisis
o la de participar en la unin con un in metlico.
3. Los grupos polares sin carga Ser, Thr, Asn, Gln, Tyr y Trp aparecen
habitualmente sobre la superficie de la protena pero, con frecuencia,
aparecen en el interior de la molcula. En este ltimo caso, estos restos se
hallan casi siempre unidos hidrofbicamente a otros grupos de la protena. En
realidad, virtualmente todos ocultos, comportndose como dadores en
enlaces de hidrgeno que forman con grupos aceptores, que tambin se
hallan ocultos; en cierto sentido la formacin de un enlace de hidrogeno
"neutraliza" la polaridad de un grupo capaz de establecerlo.
1.3.3. Ordenacin por eficacia

Las protenas globulares son muy compactas, hay poco espacio en su interior, de
modo que el agua se halla ampliamente excluida de dicho espacio. La ordenacin
micelar de sus cadenas laterales (los grupos polares al exterior y los grupos no
polares al interior) ha conducido a describirlas como gotas de aceite con una
cubierta polar". Esta generalizacin, aunque es pintoresca, carece de precisin.
La densidad de empaquetamiento (que es la relacin del volumen definido por
las envolventes de Van der Waals de los tomos de una regin y el volumen total
de la regin) de las regiones internas de las protenas globulares es de ~ 075,
que es del mismo orden que el de los cristales moleculares de las molculas
orgnicas pequeas. En comparacin, las esferas empaquetadas en contacto, de
igual tamao, poseen una densidad de empaquetamiento de 074, mientras que
los lquidos orgnicos (gotas de aceite) muestran una densidad de
empaquetamiento que, en la mayor parte de los casos, se halla entre 060 y
- 17 -
Cristina Ayuso Aixa
070. El interior de una protena es, por tanto, ms semejante a un cristal

molecular que a una gota de aceite; es decir, se halla empaquetado eficazmente.
1.3.4. Dominios en los polipptidos

Las cadenas de polipptidos que estn constituidas por ms de ~200 restos
suelen plegarse formando dos o ms agrupaciones globulares, conocidos como
dominios, que confieren a estas protenas una apariencia bi- o multiglobular. La
mayor parte de los dominios estn constituidos por 100 a 200 restos
aminocidos y poseen por trmino medio un dimetro de ~ 25 . Cada
subunidad de la deshidrogenasa del 3-fosfato del gliceraldehido, por ejemplo,
tiene dos dominios diferentes. 1
Figura 1. Una subunidad del enzima deshidrogenasa del 3 fosfato de

gliceraldehido, procedente de Bacillus stearothermophilus.
Una cadena polipeptdica oscila hacia atrs y hacia adelante en el interior de un

dominio, pero los dominios vecinos se hallan conectados, habitualmente, por uno
o, menos frecuentemente, por dos segmentos polipeptdicos.
Los dominios son, por tanto, unidades independientes, desde el punto de vista
estructural, cada una de las cuales posee las caractersticas de una protena
1 Referencia Figura 1: Fonaments de Bioqumica. Juli Perit/Ramon Sendra.
- 18 -
globular pequea. En realidad, la protelisis limitada de una protena con varios

dominios libera, con frecuencia, sus dominios sin alterar mucho sus estructuras.
No obstante, la estructura en dominios de una protena no es siempre evidente
ya que sus dominios pueden establecer contactos tan extensos entre s que la
protena aparece como una entidad globular simple.
Los dominios desempean frecuentemente una funcin especfica, tal como la
unin con una molcula pequea. Los sitios de enlace de molculas pequeas en
las protenas con varios dominios aparecen, con frecuencia, en las hendiduras
situadas entre los dominios; es decir, que las molculas pequeas se hallan
unidas a grupos de los dominios. Esta disposicin surge, en parte, de la
necesidad de una interaccin flexible entre la protena y la molcula pequea,
que proporciona la conexin covalente relativamente plegable entre los dominios.
1.3.5. Estructuras supersecundarias

En muchas protenas globulares, que no se hallan relacionadas, aparecen algunas
agrupaciones de elementos estructurales llamadas estructuras supersecundarias.
1. La forma ms corriente de estructura supersecundaria es la unidad , en la

que la conexin transversal entre dos hebras paralelas de hoja est
constituida por una hlice , con arrollamiento normalmente hacia la derecha.
2. Otra estructura supersecundaria corriente, el meandro , est constituida por

una hoja anti paralela formada por segmentos secuenciales de cadena de
polipptido que estn conectados por vueltas que cambian el sentido y son
relativamente cerradas.
3. En una unidad , dos hlices antiparalelas se empaquetan una contra otra,

con sus ejes inclinados de modo que permita una interpenetracin favorable
energticamente de sus cadenas laterales en contacto.
4. Las hojas extendidas se arrollan frecuentemente para formar barriles . Se

han designado tres topologas (modos de ordenacin de las hebras y de sus
interconexiones) de barriles diferentes, en analoga con los motivos
geomtricos que se encuentran en los tejidos y en la cermica de los nativos
americanos y de los griegos.
Las estructuras supersecundarias pueden tener significado funcional y

estructural. Una unidad , por ejemplo, en la que las hebras formen una
hoja paralela, con conexiones transversales mediante una hlice con giro hacia
la derecha (una unidad doble ) forma el sitio de unin del nucletido en
muchos enzimas que se unen con estas molculas, segn pudo demostrar
Michael Rossmann2.
2 Protein Structure and Function. Gregory A Petsko, Dagmar Ringe.
- 19 -
Cristina Ayuso Aixa
Figura 2. Representacin ideal del dominio al que se une el coenzima

de varias deshidrogenasas.3
1.3.6. Patrones de plegamiento de protenas

Actualmente, se conocen alrededor de 400 estructuras de protenas de alta
resolucin y este nmero crece rpidamente. Las comparaciones estructurales
entre estas protenas revelan que sus elementos de estructura secundaria estn
organizados en un nmero asombrosamente pequeo de patrones geomtricos
bsicos para la formacin de estructuras terciarias.
Los anlisis de estos patrones sugieren que las estructuras terciarias pueden ser
racionalizadas, en gran parte, en trminos de unas pocas restricciones
estructurales bastante simples, tales como la rigidez del esqueleto polipeptdico,
la tendencia de los elementos de estructura secundaria adyacentes en la
secuencia a plegarse conjuntamente de manera antiparalela y la necesidad de
empaquetar eficientemente las superficies en contacto de los elementos de
estructura secundaria adyacentes en el espacio. Sin embargo, todava no se
puede predecir correctamente el patrn de plegamiento de un polipptido
determinado.
3 Referencia Figura 2: Fonaments de Bioqumica. Juli Perit/Ramon Sendra.
- 20 -
CAPTULO 2:
ESTABILIDAD DE LAS
PROTENAS
Aunque pueda parecer increble, las medidas termodinmicas indican que las
protenas nativas slo son entidades marginalmente estables en las condiciones
fisiolgicas.
La energa libre que se necesita para desnaturalizarlas es de ~ 04 kJ/mol de
restos aminocidos, de modo que las protenas constituidas por 100 restos son
tpicamente estables solamente por alrededor de 40 kJ/mol. Contrasta con este
valor la energa necesaria para romper un enlace de hidrgeno tpico que es de ~
20 kJ mol-1. Las diversas influencias no covalentes a las que se hallan
sometidas las protenas -interacciones electrostticas (tanto atracciones como
repulsiones), enlaces de hidrgeno (los intramoleculares y con el agua) y las
fuerzas hidrofbicas- poseen cada una magnitudes de energa que pueden
alcanzar hasta millares de kilojoules por mol en el conjunto de una molcula de
protena. Por consiguiente, la estructura de una protena es el resultado de un
equilibrio delicado entre fuerzas contrapuestas potentes.
2.1. Fuerzas electrostticas

Las molculas son conjuntos de partculas con carga elctrica y de aqu que, con
un grado razonable de aproximacin, sus interacciones puedan determinarse por
las leyes de la electrosttica clsica (clculos ms exactos precisan de la
aplicacin de la mecnica cuntica).
La energa de asociacin, U, de dos cargas elctricas, q1 y q2 que estn
separadas a la distancia r, se calcula por integracin de la ley de Coulomb, para
- 21 -
Cristina Ayuso Aixa
determinar el trabajo necesario para separar dichas cargas a una distancia

infinita:
kq1q2
U= (1)
Dr
En la que k = 90 x 109 J m C-2 y D es la constante dielctrica del medio en el

que se hallan sumergidas las cargas (recurdese que D = 1 en el vaco y que,
para la mayor parte, aumenta con la polaridad del medio). La constante
dielctrica de una regin separada de una protena es difcil de calcular.
Para el interior de una protena se toman usualmente las que se hallan en el
intervalo de 2 a 5, en analoga con las constantes dielctricas que se miden en
las sustancias que tienen polaridades anlogas, tales como el benceno y el ter
dietlico.
Aunque los efectos electrostticos se encuentran entre los factores ms
importantes que gobiernan las conformaciones de las protenas, su cuantificacin
sigue siendo una de las mayores fuentes de error en la determinacin de las
estabilidades de las protenas. Ello es debido a que las interacciones
electrostticas tienen un alcance bastante elevado, en comparacin con otros
tipos de interacciones intramoleculares y, por tanto, incluyen a muchos tomos,
mientras que los otros tipos de interacciones se pueden describir de forma ms
simple.
2.1.1. Interacciones inicas

La asociacin de dos grupos inicos de una protena con carga opuesta se conoce
como par inico o puente salino. De acuerdo con la ecuacin anterior, la energa
de un par inico tpico, a saber el grupo carboxilo de Glu y el grupo amonio de
Lys, cuyos centros de carga se hallan separados por 40 , en un medio de
constante dielctrica 4, es de -86 kJ/mol (una carga electrnica = 160 x 10-19C).
Sin embargo los iones libres en disolucin acuosa se hallan muy solvatados, de
modo que la energa libre de solvatacin de dos iones separados es casi igual a la
energa libre de formacin de su par inico sin solvatar. Por esta razn, los pares
inicos contribuyen poco a la estabilidad respecto a la estructura de la protena
nativa. Ello explica las observaciones de que los pares inicos ocultos (sin
solvatar) aparecen raramente en las protenas y que los pares inicos que se
hallan expuestos al disolvente acuoso (razonablemente corrientes en las
protenas) se conservan poco en las protenas homlogas.
2.1.2. Interacciones dipolo-dipolo

Las asociaciones no covalentes entre molculas neutras elctricamente,
conocidas colectivamente como fuerzas de van der Waals, proceden de las
interacciones electrostticas entre dipolos permanentes o dipolos inducidos.
Estas fuerzas son las responsables de numerosas interacciones, de fuerza
variable, entre tomos vecinos que no se hallan enlazados.
- 22 -
Las interacciones entre dipolos permanentes son determinantes estructurales

importantes en las protenas porque muchos de sus grupos, tales como los
grupos carbonilo y amida del esqueleto peptdico, poseen momentos dipolares
permanentes. Estas interacciones son, generalmente, mucho ms dbiles que las
interacciones carga-carga de los pares inicos.
Un dipolo permanente induce tambin un momento dipolar sobre un grupo
vecino, de modo que se establece una interaccin atractiva. Esta interaccin
dipolo-dipolo inducido es, en general, mucho ms dbil que las interacciones
dipolo-dipolo.
Aunque las molculas no polares son casi elctricamente neutras en cualquier
momento, poseen un pequeo momento dipolar que es consecuencia del
movimiento de fluctuacin rpida de sus electrones. Este momento dipolar
transitorio polariza a los electrones de un grupo vecino y, por ello, provoca la
aparicin de un momento dipolar tal que, en las proximidades de sus distancias
de contacto de Van der Waals, los grupos se atraen entre s. Estas fuerzas, que
reciben el nombre de fuerzas de dispersin de London, son extremadamente
dbiles.
Las fuerzas de London aportan, tambin, una parte importante de la energa de
enlace en las interacciones complementarias espaciales entre las protenas y las
molculas con las que se unen especficamente.
2.2. Fuerzas por enlace de hidrgeno

Los enlaces de hidrgeno (D-H A), son predominantemente interacciones
electrostticas entre un grupo dador dbilmente cido (D-H) y un tomo aceptor
(A) que es portador de un par de electrones solitario. En los sistemas biolgicos,
D y A pueden ser los tomos muy electronegativos de N y de 0 y, en ocasiones,
los tomos de S. Los enlaces de hidrgeno, cuyas energas de asociacin oscilan
en el intervalo de -12 a -30 kJ/mol, estn mucho ms orientados que las fuerzas
de Van der Waals, aunque sus direcciones de enlace estn menos dirigidas que
en los enlaces covalentes.
La distancia D A se encuentra normalmente en el intervalo de 27 a 31 . Los
enlaces de hidrgeno tienden a ser lineales, con el enlace D-H sealando a lo
largo del orbital del par solitario del aceptor. Sin embargo, no son infrecuentes
grandes desviaciones de esta geometra ideal. Por ejemplo, en los enlaces de
hidrgeno de las hlices y de las hojas con plegamiento , los enlaces N-H
apuntan aproximadamente a lo largo de los enlaces C=O, en lugar de hacerlo
sobre el orbital del par solitario del O, y en las hojas con plegamiento paralelo,
los enlaces de hidrgeno se separan significativamente de la linealidad.
Los grupos que establecen enlaces de hidrgeno internos en una protena se
hallan dispuestos de modo que se forman casi todos los enlaces de hidrgeno
posibles. Est claro que los enlaces de hidrgeno tienen una influencia principal
sobre las estructuras de las protenas. Sin embargo, una protena desplegada
establece todos sus enlaces de hidrgeno con las molculas del disolvente
acuoso (se recordar que el agua es un potente dador y aceptor de enlaces de
hidrgeno). La energa libre de estabilizacin que los enlaces de hidrgeno
internos confieren a una protena nativa es, por tanto, igual a la diferencia de
- 23 -
Cristina Ayuso Aixa
energa libre de los enlaces de hidrgeno entre la protena nativa y la protena

desplegada.
Puesto que, en una primera aproximacin los diversos enlaces de hidrgeno a
que se hace referencia tienen todos la misma energa libre, los enlaces de
hidrogeno internos no estabilizan de modo significativo la estructura de una
protena nativa con relacin a su estado desplegado y en realidad an podran
desestabilizarla ligeramente. Esta idea la confirma la observacin de que las
protenas se desnaturalizan con ms facilidad en disoluciones acuosas que
contienen disolventes orgnicos de constante dielctrica baja, como el alcohol o
la acetona, que cuando ambos disolventes se hallan ausentes. Como la
naturaleza electrosttica de las asociaciones por enlaces de hidrgeno los hace
ms fuertes a medida que la constante dielctrica del medio es menor, esto se
opone al resultado que podra esperarse si los enlaces de hidrgeno internos
fuesen la influencia principal en la estabilizacin de la estructura de las protenas.
No obstante, los enlaces de hidrogeno internos de una protena proporcionan una
base estructural para su modelo de plegamiento: Si una protena se plegase de
modo que impidiese la formacin de algunos de sus enlaces de hidrgeno
internos, se perdera su energa libre y tales conformaciones seran menos
estables que aquellas en que se estableciesen todos los enlaces de hidrgeno
internos posibles.
2.3. Fuerzas hidrofbicas

Efecto hidrofbico es el nombre que se da a las interacciones que provocan las
sustancias no polares para conseguir que sus contactos con el agua sean
mnimos y a las de las molculas anfipticas, tales como los jabones y los
detergentes, para formar micelas en las disoluciones acuosas. Como las
protenas nativas forman una especie de micela intramolecular en la que la
mayor parte de las cadenas laterales no polares se hallan fuera del contacto con
el disolvente acuoso, las interacciones hidrofbicas deben constituir un
determinante importante de las estructuras de las protenas.
El efecto hidrofbico es una consecuencia de las propiedades especiales del agua
como disolvente, solamente una de las cuales es su constante dielctrica
elevada. De hecho, otros disolventes polares, tales como el dimetilsulfxido
(DMSO) y la N,N-dimetilformamida (DMF), tienden a desnaturalizar las protenas.
Cul es el mecanismo fsico por el que se excluyen del medio de la disolucin
acuosa las entidades no polares? Recurdese que la entropa es una medida del
orden de un sistema y que disminuye al aumentar el orden. As, la disminucin
de entropa cuando una molcula no polar o cadena lateral se solvata por el agua
(el inverso del proceso comentado) debe ser consecuencia de un proceso de
ordenacin. Esto es una observacin experimental, no una conclusin terica.
Las magnitudes de las variaciones de entropa son demasiado grandes para que
puedan atribuirse a los cambios de las conformaciones de los hidrocarburos; ms
bien, como sealaron Henry Frank y Marjorie Evans en 1945, estas variaciones
de entropa slo pueden proceder de alguna clase de ordenacin de la estructura
del agua.
El agua lquida posee una estructura de enlaces de hidrgeno muy ordenada y
extensa.
- 24 -
La insinuacin de un grupo no polar en el interior de su estructura la altera: Un

grupo no polar no puede ni aceptar ni ceder enlaces de hidrgeno, de modo que
las molculas de agua situadas en la superficie de la cavidad ocupada por el
grupo no polar no pueden unirse mediante enlaces de hidrgeno con otras
molculas de agua del modo habitual. Con objeto de recuperar la energa de
enlace de hidrgeno prdida, estas molculas de agua superficiales deben
orientarse ellas mismas de modo que formen una red de enlaces de hidrgeno
que cierre la cavidad.
Figura 3. Preferencia en las orientaciones de las molculas de agua que

se hallan prximas a un soluto no polar.4
Esta orientacin constituye una ordenacin de la estructura del agua, ya que el

nmero de modalidades por las que las molculas de agua pueden formar
enlaces de hidrgeno alrededor de la superficie de un grupo no polar es inferior
al que pueden exhibir en el conjunto del agua.
Desgraciadamente, la complejidad de la estructura bsica del agua no ha
permitido, todava, una descripcin estructural detallada de este proceso de
ordenacin. Se ha propuesto un modelo en el que el agua forma jaulas
(estructuras cerradas) de enlaces de hidrgeno casi cristalinas en torno a los
grupos no polares, que son semejantes a las de los clatratos.
4
Referencia Figura 3 y 4: Fonaments de Bioqumica. Juli Perit/Ramon Sendra.
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Cristina Ayuso Aixa
Figura 4. Estructura del clatrato (n-C4H9)3S+F- 23 H2O
Las magnitudes de las variaciones de entropa que se producen cuando las

sustancias no polares se disuelven en el agua indican, sin embargo, que las
estructuras del agua resultantes slo pueden estar ordenadas ms ligeramente
que el grueso del agua. Deben ser, tambin, muy diferentes de las del hielo
ordinario, ya que, por ejemplo, la solvatacin de los grupos no polares por el
agua origina un gran decremento en el volumen del agua.
La desfavorable energa libre de hidratacin de una sustancia no polar, originada
por la ordenacin que induce de las molculas de agua que la rodean, tiene por
resultado neto que la sustancia no polar queda excluida de la fase acuosa. Esto
es debido a que el rea de la cavidad que contiene un agregado de molculas no
polares es menor que la suma de las reas de las superficies de las cavidades
que cada una de estas molculas ocuparan individualmente. La agregacin de
las molculas no polares disminuye, por tanto, el rea superficial de la cavidad y,
por ello, la perdida de entropa de todo el sistema. En cierto sentido, los grupos
no polares se ven forzados a salir de la fase acuosa por las interacciones
hidrofbicas.
Las medidas termodinmicas indican que la variacin de energa libre en la
separacin de un grupo CH2- de una disolucin acuosa es de cerca de -3 kJ
/mol. Aunque sta es una cantidad relativamente pequea de energa libre, en
asociaciones moleculares en las que intervienen nmeros grandes de contactos
no polares, las interacciones hidrofbicas constituyen una fuerza poderosa.
Las fuerzas hidrofbicas constituyen una fuerza importante entre las causas que
obligan a plegarse a las protenas para adoptar sus conformaciones nativas.
Con el ndice hidroptico se indica las hidropatias (ndice de las tendencias
combinadas de carcter hidrofbico e hidroflico) de las cadenas laterales de los
aminocidos; en realidad, estos valores constituyen un buen criterio para la
prediccin de que porciones de una cadena de un polipptido se hallan en el
interior de una protena, fuera del contacto con el disolvente acuoso, y que
porciones se hallan en el exterior, en contacto con el disolvente acuoso.
- 26 -
En las protenas los efectos de las fuerzas hidrofbicas se mencionan, con

frecuencia, como enlaces hidrofbicos, presumiblemente para indicar la
naturaleza especfica del plegamiento de la protena por influencia del efecto
hidrofbico. Sin embargo, debe tenerse presente que el enlace hidrofbico no
origina interacciones especificas dirigidas, como las que habitualmente se
asocian al termino "enlace".
2.4. Desnaturalizacin de las protenas

Las pequeas estabilidades de la conformacin de las protenas nativas las
convierten en muy susceptibles a la desnaturalizacin, al alterarse el equilibrio
de las dbiles fuerzas no enlazantes que mantienen la conformacin precedente.
Cuando se calienta una protena en disolucin, sus propiedades conformacionales
sensibles, tales como la rotacin ptica, la viscosidad y la absorcin UV, varan
abruptamente en un intervalo muy limitado de temperaturas. Estos cambios
discontinuos indican que la estructura de dicha protena se despliega de manera
cooperativa: Cualquier desplegamiento parcial de la estructura desestabiliza la
estructura restante que debe colapsarse simultneamente hasta adoptar el
arrollamiento al azar. La temperatura en el punto medio de este proceso se
conoce como temperatura de fusin, Tm de la protena en analoga con el punto
de fusin de un slido. La mayor parte de las protenas tienen valores de Tm
bastante por debajo de 100 C. Entre las excepciones a esta generalizacin, se
encuentran, sin embargo, las protenas de las bacterias termoflicas, organismos
que habitan las fuentes termales con temperaturas que se aproximan a los 100
C. Es interesante que las estructuras por rayos-X de estas proteinas
termoestables no son sino sutilmente diferentes de las de sus homlogos
normalmente estables.
Adems de por las temperaturas elevadas, las protenas se desnaturalizan por
otras condiciones y sustancias:
1. Las variaciones de pH alteran los estados de ionizacin de las cadenas

laterales de los aminocidos, lo que cambia la distribucin de carga de la
protena y los requerimientos para el enlace de hidrogeno.
2. Los detergentes, algunos de los cuales perturban de modo significativo las

estructuras de las protenas a concentraciones tan bajas como 10-6 M, se
asocian hidrofbicamente con los restos no polares de una protena,
interfiriendo, por tanto, con las interacciones hidrofbicas responsables de la
estructura de la protena nativa.
3. Las concentraciones elevadas de sustancias orgnicas solubles en el agua,

tales como los alcoholes alifticos, interfieren con las fuerzas hidrofbicas que
estabilizan las estructuras de la protena mediante sus propias interacciones
hidrofbicas con el agua. Sin embargo, las sustancias orgnicas con varios
grupos hidroxilo, tales como el etilenglicol o sacarosa, son desnaturalizantes
relativamente dbiles, porque su capacidad para establecer enlaces de
hidrgeno los convierte en agentes con escasa capacidad para romper la
estructura del agua.
- 27 -
Cristina Ayuso Aixa
Figura 5. Representacin de las molculas de sacarosa y etilenglicol
El orden de eficacia de los diversos iones en la estabilizacin de una protena,

que es ampliamente independiente de la identidad de la protena, mantiene
paralelismo con su capacidad para precipitar a las protenas por salado. Este
orden se conoce como las series de Hofmeister:
Figura 6. Representacin de la serie Hofmeister
Los iones de las series de Hofmeister que tienden a desnaturalizar a las

protenas, I-, ClO4-, SCN-, Li+, Mg2+, Ca2+ y Ba2+, se dice que son caotrpicos.
Esta lista debera incluir tambin al ion guanidinio (Gu+) y a la urea no inica,
que, cuando las concentraciones se encuentran en el intervalo de 5 a 10 M, son
los desnaturalizantes de protenas ms empleados. El efecto de los diversos
iones sobre las protenas es acumulativo, en su sentido ms amplio: GuSCN es
un desnaturalizante mucho ms potente que GuCl que se utiliza con frecuencia,
mientras que Gu2SO4 estabiliza la estructura de las protenas.
Figura 7. Representacin de la molcula de urea y del in guanidinio
Los agentes caotrpicos aumentan la solubilidad de las sustancias no polares en

el agua. Por consiguiente, su eficacia como desnaturalizantes descansa en su
capacidad para romper las interacciones hidrofbicas, aunque la manera como lo
hacen no se comprende bien. Recprocamente, aquellas sustancias relacionadas
que estabilizan a las protenas fortalecen las fuerzas hidrofbicas, aumentando
de esta manera la tendencia del agua a expulsar a las protenas. Ello explica la
correlacin entre las capacidades de un ion para estabilizar a las protenas y para
precipitarlas por salado.
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CAPTULO 3:
CARACTERIZACIN Y
PURIFICACIN DE
PROTENAS
Cada tipo de clula puede contener millares de protenas diferentes, cada especie
de organismo contiene un conjunto caracterstico de protenas qumicamente
diferentes de las de otros organismos. Las protenas son molculas relativamente
frgiles, que conservan su actividad biolgica solamente en un intervalo
relativamente limitado de pH y de temperatura.
El aislamiento en forma pura de una protena determinada procedente de una
clula o tejido, puede por tanto parecer que constituye una tarea difcil,
especialmente porque, cualquier protena determinada puede existir slo en una
concentracin muy baja en el interior de la clula, acompaada de millares de
otras protenas. A pesar de todas estas dificultades, se han conseguido aislar
muchas de ellas en forma pura. Por otra parte, los mtodos corrientes para la
separacin de protenas poseen un poder de resolucin elevado.
En este apartado se describen el sistema empleado en su purificacin y algunos
de los mtodos para su caracterizacin. Aunque el presente captulo no se
extiende mucho acerca de la biologa de las protenas, mucho de lo que se sabe
en la actualidad acerca de su biologa depende de la posibilidad de disponer de
preparaciones de protenas de elevado grado de pureza, cuyo aislamiento ha
precisado de una gran cantidad de oscuro y cuidadoso esfuerzo.
- 29 -
Cristina Ayuso Aixa
3.1. Extraccin y purificacin

El gran nmero de protenas que existen, su gran variedad de actividades
biolgicas y las diferencias qumicas existentes entre las protenas homlogas de
los distintos organismos determinan que la extraccin, la purificacin y la
caracterizacin de las protenas constituyan un punto central en toda
investigacin bioqumica. Se han purificado ya, al menos parcialmente, alrededor
de un millar de enzimas diferentes, y algo ms de 200 se han obtenido en forma
cristalina pura. Adems, centenares de otras protenas distintas de los enzimas
se han aislado con un elevado grado de pureza.
Los mtodos iniciales de aislamiento de las protenas fueron empricos, lentos y
muy laboriosos; actualmente se han transformado en un arte depurado. No
existe un procedimiento nico, o un conjunto de procedimientos mediante los
cuales todas y cada una de las protenas puedan aislarse, sino que normalmente
se sigue una secuencia de etapas de separacin para cualquier protena, que
dar por resultado un grado de purificacin elevado y un alto rendimiento. El
objetivo general consiste en aumentar la pureza o la actividad biolgica de la
protena deseada por unidad de peso mediante la eliminacin del material
inactivo o de las protenas no deseadas, mientras que al mismo tiempo se
consigue un rendimiento mximo.
El primer requisito es un mtodo especfico y sensible para distinguir y medir
cuantitativamente la protena que se va a aislar. Si se trata de un enzima, se
requiere un sistema de ensayo cuantitativo que permita determinar su actividad
cataltica. Si la protena es una hormona, debe disponerse de un ensayo biolgico
adecuado. Si la protena posee un componente qumico distintivo, por ejemplo un
metal como el cobre, puede utilizarse un mtodo analtico sensible para este
componente.
Tambin es necesario un procedimiento para liberar la protena en forma soluble
de la clula intacta o de la estructura del tejido sin provocar prdidas de
actividad. Normalmente se emplea la trituracin mecnica u homogenizacin de
los tejidos animales para romper las membranas celulares y liberar los
contenidos celulares, los cuales pueden ser valorados despus para determinar
su contenido en la protena deseada. Con las bacterias, las levaduras y muchas
clulas vegetales, se necesitan procedimientos mucho ms vigorosos para
romper sus gruesas paredes celulares, por ejemplo la radiacin snica, la
trituracin con arena o la fragmentacin en una prensa de elevada presin.
A veces la pared celular puede ser debilitada o lisada por tratamiento con ciertos
enzimas.
Normalmente la etapa siguiente consiste en determinar si la protena en cuestin
se halla localizada en uno de los orgnulos subcelulares principales, como el
ncleo, las mitocondrias o la porcin soluble del citoplasma.
Ello puede conseguirse efectuando la separacin de los orgnulos subcelulares
mediante centrifugacin diferencial. Si la protena se encuentra en una de las
fracciones celulares principales, puede conseguirse un grado sustancial de
purificacin utilizando aquella fraccin celular como punto de partida para la
siguiente etapa de purificacin. Si la protena deseada se halla por casualidad
asociada a una membrana o a un orgnulo membranoso, debe ser extrada de
all en forma soluble, lo cual puede conseguirse, frecuentemente, por simple
- 30 -
extraccin con agua o bien por ruptura mecnica o snica de las membranas, y
tambin mediante el empleo de detergentes para lograr la desintegracin de la
estructura membranosa.
Una vez que se ha obtenido la protena deseada en forma soluble, pueden
aplicarse los mtodos de fraccionamiento (dilisis, ultrafiltracin, electroforesis,
centrifugacin, cromatografa de exclusin molecular, precipitacin isoelctrica,
fraccionamiento con disolventes y efecto de la temperatura) con objeto de
separarla de las protenas contaminantes. Por ensayo directo puede determinarse
en cul de las fracciones aparece la protena deseada y si se ha enriquecido
selectivamente por aumento de la actividad especfica. Puesto que las clulas de
partida o el extracto de tejido pueden contener centenares de protenas
diferentes, la purificacin de una protena determinada puede precisar de
muchas etapas para separar muchas otras protenas de aquella que se va a
purificar. Se utiliza una serie de procedimientos segn secuencias que se
escogen empricamente.
Entre los procedimientos de separacin utilizados como etapas iniciales tenemos
la precipitacin isoelctrica, el fraccionamiento por salado o la precipitacin con
disolventes. En cada etapa de fraccionamiento deben determinarse el factor de
enriquecimiento y el rendimiento en la protena deseada. Estas etapas iniciales,
en las cuales el poder de resolucin no es grande, van seguidas generalmente de
procedimientos cromatogrficos. Se emplean con frecuencia la cromatografa de
exclusin molecular y la de intercambio inico, en una u otra secuencia, con
objeto de obtener fracciones enriquecidas en la protena deseada, basndose en
el tamao molecular y en la carga elctrica, respectivamente.
Cuando es posible efectuar la cromatografa de afinidad, constituye un mtodo
de gran poder resolutivo que puede emplearse despus o en vez de otras formas
de cromatografa.
A veces, y como ltima etapa de purificacin, generalmente en pequea escala,
se somete la protena a una u otra forma de electroforesis de zona, electroforesis
discontinua o enfoque isoelctrico, con objeto de conseguir una separacin
altamente resolutiva de la protena deseada con respecto a las impurezas que
todava la acompaan.
Si el rendimiento global en protena purificada al final de una secuencia de tales
etapas de purificacin ha sido lo suficientemente elevado, es a menudo posible la
cristalizacin de la protena. Un procedimiento a seguir para ello podra ser la
adicin muy lenta de sal de modo que se aproxime a la concentracin necesaria
para la precipitacin por salado, o bien que se alcance el pH prximo a la
precipitacin isoelctrica.
Otro mtodo es invertir este procedimiento; la protena se precipita por salado,
se diluye solamente lo suficiente para conseguir su redisolucin y se abandona la
disolucin para que pierda agua por evaporacin. Sin embargo, la cristalizacin
no constituye necesariamente un signo de pureza total, ya que los cristales de
protena contienen, con frecuencia, impurezas retenidas. En todos estos
procedimientos el pH debe ser cuidadosamente controlado mediante tampones
apropiados y la temperatura ha de ser mantenida a su nivel ptimo, el cual, para
la mayor parte de las protenas, se halla prximo a los 0 C.
- 31 -
Cristina Ayuso Aixa
3.2. Caracterizacin
Despus de haberse aislado una protena determinada en forma muy purificada,
debe establecerse su homogeneidad. A este objeto era prctica corriente el
anlisis par electroforesis libre y por sedimentacin en la ultracentrfuga, pero
estos mtodos, relativamente poco sensibles y caros, han sido sustituidos en
gran parte, par mtodos ms sencillos, por ejemplo, la cromatografa de
exclusin molecular, la electroforesis sobre geles de poliacrilamida y el enfoque
isoelctrico, los cuales poseen mucha mayor capacidad de resolucin y pueden
detectar fcilmente la presencia de impurezas proteicas de menor cuanta.
Una vez establecida la homogeneidad de la protena, puede caracterizarse
mediante una sucesin de mtodos, con objeto de establecer
1. Su peso molecular.
2. Si contiene una cadena polipeptdica sencilla o mltiple.
3. El peso molecular de las cadenas polipeptdicas.
4. Su composicin en aminocidos.
5. Su secuencia de aminocidos.
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CAPTULO 4:
AMINOCIDOS
No debe sorprender que gran parte de la investigacin bioqumica inicial haya

estado relacionada con el estudio de las protenas. Las protenas constituyen la
clase de macromolculas biolgicas que poseen las propiedades fsico-qumicas
mejor definidas y, por consiguiente, son ms fciles de aislar y caracterizar, en
general, que los cidos nucleicos, los polisacridos o los lpidos. Adems, las
protenas, particularmente en forma de enzimas, desempean una funcin
bioqumica obvia. El papel central que juegan las protenas en los procesos
biolgicos ha sido reconocido, por tanto, desde los comienzos de la bioqumica.
Contrasta con ello la tarea desempeada por los cidos nucleicos en la
transmisin y en la expresin de la informacin gentica, que no fue puesto de
manifiesto hasta el final de los aos cuarenta. El papel de los lpidos en las
membranas biolgicas no fue apreciado hasta los aos sesenta y las funciones
biolgicas de los polisacridos todava son, en cierta medida, desconocidos.
Estudiamos en este apartado las propiedades de las unidades monomricas de
las protenas, los aminocidos.
Los aminocidos son, tambin, metabolitos energticos y muchos de ellos son
elementos nutritivos esenciales. Adems, como veremos, muchos aminocidos y
sus derivados son de importancia bioqumica por sus propios meritos.
4.1. Aminocidos estndar

Los anlisis de un amplio nmero de protenas de casi cualquier procedencia que
pueda concebirse han mostrado que todas las protenas estn compuestas por
los 20 aminocidos "estndar" que se hallan relacionados en la Tabla 15. Estas
sustancias se conocen como alfa-aminocidos ya que, con excepcin de la
5 Ver tabla 1 que se adjunta en el anexo de la memoria de este proyecto.
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Cristina Ayuso Aixa
prolina, poseen un grupo amino primario y un grupo cido carboxlico como

sustituyentes en el mismo tomo de carbono, Figura 8. (La prolina, la nica
excepcin de esta estructura general, posee un grupo amino secundario y es, por
tanto, un alfa-iminocido aunque, no obstante, corrientemente se menciona
como un aminocido.)
Figura 8. Frmula de estructura general de los aminocidos.
4.1.1. Propiedades generales

Los valores de pK de los 20 alfa-aminocidos estndar ya se encuentran
tabulados.En la consulta de cualquiera de estas tablas, se encontrar diferentes
medidas de pK, que se refieren, respectivamente, a los grupos del cido alfa-
carboxlico y alfa-amino. Tambin podemos encontrar un tercer pK referido a los
grupos laterales con propiedades cido-base. Los valores de pK de los grupos del
cido carboxlico se encuentran situados en un intervalo pequeo de alrededor de
22, de modo que por encima de pH 35 estos grupos se hallan casi por completo
en sus formas de carboxilato. Los grupos alfa-amino poseen todos los valores de
pK cercanos a 94 y, por tanto, se hallan casi completamente en forma de in
amonio por debajo de pH 80. Esto conduce a un punto estructural importante:
En el intervalo de pH fisiolgico tanto los grupos de cido carboxlico como los
grupos amino de los alfa-aminocidos se hallan completamente ionizados, como
se observa en la Figura 9.
Figura 9. Forma de los aminocidos que aparecen a valores de pH

fisiolgicos.
Un aminocido puede, por esta razn, actuar bien como cido o como base. Las
sustancias que exhiben esta propiedad se dice que son anfotricas y se las
designa como anfolitos (electrolitos anfotricos).
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Las molculas portadoras de grupos cargados de polaridad opuesta se conocen

como zwitterions o iones dipolares. El carcter zwitterinico de los alfa-
aminocidos se ha establecido por varios mtodos, entre los que se hallan
medidas espectroscpicas y de determinacin de la estructura cristalina por
rayos-X (en el estado slido los alfa-aminocidos son zwitterinicos debido a que
los grupos amino bsicos sustraen un protn del grupo cido carboxlico ms
prximo).
Debido a que los aminocidos exhiben el carcter de zwitteriones poseen
propiedades fsicas que son caractersticas de los compuestos inicos. Por
ejemplo, la mayor parte de los alfa-aminocidos muestran puntos de fusin
prximos a 300 C, mientras que los derivados no inicos funden habitualmente
alrededor de 100C. Adems, los aminocidos, al igual que otros compuestos
inicos, son ms solubles en disolventes polares que en los disolventes no
polares. En realidad, la mayor parte de los alfa-aminocidos son muy solubles en
el agua pero son muy insolubles en los disolventes orgnicos.
4.1.2. Enlaces de los pptidos

Los alfa-aminocidos se polimerizan, al menos conceptualmente, mediante la
eliminacin de una molcula de agua tal como se indica en la Figura 10. El enlace
resultante CO-NH se conoce como enlace pptido. Los polmetros compuestos
por dos, tres, unos pocos (3-10) y muchos restos aminocidos (tambin
llamados unidades pptido) se conocen como dipptido, tripptidos,
oligopptidos y polipptidos, respectivamente. Sin embargo, estas sustancias se
designan con frecuencia, a fin de simplificar, como "pptidos". Las protenas son
molculas constituidas por una a ms cadenas de polipptidos. La longitud de
estos polipptidos se halla comprendida en el intervalo de ~ 40 hasta el de unos
4000 restos aminocidos y como la masa media de un resto aminocido es de ~
110 D, poseen masas moleculares comprendidas entre ~ 4 y unos 440 kD.
Figura 10. Condensacin de los aminocidos para formar un dipptido.
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Cristina Ayuso Aixa
Los polipptidos son grupos de pptidos lineales; es decir, cada resto aminocido
se halla unido a sus vecinos en una unin cabeza-cola, en vez de formar cadenas
ramificadas. Esta observacin refleja la elegante simplicidad subyacente de la va
por la que los sistemas vivos construyen estas macromolculas ya que, como
veremos ms adelante, los cidos nucleicos que codifican las secuencias de los
aminocidos de los polipptidos son, tambin, polmeros lineales. Esto permite la
correspondencia directa entre la secuencia del monmero (nucletido) del cido
nucleico y la secuencia del monmero (aminocido) del polipptido
correspondiente sin la complicacin adicional de especificar las posiciones y las
secuencias de cualquier cadena ramificada.
Al disponer de 20 posibilidades de eleccin para cada resto aminocido en una
cadena polipeptdica, es fcil ver que pueden existir un gran nmero de
molculas de protena diferentes. Por ejemplo, para los dipptidos, cada una de
las 20 posibilidades de eleccin del primer resto aminocido pueden tener 20
posibilidades de eleccin para el segundo resto aminocido, lo que da un total de
202 = 400 dipptidos distintos. Anlogamente, para los tripptidos, existen 20
posibilidades para cada uno de los 400 dipptidos con lo que se obtienen un total
de 203 = 8000 tripptidos diferentes. Una molcula de protena, ms o menos
tpica, est constituida por una cadena polipeptdica nica de 100 restos. Existen
20100 = 1,27 X 10130 cadenas polipeptdicas nicas posibles de esta longitud, una
cantidad mucho mayor que el nmero de tomos que se estima que existen en el
universo (9 x 1078). Est claro que la naturaleza podra haber confeccionado
solamente una fraccin mnima de las molculas de protena diferentes que son
posibles. No obstante, los diversos organismos que se hallan en la tierra
sintetizan colectivamente un nmero enorme de molculas de protena
diferentes, cuyo gran intervalo de caractersticas fsico-qumicas se justifican
ampliamente desde las variadas propiedades de los 20 aminocidos "estndar".
4.1.3. Clasificacin y caractersticas

El modo ms corriente y quiz el ms til de clasificar a los 20 aminocidos
"estndar" es de acuerdo con las polaridades de sus cadenas laterales (grupos
R). Ello es debido a que las protenas se pliegan, adoptando sus conformaciones
nativas, en gran medida como respuesta a la tendencia a separar sus cadenas
laterales hidrofbicas del contacto con el agua y a solvatar sus cadenas laterales
hidroflicas. De acuerdo con este esquema de clasificacin existen tres tipos
principales de aminocidos: (1) con grupos R no polares, (2) con grupos R
polares sin carga, y (3) con grupos R polares con carga.
a) Las cadenas laterales no polares de los aminocidos pose en una gran
variedad de formas y de tamaos
Son nueve los aminocidos que se clasifican como poseedores de cadenas
laterales no polares. La glicina (que cuando se encontr que era un
componente de la gelatina, en 1820, fue el primer aminocido que se
identifico en los hidrolizados de protena) posee la cadena lateral ms
pequea posible, un tomo de H.
Alanina, Valina, leucina e isoleucina poseen cadenas laterales de
hidrocarburo aliftico cuyo tamao se sita desde el de un grupo metilo
para la alanina hasta los grupos butilo isomricos de la leucina y la
isoleucina.
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La metionina posee una cadena lateral de ter tilico, que se parece a un

grupo n-butilo en muchas de sus propiedades fsicas (C y S poseen
electronegatividades casi iguales y el S es aproximadamente del mismo
tamao que un grupo metileno).
La prolina, que es un alfa-iminocido cclico, muestra limitaciones de
conformacin impuestas por la naturaleza cclica de su grupo lateral
pirrolidino, que es singular entre los 20 aminocidos "estndar".
La fenilalanina con su porcin fenilo, y el triptfano, con su grupo indol,
contienen grupos laterales aromticos, que se caracterizan por su tamao
y por su ausencia de polaridad.
b) Las cadenas laterales polares sin carga poseen grupos hidroxilo, amida o
tiol.
Seis aminocidos se clasifican comnmente como poseedores de cadenas
laterales polares sin carga.
Serina y treonina son portadoras de grupos R hidroxlicos de tamaos
diferentes. Asparagina y glutamina poseen cadenas laterales portadoras de
amida de diferentes tamaos. La tirosina posee un grupo fenlico. La
cistena tiene un grupo tiol y es un ejemplar nico entre los 20
aminocidos porque forma, con frecuencia, un enlace disulfuro con otro
resto de cistena por oxidacin de sus grupos tiol. Este compuesto
dimrico se designa en la literatura bioqumica antigua como el
aminocido cistina. El puente disulfuro tiene una gran importancia en la
estructura de las protenas: Puede unir cadenas polipeptdicas separadas o
establecer enlaces entrecruzados entre dos cistenas de la misma cadena.
La semejanza que induce a confusin entre los nombres de cistena y
cistina ha conducido a designar el primero como hemi-cistina.
Sin embargo, la comprobacin de que la cistina se origina por enlace
entrecruzado de dos restos de cistena, despus de que ha tenido lugar la
biosntesis del polipptido ha determinado que el nombre de cistina sea
menos empleado corrientemente.
c) Las cadenas laterales polares con carga pueden poseer carga positiva o
negativa
Cinco aminocidos poseen cadenas laterales con carga. Los aminocidos
bsicos estn cargados positivamente a valores de pH fisiolgicos y
comprenden a la lisina, que posee una cadena lateral de butilamonio, la
arginina, que es portadora de un grupo guanidino, y la histidina que es
portadora de una porcin de imidazolio. La histidina, con pKR = 60, es el
nico de los 20 aminocidos que se ioniza dentro del intervalo de pH
fisiolgico. A pH 60, su grupo lateral imidazol slo se halla cargado un 50
%, de modo que en el extremo bsico del intervalo de pH fisiolgico, la
histidina es neutra. En consecuencia, las cadenas laterales de histidina
participan con frecuencia en las reacciones catalticas de los enzimas. Los
aminocidos acdicos, cido asprtico y cido glutmico, se hallan
cargados negativamente por encima de pH 3; en su estado inico se
mencionan, frecuentemente, como aspartato y glutamato. La asparagina y
la glutamina son, respectivamente, las amidas de los cidos asprtico y
glutmico.
La colocacin de los 20 aminocidos entre estos tres grupos diferentes es,
por supuesto, ms bien arbitraria. Por ejemplo, la glicina y la alanina, los
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Cristina Ayuso Aixa
ms pequeos de los aminocidos, y el triptfano, con su anillo

heterocclico, podran tambin clasificarse bien como aminocidos polares
sin carga. De modo anlogo, la tirosina y la cistena, con sus cadenas
laterales ionizables, podran considerarse tambin como aminocidos
polares con carga, particularmente a valores de pH ms altos, mientras
que la asparagina y la glutamina son casi tan polares como sus
correspondientes carboxilatos, aspartato y glutamato.
Los 20 aminocidos varan considerablemente en sus propiedades fsico-
qumicas, tales como polaridad, acidez, basicidad, aromaticidad, tamao,
flexibilidad de su conformacin, capacidad para establecer enlaces
entrecruzados, capacidad para formar enlaces de hidrgeno y reactividad
qumica. Estas diversas caractersticas, muchas de las cuales estn
interrelacionadas, son responsables en gran parte del amplio abanico de
propiedades que exhiben las protenas.
4.1.4. Propiedades cido-base

Los aminocidos y las protenas poseen propiedades cido-base notables. Los
alfa-aminocidos poseen dos o, los que tienen grupos laterales ionizables, tres
grupos cido-base. La curva de valoracin de la glicina, el aminocido ms
sencillo, aparece en la Figura 11. A valores de pH bajos, los grupos cido-base
de la glicina se hallan ambos completamente protonizados, de modo que adopta
la forma de catin +H3NCH2COOH. En el curso de una valoracin con una base
fuerte, como NaOH, la glicina pierde dos protones de modo escalonado
caracterstico como lo hace un cido poliprtico.
Los valores de pK de los dos grupos ionizables de la glicina son lo
suficientemente diferentes de modo que la ecuacin de Henderson-Hasselbalch:
pH = pK + log
[A ]

[HA] (2)
Se aproxima a cada una de las ramas de la curva de valoracin. En

consecuencia, el pK para cada etapa de ionizacin es el del punto medio de su
rama correspondiente de la curva de valoracin: a pH 235 las concentraciones
de la forma catinica, +H3NCH2COOH, Y de la forma zwitterinica, +H3NCH2COO-,
son iguales y, anlogamente, a pH 978 las concentraciones de la forma
zwitterinica y de la forma aninica, H2NCH2COO-, son iguales.
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Figura 11. Curva de valoracin de Glicina.6
Obsrvese que los aminocidos nunca adoptan la forma neutra en disolucin

acuosa.
El pH al que una molcula no es portadora de carga elctrica neta se conoce
como su punto isoelctrico, pI. En los alfa-aminocidos, la aplicacin de la
ecuacin de Henderson-Hasselbalch indica que, para un grado de precisin
elevado,
1
pI = ( pK i + pK j ) (3)
2
En la que Ki y Kj son las constantes de disociacin de las dos ionizaciones en las
que intervienen las especies neutras. En un cido monoamino, monocarboxlico
como la glicina, Ki y kj representan K1 y k2. Sin embargo en los cidos asprtico y
glutmico, Ki y kj representan K1 y kR, mientras que en arginina, histidina y
lisina, estas cantidades son KR y k2.
6 Referencia Figura 11: Bioqumica. Donald Voet/Judith G.Voet
- 39 -
Cristina Ayuso Aixa
El pK (476) del cido actico, que es tpico de los cidos monocarboxlicos

alifticos, es ~24 unidades de pH ms elevado que el pK1 de su derivado alfa-
amino, glicina. Esta gran diferencia en los valores de pK del mismo grupo
funcional se debe, a la influencia electrosttica del grupo amonio con carga
positiva de la glicina; esto es, el grupo NH3+ colabora en la repulsin del protn
de su grupo COOH.
Recprocamente, el grupo carboxilato de la glicina incrementa la basicidad de su
grupo amino (pK2 = 978) con respecto al que posee el ster metlico de la glicina
(pK = 775).
Sin embargo, los grupos NH3+ de la glicina y de sus steres son
significativamente ms cidos que las aminas alifticas (pK 107) debido a que
el grupo carboxilato tiene el carcter de atraer electrones.
La influencia electrnica de un grupo funcional sobre otro se amortigua
rpidamente a medida que aumenta la distancia entre los grupos. De aqu que
los valores de pK de los grupos alfa-carboxilato de los aminocidos y los
carboxilatos de las cadenas laterales de los cidos asprtico y glutmico formen
una serie que se va aproximando al valor del pK de un cido monocarboxlico
aliftico. Anlogamente, la constante de ionizacin del grupo amino de la cadena
lateral de lisina no puede distinguirse del de una amina aliftica.
Las protenas muestran curvas de valoracin complejas:
Las curvas de valoracin de los alfa-aminocidos con cadenas laterales
ionizables, tales como el cido glutmico, exhiben los tres valores de pK
esperados. Sin embargo, las curvas de valoracin de los polipptidos y de las
protenas, un ejemplo de las cuales se muestra en la Figura 12, raramente
proporcionan ninguna indicacin de los valores individuales de pK debido al gran
nmero de grupos ionizables que representan (tpicamente el 25 % de las
cadenas laterales de los aminocidos de una protena son ionizables).
Adems, la estructura covalente y tridimensional de una protena puede
provocar que se desplace el pK de cada grupo ionizable hasta varias unidades de
pH respecto al que exhibe en el alfa-aminocido libre, como resultado de la
influencia de los grupos prximos con carga, de los efectos del medio
procedentes de la proximidad de grupos de constante dielctrica baja y de los
efectos de las asociaciones por enlaces de hidrgeno.
La curva de valoracin de una protena depende, tambin, de la concentracin de
sal, debido a que los iones actan electrostticamente recubriendo las cargas de
las cadenas laterales con lo que atenan las interacciones carga- carga entre
ellas.
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Figura 12. Curvas de valoracin del enzima ribonucleasa A a 25C.7
4.1.5. La nomenclatura
Las abreviaturas de tres letras para representar los 20 restos aminocidos se dan
en la tabla siguiente:
Tabla 1. Aminocidos y abreviaturas.
Aminocido Smbolo de tres Smbolo de una

letras letra
Alanina Ala A
Arginina Arg R
Aspargina Asn N
cido asprtico Asp D
Aspargina Asx B
Cistena Cys C
cido glutmico Glu E
Glutamina Gln Q
7 Referencia Figura 12: Bioqumica. Donald Voet/Judith G.Voet
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Cristina Ayuso Aixa
cido glutmico Glx Z

Glicina Gly G
Histidina His H
Isoleucina Ile I
leucina Leu L
Lisina Lys K
Metionina Met M
Fenilalanina Phe F
Prolina Pro P
Serina Ser S
Treonina Thr T
Triptfano Trp W
Tirosina Tyr Y
Valina Val V
Vale la pena memorizar estos smbolos ya que se emplean con profusin en toda
la literatura bioqumica, incluido este texto. En la mayor parte de los casos, estas
abreviaturas proceden de las tres primeras letras del nombre en ingls del
aminocido correspondiente, y en la conversacin se pronuncian tal como se
leen.
El smbolo Glx puede significar Glu o Gln y, anlogamente, Asx significa Asp o
Asn. Estos smbolos ambiguos derivan de la experiencia del laboratorio, Asn y
Gln se hidrolizan con facilidad y rinden cido asprtico y cido glutmico,
respectivamente, en las condiciones cidas o bsicas que se emplean
habitualmente en la ruptura de las protenas. Por esta razn, si no se adoptan
precauciones especiales, no podemos determinar si cuando se detecta Glu, se
trata de Glu original o de Gln; con el Asp ocurre lo mismo.
En la Tabla 1 aparecen, tambin, los smbolos de una letra de los aminocidos.
Este cdigo ms compacto es particularmente til cuando se comparan las
secuencias aminocidas de las protenas semejantes.
Los restos aminocidos de los polipptidos se designan sustituyendo el sufijo -ino
del nombre del aminocido por -il. Las cadenas polipeptdicas se describen
iniciando el nombre a partir del amino final (conocido como N-terminal) y
designando secuencialmente cada resto hasta que se alcanza el carboxilo final
(C-terminal). El resto aminocido C-terminal recibe el nombre del aminocido
progenitor. As, el compuesto mostrado en la figura 13 se designa como
alaniltirosilaspartilglicina. Por supuesto que estos nombres aplicados a las
cadenas polipeptdicas que tengan ms de unos pocos restos son
extremadamente farragosos. El empleo de las abreviaturas para designar los
restos aminocidos resuelve, parcialmente, este problema. As el tetrapptido
anterior se designara por Ala-Tyr-Asp-Gly, empleando las abreviaturas de tres
letras y por AYDG, empleando los smbolos de una letra. Tngase en cuenta que
estas abreviaciones se escriben siempre de modo que el N-terminal de la cadena
polipeptdica se halla a la izquierda y el resto C-terminal se halla a la derecha.
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Figura 13. El tetrapptido Ala-Tyr-Asp-Gly.
Los diversos tomos de las cadenas laterales de los aminocidos se designan,

frecuentemente, con la secuencia de las letras del alfabeto griego, partiendo del
tomo de carbono adyacente al grupo carbonilo peptdico.
Por tanto, como indica la figura 14, se dice que el resto Lys posee un grupo -
amino y que Glu posee un grupo -carboxilo. Desgraciadamente este sistema de
designacin resulta ambiguo para diversos aminocidos.
Figura 14. Titulacin mediante el alfabeto griego empleada para

identificar tomos en los grupos R lisilo y glutamilo.
En consecuencia, los esquemas de numeracin estndar empleados para las

molculas orgnicas se aplican tambin en estos casos.
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Cristina Ayuso Aixa
4.2. Actividad ptica

Todos los aminocidos aislados despus de la hidrlisis suave de las protenas,
con excepcin de la glicina, son activos pticamente, es decir, hacen girar el
plano de la luz polarizada.
Las molculas con actividad ptica poseen una asimetra tal que no pueden
superponerse sobre su imagen en el espejo, del mismo modo que una mano
izquierda no puede superponerse sobre su imagen especular, la mano derecha.
Esta situacin es caracterstica de las sustancias que contienen tomos de
carbono tetradricos unidos a cuatro sustituyentes diferentes. Las dos molculas
dibujadas en la figura 15 no pueden superponerse ya que son imgenes
especulares. Los tomos centrales de estas constelaciones atmicas se conocen
como centros asimtricos, o centros quirales y de ellos se dice que poseen la
propiedad de quiralidad (del griego: cheir, mana). Los tomos C de todos los
aminocidos, con excepcin de la glicina, son centros asimtricos. La glicina, que
posee dos tomos de H como sustituyentes en su tomo de C, puede
superponerse sobre su imagen especular y por ello no muestra actividad ptica.
Figura 15. Los dos enantimeros del fluoclorobromometano.
Las molculas que no pueden superponerse sobre sus imgenes especulares se

conocen como enantimeros, el uno del otro. Las molculas enantiomricas no
pueden distinguirse fsica y qumicamente por la mayor parte de las tcnicas.
Solamente cuando se comprueba. La asimetra, por ejemplo, mediante La luz
polarizada en el plano o por reactantes que contienen tambin centros quirales,
pueden distinguirse y manipularse de modo diferente.
Existen tres sistemas de nomenclatura empleados corrientemente, mediante los
que puede clasificarse un estereoismero determinado de una molcula con
actividad ptica. A continuacin se explican los mencionados sistemas.
4.2.1. Clasificacin
Las molculas se clasifican como dextrorrotatorias (del griego: dextro, derecha)
o levorrotatorias (del griego: levo, izquierda), dependiendo de si hacen girar el
plano de luz polarizada en el sentido de las agujas del reloj o en sentido contrario
desde el punto en que lo contempla el observador. Esto puede determinarse
mediante el instrumento conocido como polarmetro. La medida cuantitativa de
la actividad ptica de la molcula se conoce como rotacin especfica:
- 44 -
[ ]25D = rotacinobservada( grados)

(4)
longitudrecorridoptico(dm)concntracin( gcm 3 )
en la que el superndice 25 se refiere a la temperatura a la que se acostumbran a

efectuar las medidas del polarmetro (25C) Y el subndice D indica la luz
monocromtica que se emplea tradicionalmente en polarimetra, la as llamada
lnea D en el espectro del sodio (5893 nm). A las molculas dextrorrotatorias y
levorrotatorias se les asignan valores positivos y negativos de []25D. A las
molculas dextrorrotatorias se las designa, de acuerdo con lo anterior, por el
prefijo (+) y a los enantimeros levorrotatorios con el prefijo (-). En una
nomenclatura equivalente, aunque arcaica, se utilizan las minsculas d (dextro)
y l (levo).
El signo y la magnitud de la rotacin especfica de una molcula depende de la
estructura de sta, de un modo complicado y no bien comprendido. Todava no
es posible el predecir con seguridad la magnitud ni aun el signo de la rotacin
especfica de una molcula determinada. Por ejemplo, prolina, leucina y arginina,
que se aslan de las protenas, poseen rotaciones especficas en disoluciones
acuosas puras de -862, -104 y +125 C, respectivamente. Sus enantimeros
exhiben valores de []25D de la misma magnitud pero de signo opuesto. Como
poda esperarse de la naturaleza cido-base de los aminocidos, estas cantidades
varan con el pH de la disolucin.
Un problema con esta clasificacin operativa de los ismeros pticos es que no
proporciona en el presente una indicacin interpretable de la configuracin
absoluta (distribucin espacial) de los grupos qumicos en torno de un centro
quiral. Adems, una molcula con ms de un centro asimtrico puede tener una
rotacin ptica que no se halla relacionada obviamente con el poder rotatorio de
los centros asimtricos individuales.
4.2.2. Convencin de Fisher

En este sistema, la configuracin de los grupos alrededor del centro asimtrico se
relaciona con el gliceraldehdo, una molcula que posee un centro asimtrico. Por
la convencin introducida por Emil Fischer en 1891, los estereoismeros (+) y (-)
del gliceraldehdo se designan como D-gliceraldehdo y L-gliceraldehdo,
respectivamente (obsrvese el empleo de letras maysculas de tamao
pequeo). Admitiendo la probabilidad de que slo fuese correcta la suposicin en
un 50 %, pens Fischer que las configuraciones de estas molculas eran las que
aparecen en la Figura 16. Propuso tambin Fischer una notacin
convenientemente reducida para estas molculas, conocida como proyecciones
de Fischer, que tambin aparecen en la figura 16. En la convencin de Fischer los
enlaces horizontales se proyectan por encima del plano del papel y los enlaces
verticales lo hacen por debajo del plano del papel, como se indica de modo
explicito por las frmulas geomtricas acompaantes.
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Cristina Ayuso Aixa
Figura 16. Configuraciones de la conveccin de Fischer.
La configuracin de los grupos en torno de un centro quiral pueden relacionarse

con la del gliceraldehdo, convirtiendo estos grupos en los del gliceraldehdo
mediante reacciones de estereoqumica conocida.
En los alfa-aminocidos, los grupos amino, carboxilo, R y H se distribuyen
alrededor del tomo de C en la relacin en que lo hacen en el gliceraldehdo los
grupos hidroxilo, aldehdo, CH20H y H. De la misma manera, se dice que el L-
gliceraldehdo y los L--aminocidos poseen la misma configuracin relativa
figura 17.
Figura 17. Configuraciones.
Empleando este mtodo pueden describirse las configuraciones de los alfa-

aminocidos sin necesidad de referirse a sus rotaciones especficas.
Todos los alfa-aminocidos procedentes de las protenas poseen configuraciones
L-estereoqumicas; es decir, que todos poseen la misma configuracin relativa
entorno de sus tomos de C. En 1949 se demostr por la entonces nueva
tcnica de cristalografa de rayos X que la eleccin arbitraria efectuada por
Fischer era correcta: la designacin de la configuracin relativa de los centros
quirales es la misma que su configuracin absoluta. Puede recordarse con
facilidad la configuracin absoluta de los restos de los L--aminocidos
empleando el "truco" nemotcnico cuyo diagrama aparece en la figura 18.
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Figura 18. Truco nemotcnico para poner de manifiesto L-aminocidos.
Los diasteremeros pueden distinguirse qumica y fsicamente

Una molcula puede tener mltiples centros asimtricos. En tales molculas, los
trminos estereoismeros e ismeros pticos se refieren a molculas con
configuraciones diferentes, al menos alrededor de uno de sus centros quirales,
pero por lo dems son idnticas. El trmino enantimero se conserva para
designar una molcula que es la imagen especular de la que se considera, es
decir, que se diferencian en todos sus centros quirales. Como cada centro
asimtrico en una molcula quiral puede tener dos configuraciones posibles, una
molcula con n centros quirales tiene 2n-1 estereoismeros posibles diferentes y
2n-1 pares enantiomricos. Treonina e isoleucina poseen cada una dos centros
quirales y, por tanto, 22 = 4 estereoismeros posibles. Las formas de treonina y
de isoleucina que se aslan de las protenas, que por convencin son llamadas
formas L. Las imgenes en el espejo de las formas L son las formas D. Los otros
dos ismeros pticos se dice que son diasteremeros (o formas alo) de las
formas enantiomricas D y L.
4.2.3. Sistema Cahn-Ingold-Prelog

A pesar de su utilidad, el esquema de Fischer resulta dificultoso y en ocasiones
ambiguo, para molculas con ms de un centro asimtrico. Por esta razn,
Robert Cahn, Christopher Ingold y Vladimir Prelog formularon, en 1956, el
siguiente esquema de nomenclatura absoluta. En el sistema propuesto, los
cuatro grupos que rodean a un centro quiral se ordenan de acuerdo con un
esquema de prioridad especfica: Los tomos de nmero atmico superior unidos
a un centro quiral se colocan por encima de los de nmero atmico inferior. Por
ejemplo, el tomo de oxgeno de un grupo OH precede al tomo de carbono de
un grupo CH3 que se halla unido al mismo tomo de C quiral.
Si alguno de los tomos del primer sustituyente son del mismo elemento, la
prioridad de estos grupos se establece desde los nmeros atmicos del segundo,
tercero, etc., tomos situados fuera del centro asimtrico.
De aqu que un grupo CH2OH preceda a un grupo CH3. Existen otras reglas
(dadas en la bibliografa y en muchos textos de qumica orgnica) para asignar
prioridad de clasificacin a sustituyentes con enlaces mltiples o con istopos
diferentes. El orden de prioridad de algunos grupos funcionales comunes es
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Cristina Ayuso Aixa
SH > OH > NH2 > COOH > CHO > CH2OH > C6H5 > CH3 > 2H > 1H
Hay que tener presente que cada uno de los grupos sustituyentes en un centro
quiral deben tener una prioridad de clasificacin diferente, de otro modo el
centro no sera asimtrico.
A los grupos ordenados por su prioridad, se les asignan las letras W, X, Y, Z de
modo tal que su clasificacin por orden de prioridad es W > X > Y > Z. Para
establecer la configuracin del centro quiral, este se contempla desde el centro
asimtrico hacia el grupo Z (el de prioridad inferior). Si el orden de los grupos W
X Y, tal como se ve desde esta direccin, es el de las agujas del reloj,
entonces la configuracin del centro asimtrico se designa por (R) (del latn:
rectus, derecha). Si el orden de W X Y es el contrario al de las agujas del
reloj el centro asimtrico se designa por (S) (del latn: sinistrus, izquierda).
Una ventaja principal del llamado sistema Cahn- Ingold-Prelog o sistema (RS) es
que las quiralidades de los compuestos con mltiples centros asimtricos pueden
describirse sin ambigedad.
Los centros proquirales poseen sustituyentes que pueden distinguirse
Dos sustituyentes idnticos qumicamente en un centro tetradrico que pudiera
ser quiral son diferentes desde el punto de vista geomtrico; es decir, el centro
no posee simetra de rotacin de modo que se le pueden asignar sin ambigedad
lado izquierdo y derecho.
Los objetos planos que no tienen simetra de rotacin poseen tambin la
propiedad de proquiralidad. Por ejemplo, en muchas reacciones enzimticas la
adicin estereoespecfica a un tomo de carbono trigonal se produce desde un
lado determinado de aquel tomo de carbono y rinde un centro quiral.
Si un tomo de carbono trigonal se halla encarado respecto al observador de
modo que el orden de prioridad de sus sustituyentes disminuye en el sentido de
las agujas del reloj la cara se designa como cara re (de rectus). La cara opuesta
se designa como cara si (de sinistrus), ya que la prioridad de sus sustituyentes
decrece en la direccin contraria a las agujas del reloj.
El sistema (RS) no se emplea mucho en la actualidad en bioqumica. Una razn
para ello reside en que compuestos relacionados ntimamente, que poseen la
misma representacin de configuracin empleando la convencin DL de Fischer,
pueden tener representaciones diferentes mediante el sistema (RS). En
consecuencia, emplearemos la convencin de Fischer en la mayor parte de los
casos. El sistema (RS), sin embargo, es indispensable para describir la
proquiralidad en reacciones estereoespecficas, de modo que lo hallaremos muy
valioso para la descripcin de reacciones enzimticas.
4.2.4. Quiralidad y bioqumica

La sntesis qumica ordinaria de molculas quirales produce mezclas racmicas
de estas molculas (cantidades iguales de cada uno de los miembros de un par
enantiomrico), debido a que los procesos ordinarios fsicos y qumicos no
exhiben preferencia estereoqumica.
Por consiguiente, existen probabilidades iguales de que en tales procesos se
produzca un centro asimtrico de cada mano. Con objeto de obtener un producto
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con actividad ptica neta debe emplearse un proceso quiral. Este tipo de
procesos se basa en el empleo de reactivos quirales aunque, al menos en
principio, el empleo de alguna influencia asimtrica como puede ser la luz
polarizada en una direccin puede producir una asimetra neta en un producto de
reaccin.
Una de las caractersticas ms notables de la vida es su produccin de molculas
con actividad ptica. La biosntesis de una sustancia que posea centros
asimtricos produce, casi invariablemente, un estereoismero puro. El hecho de
que los restos aminocidos de todas las protenas posean la configuracin L
constituye un ejemplo de este fenmeno. Esta observacin ha promovido la
intuicin de que un ensayo sencillo para diagnosticar acerca de la existencia,
pasada o presente, de vida extraterrestre seria el determinar la existencia de
actividad ptica en las rocas lunares o en los meteoritos que han cado sobre la
tierra. Cualquier hallazgo de este tipo sugerira que las molculas asimtricas
que se detectasen se habran producido por biosntesis. As, aun teniendo en
cuenta que se han extrado alfa-aminocidos de meteoritos carbonceos, la
observacin de que vienen en forma de mezclas racmicas sugiere que su origen
es qumico en vez de biolgico.
Uno de los enigmas del origen de la vida es porque la vida terrestre est basada
sobre ciertas molculas quirales en lugar de sus enantimeros, es decir, sobre
los L-aminocidos en vez de los D-aminocidos. Los argumentos de que efectos
fsicos como la luz polarizada podran haber provocado una asimetra neta
significativa en molculas sintetizadas prebiticamente no han resultado
convincentes. Quizs las formas de vida basadas en los L-aminocidos surgieron
al azar y simplemente "devoraron" cualquier forma de vida basada en los D-
aminocidos.
4.3. Aminocidos no estndar

Los 20 aminocidos corrientes no son, en modo alguno, los (nicos aminocidos
que aparecen en los sistemas biolgicos. Los aminocidos "no estndar" son,
con frecuencia, constituyentes importantes de las protenas y de polipptidos con
actividad biolgica.
Muchos aminocidos, sin embargo, no son constituyentes de las protenas. Junto
con sus derivados, desempean una variedad de papeles de importancia
biolgica.
4.3.1. Derivados aminocidos en las protenas

El cdigo gentico "universal", que es casi idntico en todas las formas de vida
conocidas, especifica solamente los 20 aminocidos "estndar". No obstante,
otros muchos aminocidos, una seleccin, son componentes de algunas
protenas. En todos los casos conocidos excepto uno, sin embargo, estos
aminocidos poco frecuentes proceden de la modificacin especfica de un resto
aminocido despus de que se ha sintetizado la cadena polipeptdica. Entre los
ms importantes de estos restos aminocidos modificados se encuentran la 4-
hidroxiprolina y la 5-hidroxilisina. Los restos de ambos aminocidos son
constituyentes estructurales importantes del colgeno, una protena fibrosa, que
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Cristina Ayuso Aixa
es la ms abundante en los mamferos. Los aminocidos de las protenas que

forman complejos con los cidos nucleicos se hallan modificados con frecuencia.
Por ejemplo, las protenas de los ribosomas y las de los cromosomas, conocidas
como histonas, pueden metilarse, acetilarse o fosforilarse selectivamente.
La N-formilmetionina es, inicialmente, el resto N-terminal de todas las protenas
procariticas, pero habitualmente resulta eliminada como parte del proceso de
maduracin de la protena. El cido -carboxiglutmico es un constituyente de
varias protenas que intervienen en la coagulacin de la sangre.
4.3.2. Papeles especializados de los aminocidos

Adems de su papel en las protenas, los aminocidos y sus derivados
desempean muchas funciones biolgicas importantes. Este empleo alternativo
de los aminocidos constituye un ejemplo de oportunismo biolgico, que
encontraremos repetidamente: La naturaleza tiende a adaptar los materiales y
los procesos que ya estn presentes a la ejecucin de nuevas funciones.
Los aminocidos y sus derivados funcionan, con frecuencia, como mensajeros
qumicos en la comunicacin entre las clulas. Por ejemplo, la glicina, el acido -
aminobutrico (GABA; un producto de descarboxilacin del glutamato) y la
dopamina (un producto de la tirosina) son neurotransmisores (sustancias que
liberan las clulas nerviosas para alterar el comportamiento de sus vecinos; la
histamina (producto de descarboxilacin de la histidina) es un mediador local
potente de las reacciones alrgicas y la tiroxina (producto de la tirosina) es una
hormona tiroidea que contiene yodo y estimula, generalmente, el metabolismo
de los vertebrados.
Algunos aminocidos son intermediarios importantes en diversos procesos
metablicos. Entre ellos se encuentran la citrulina y la ornitina, que son
intermediarios en la biosntesis de la urea; la homocistena, un intermediario en
el metabolismo aminocido y la S-adenosilmetionina, agente de metilacin
biolgica.
La diversidad de la naturaleza es notable. Se han encontrado unos 250
aminocidos diferentes en diversas plantas y hongos. Los papeles biolgicos de
la mayor parte de ellos permanecen en la obscuridad, aunque el hecho de que
muchos de ellos son txicos sugiere que desempean una funcin protectora. En
realidad, algunos, como la azaserina, son antibiticos tiles en medicina. Muchos
de estos aminocidos son derivados sencillos de los 20 aminocidos "estndar"
aunque algunos de ellos, entre los que se encuentran la azaserina y la -
cianoalanina, poseen estructuras poco habituales.
Aunque en las protenas solamente se encuentran L-aminocidos, en muchos
organismos se hallan presentes D-aminocidos. Estas sustancias que se
sintetizan directamente se hallan distribuidas, quiz ms profusamente, como
constituyentes de las paredes de las clulas bacterianas. Puede ser que su
funcin, como tales constituyentes, sea defensiva ya que los D-aminocidos
determinan que las paredes celulares de la bacteria sean menos susceptibles al
ataque por las peptidasas (enzimas que hidrolizan los enlaces pptido) que
muchos organismos emplean para digerir las paredes celulares bacterianas. Los
D-aminocidos aparecen tambin como componentes de muchos antibiticos,
entre los que se encuentran la valinomicina, la actinomicina o y la gramicidina S.
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CAPTULO 5:PROTENAS Y
AMINOCIDOS
EXPERIMENTALES
5.1. Albmina de suero bovino, BSA

La albmina de suero bovino es una protena que se encuentra en gran
proporcin en el plasma sanguneo, siendo la principal protena de la sangre y a
su vez la ms abundante en el ser humano. Es sintetizada en el hgado.
La concentracin normal en la sangre humana oscila entre 35 y 50 g/dL, y
supone un 5431% de la protena plasmtica. El resto de protenas presentes en
el plasma se llaman en conjunto globulinas.
La albmina es fundamental para el mantenimiento de la presin oncnica
(tambin osmtica es la presin hidrosttica a consecuencia del efecto osmtico
ejercido por las protenas dentro de un espacio especfico: matriz extracelular,
vasos sanguneo, delimitado por una membrana electivamente permeable),
necesaria para la distribucin correcta de los lquidos corporales entre el
compartimento intravascular y el extravascular, localizado entre los tejidos. La
albmina tiene carga elctrica negativa. La membrana basal del glomrulo renal
(es la unidad anatmica funcional del rin donde radica la funcin de aclarado o
filtracin del plasma sanguneo), tambin est cargada negativamente, lo que
impide la filtracin glomerular de la albmina a la orina. En el sndrome nefrtico
(trastorno renal que se caracteriza por la presencia de niveles altos de protena
en la orina, niveles bajos de protena en la sangre y en algunos casos, edema y
colesterol alto), esta propiedad es menor, y se pierde gran cantidad de albmina
por la orina.
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Cristina Ayuso Aixa
Debido a que pequeos animales como por ejemplo las ratas, viven con una baja
presin sangunea, necesitan una baja presin onctica, tambin necesitan una
baja cantidad de albmina para mantener la distribucin de fluidos.
Si efectuamos una electroforesis (tcnica para la separacin de molculas segn
la movilidad de estas en un campo elctrico) de las protenas del suero a un pH
fisiolgico, la protena albmina es la que ms avanza debido a su elevada
concentracin de cargas negativa (obviando la pequea banda llamada pre
albmina, que la precede).
5.1.1. Caractersticas
a) Posee un pK de 8.5
b) Tiene un pH de 8
c) Tiene un peso molecular de 69.000
d) Tiene un pI de 4,9
5.1.2. Funciones de la albmina

a) Mantenimiento de la presin oncnica.
b) Transporte de hormonas tiroideas.
c) Transporte de hormonas liposolubles.
d) Transporte de cidos grasos libres. (No esterificados)
e) Transporte de bilirrubina (pigmento biliar de color amarillo anaranjado que
resulta de la degradacin de la hemoglobina) no conjugada.
f) Transporte de muchos frmacos y drogas.
g) Unin competitiva con iones de calcio.
h) Control del pH.
i) Funciona como un transportador de la sangre y lo contiene el plasma
5.1.3. Causas de la deficiencia de la albmina

a) Cirrosis heptica (): Por disminucin en su sntesis heptica.
b) Desnutricin.
c) Sndrome nefrtico: Por aumento en su excrecin.
d) Trastornos intestinales: Prdida en la absorcin de aminocidos durante la
digestin y prdida por las diarreas.
e) Enfermedades genticas que provocan hipoalbuminemia, que son muy
raras.
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5.1.4. Tipos de albmina

a) Seroalbmina: Es la protena del suero sanguneo. Es la protena ms
importante del plasma de la sangre. Las concentraciones bajas de esta
sustancia se presentan en las personas que padecen de malnutricin,
inflamacin y enfermedades graves del hgado y el rin.
La albmina srica, o seroalbmina, se encarga de transportar sustancias
de naturaleza qumica muy diversa, como cidos grasos, aminocidos,
esteroides, metales (como el calcio), y numerosos frmacos, facilitando la
transferencia de muchas de ellas desde la circulacin sangunea a rganos
como el hgado, el rin, el intestino y el cerebro. Por este motivo existen
receptores de superficie para albmina en las clulas de estos rganos. Su
principal funcin es regular la presin coloidosmtica de la sangre, y
presenta una gran afinidad por pequeas molculas hidrofbicas cargadas
negativamente. La seroalbmina est formada por 585 aminocidos.
b) Ovoalbmina: Es la albmina presente en la clara del huevo.
c) Lactolbumina: Es la albmina presente en la leche.
5.2. Desoxiribonucleasa, DNAsa

La desoxiribonucleasa (DNAsa, para abreviar) es una enzima que cataliza la
hidrlisis de fosfodister vnculos en el ADN columna vertebral.
En bioqumica, se llaman enzimas a las sustancias de naturaleza proteica que
catalizan reacciones qumicas, siempre que sea termodinmicamente posible (si
bien no pueden hacer que el proceso sea ms termodinmicamente favorable).
En estas reacciones, las enzimas actan sobre unas molculas denominadas
sustratos, las cuales se convierten en diferentes molculas, los productos. Casi
todos los procesos en las clulas necesitan enzimas para que ocurran en tasas
significativas. A las reacciones mediadas por enzimas se las denomina reacciones
enzimticas.
La hidrlisis es una reaccin qumica durante el cual una o ms molculas de
agua se dividen en hidrgeno y en hidrxido de iones que pueden llegar a
participar en otras reacciones. Es el tipo de reaccin que se utiliza para romper
ciertos polmeros, especialmente los formulados por el paso del crecimiento de la
polimerizacin.
El ADN (cido Desoxiribonucleico) es un cido nucleico que contiene las
instrucciones genticas utilizadas en el desarrollo y el funcionamiento de todos
los organismos que viven y algunos virus. La funcin principal de las molculas
ADN es el almacenamiento a largo plazo de la informacin. ADN a menudo se
compara con un conjunto de planos o un cdigo, ya que contiene las
instrucciones necesarias para construir otros componentes de las clulas, como
las protenas y las molculas del ARN. Los segmentos de ADN que llevan esta
informacin gentica se llaman genes, pero otras secuencias de ADN tienen fines
estructurales o estn implicadas en la regulacin de la utilizacin de esta
informacin gentica.
Desoxiribonucleasas son, por lo tanto un tipo de nucleasa (enzima hidrolasa del
tipo esterasa que degradan en cidos nucleicos). Una amplia variedad de
desoxiribonucleasas se conocen, que difieren en su sustrato especfico, los
mecanismos qumicos, y las funciones biolgicas.
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Cristina Ayuso Aixa
5.2.1. Tipos de Desoxiribonucleasas

Los dos tipos principales de DNAsa se encuentran en metazoos (los animales son
un grupo importante de la mayora de multicelulares, organismos eucariotas del
Reino Animal o Metazoos) que se conoce como desoxiribunecleasa I y
desoxirribonucleasa II.
a) Desoxirribonucleica I (generalmente con el nombre DNAsa I), es una
enzima codificada por el gen humano DNAsa I. La DNasa I es una nucleasa
que hidroliza ADN preferentemente en fosfodister con vnculos
adyacentes a una pirimidina de nucletidos, dando fin a 5'-fosfato
polinucletidos con un grupo hidroxilo libre en la posicin 3 ', en promedio
la produccin de tetranucletidos. Acta en una sola cadena de ADN, la
doble cadena de ADN, y la cromatina. Se ha sugerido como uno de las
desoxiribonucleasas responsable de la fragmentacin del ADN durante la
apoptosis (es el proceso de muerte celular programada que puede ocurrir
en organismos multicelulares). DNAsa I se une al citoesqueleto de la
protena actina. Los monmeros de actina se unen con muy alta afinidad y
los polmeros de actina con menor afinidad. La funcin de esta interaccin
no est clara. Sin embargo, desde determinados actina DNAsa I se
inactiva enzimticamente, la DNAsa-actina complejo podra ser una forma
de almacenamiento DNAsa I que evita daos de la informacin gentica.
Este gen codifica un miembro de la familia DNAsa. Las mutaciones en este
gen se han asociado con lupus eritematoso sistmico (LES), una
enfermedad autoinmune. Una forma recombinante de esta protena se
utiliza para tratar uno de los sntomas de la fibrosis qustica por hidrlisis
extracelular de ADN en el esputo y la reduccin de su viscosidad. Variantes
de empalme alternativo transcripcional de este gen se han observado,
pero no se han caracterizado completamente.
b) Desoxiribonucleasa II, o cido DNasa, hidroliza desoxiribonucletidos
vinculados y productos desnaturalizados de ADN rendimiento con 3-
fosfato. Como su nombre lo indica, es ms eficaz a pH cido.
Hay varios DNAsas II conocidas, incluyendo:
DNAsa II alfa (por lo general, acabada de llamar DNAsa II)
DNAsa II beta (tambin llamado DLAD, o DNasa II-Como cido ADNasa)
5.2.2. Determinacin de desoxiribonucleasas

El ADN absorbe la luz ultravioleta con una longitud de onda de mxima absorcin
cerca de 260 nm. Esta absorcin se debe a los electrones en las bases
aromticas del ADN. En dsDNA, o incluso regiones de ARN doble anclado en la
estructura donde se produce, las bases se apilan paralelas entre s y la
superposicin de la base de orbitales moleculares conduce a una disminucin de
la absorbancia de luz ultravioleta. Este fenmeno se denomina efecto
hipercromico. Cuando se libera ADNasa, dsDNA de nucletidos, las bases ya no
son apiladas como en dsDNA, de manera que se reduce al mnimo la
superposicin orbital y UV absorbancia aumenta. Este aumento de la absorbancia
de la base en unidad de Kunitz ADNasa actividad. Kunitz es una unidad definida
como la cantidad de enzima que causa un aumento de la absorbancia a 260 nm
de 0,001 por ml, cuando acta sobre el ADN altamente polimerizada a 25 C y
Ph 50 en condiciones determinadas.
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5.3. Aminocidos aromticos

5.3.1. Fenilalanina
La fenilalanina es un aminocido aromtico neutro, al igual que la tirosina y el
triptfano. Es un aminocido no polar, siendo uno de los aminocidos ms
hidrfobos. Su smbolo es F en cdigo de una letra y Phe en cdigo de tres
letras. La fenilcetonuria es una enfermedad caracterizada por presentar altas
concentraciones de fenilalanina en sangre.
La fenilalanina debido a la presencia de estos anillos aromticos, se usa para
detectar protenas por absorcin de luz, al igual que la tirosina y el triptfano. La
fenilalanina se convierte en tirosina por la fenilalanina hidroxilasa, con
tetrahidrobiopterina como cofactor. Un dficit en esta enzima, una mutacin en
el sitio de unin del cofactor o un dficit de ste son los responsables de la
fenilcetonuria, una enfermedad hereditaria autosmica recesiva que se
manifiesta con retraso mental grave. El dficit en fenilalanina hidroxilasa se
traduce en una acumulacin de fenilalanina y una disminucin de tirosina en
sangre. La fenilalanina es sustrato de la tirosina hidroxilasa, primer paso de la
sntesis de catecolaminas (adrenalina, dopamina y noradrenalina). La fenilalanina
se usa cuando los niveles de tirosina son bajos, ya que este aminocido es el
sustrato preferente de dicha enzima. En la fenilcetonuria, debido a los bajos
niveles de tirosina, aun existiendo grandes cantidades de fenilalanina, la sntesis
de catecolaminas es baja. La fenilalanina es esencial en base a que no puede ser
sintetizado por nuestro organismo y debe ser aportado por la dieta. Su aporte es
importante para la produccin de tirosina. La fenilalanina forma parte de FMLP,
pptidos sintticos que estimulan la quimiotaxis, desgranulacin y formacin de
iones superxido de fagocitos, como neutrfilos. En la imagen los tomos de
hidrgeno estn en blanco, los de carbono en gris, los de nitrgeno en azul y los
de oxgeno en rojo. La fenilalanina es codificada por UUU o por UUC.
Figura 19. Molcula del aminocido de Fenilalanina.
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Cristina Ayuso Aixa
5.3.2. Triptfano
El triptfano es un aminocido aromtico neutro, al igual que la tirosina y la
fenilalanina. Su smbolo es W en cdigo de una letra y Trp en cdigo de tres
letras. Es un aminocido no polar. Es precursor del neurotransmisor serotonina,
de la melatonina y de la vitamina B3 o niacina.
El triptfano, al igual que la fenilalanina y la tirosina tambin se usa para
detectar protenas por absorcin de luz, al igual que la fenilalanina y la tirosina,
siendo el triptfano es el que ms absorbe. El triptfano se considera un
aminocido no polar, an pudiendo formar puentes de hidrgeno con el agua. El
triptfano es precursor de la serotonina, mediante una reaccin catalizada por la
triptfano hidroxilasa. La serotonina lleva a cabo funciones relacionadas con la
conducta, como regulacin del sueo, hambre, agresividad, afectividad, etc. y a
partir de ella se produce la melatonina. Por otra parte, la triptfano hidroxilasa al
igual que la serotonina se relaciona con la hipertensin pulmonar inducida por
hipoxia. El triptfano tambin es precursor de la vitamina B3 o niacina, cuyo
dficit produce la enfermedad conocida como pelagra, caracterizada por
dermatitis, diarrrea y demencia (las 3 D).
El triptfano es un aminocido esencial ya que no puede ser sintetizado por
nuestro organismo y debe ser aportado por la dieta. Este aporte es muy
importante al ser precursor de los compuestos mencionados. En las bacterias el
triptfano se sintetiza a partir de un opern regulado por el propio nivel de
triptfano. En la imagen los tomos de hidrgeno estn en blanco, los de
carbono en gris, los de nitrgeno en azul y los de oxgeno en rojo. El triptfano,
junto a la metiotina, son los nicos aminocidos sintetizados por un solo codn.
En el caso del triptfano es: UGG.
Figura 20. Molcula del aminocido de Triptfano.
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5.3.3. Tirosina
La tirosina es un aminocido aromtico neutro, al igual que el triptfano y la
fenilalanina, aunque tiene un OH que le confiere cierta polaridad y a pH elevado
se ioniza. Su smbolo es Y en cdigo de una letra y Tyr en cdigo de tres letras.
Es precursor de ciertos neurotransmisores, de las hormonas tiroideas y de las
melaninas. Dentro de las clulas, su fosforilacin es clave en muchos procesos de
sealizacin.
A diferencia de los anteriores tiene un OH lo que le confiere cierta polaridad. La
tirosina sufre fosforilacin en su grupo OH por numerosas tirosin quinasas,
implicadas en transduccin de seales y en la regulacin de la actividad
enzimtica, ya que la fosforilacin de residuos de tirosina activa o inhibe
enzimas, y receptores. En muchos caso a travs de secuencias ITAM o ITIM
(Inmunoreceptores basados en motivos de activacin o inhibicin,
respectivamente, ricos en tirosina). Tambin puede sufrir sulfatacin, relacionada
con interacciones fuertes protena-protena. Estas dos formas modificadas de la
tirosina pueden ser detectadas especficamente por anticuerpos. Las quinasas de
tirosina son actualmente una diana para el tratamiento frente al cncer. Se
estudian nuevos frmacos en el cncer de pulmn de clulas no pequeas
(NSCLC) en el cncer tiroideo anaplsico o en algunos tipos de cncer gstrico.
La tirosina es un precursor de los neurotransmisores catecolaminas: dopamina,
norepinefrina o noradrenalina y epinefrina o adrenalina, tan importantes en el
sistema nervioso central, sistema nervioso autonmo simptico y mdula
suprarrenal. Tambin es precursor de las hormonas tiroideas tiroxina (T4) y
triyodotironina (T3) sintetizadas en la glndula tiroides. En la imagen los tomos
de hidrgeno estn en blanco, los de carbono en gris, los de nitrgeno en azul y
los de oxgeno en rojo. La tirosina es sintetizada por uno de estos dos codones:
UAU, UAC.
Figura 21. Molcula del aminocido de Tirosina.
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CAPTULO 6:
TCNICAS UTILIZADAS
6.1. Espectrofotometra
La mayora de los problemas analticos reales comienzan con una compleja
mezcla a partir de la cual es necesario aislar, identificar y cuantificar uno o ms
componentes de la misma.
Se pueden plantear las siguientes cuestiones: una, de carcter cualitativo (de
qu componente se trata?), y otra de carcter cuantitativo (cunto hay de ese
componente?).
Para ello, se puede utilizar el mtodo instrumental de anlisis, como es la
espectrofotometra para medir la absorcin de radiacin ultravioleta y visible que
interacta con la materia (tomos y molculas), la misma, se considera una
tcnica cualitativa y cuantitativa basndose en la medicin del color o de la
longitud de onda de una radiacin e intensidad de la misma.
6.1.1. El espectro electromagntico

Desde Newton, sabemos que la luz blanca se descompone en los colores que la
integran si la hacemos pasar a travs de un prisma. Es el efecto que se repite,
por ejemplo en el arco iris, el cual se dice que es el espectro de la luz visible
procedente del sol, son las gotas de lluvia y el aire atmosfrico lo que hacen de
espectroscopio. La principal emisin de radiacin de los cuerpos es la radiacin
electromagntica en forma de luz visible, de la misma manera cada elemento
qumico absorbe y emite luz de colores que componen su espectro.
La longitud de onda de la radiacin puede ser desde muy pequea, en el caso de
la radiacin gamma, y hasta muy grande en caso de las ondas radio. Se mide,
usando desde nanmetros y Angstroms hasta cientos de metros. Recordemos
que un nanmetro es la milmillonsima parte de un metro (1 m = 109 nm) y que
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Cristina Ayuso Aixa
un Angstrom es la diez mil millonsima parte de un metro (1 m = 1010 A), por lo

que un nanmetro equivale a 10 Angstroms (1nm = 10 A).
La luz que recibimos del Sol es radiacin electromagntica que se desplaza a
300.000 km/s en su totalidad, pero la longitud de onda no es la misma en todos
los fotones luminosos, sino que vara entre los 4000 A y los 7000 A,
aproximadamente, o lo que es lo mismo, entre los = 400 nm y los = 700 nm.
La luz blanca se descompone, en un espectro de diferentes bandas coloreadas,
cada una definida por una longitud de onda distinta. As, la luz de menor longitud
de onda es la luz violeta, que es de alrededor de unos 4000 Angstroms, y la luz
de mayor longitud de onda es la luz roja, que es de alrededor de unos 7000
Angstroms.
Sin embargo, hay radiaciones de mayor y tambin de menor longitud de onda,
es decir, que tienen una longitud de onda inferior a 4000 Angstroms y que tienen
una longitud de onda superior a los 7000 Angstroms.
Las radiaciones que van desde el violeta al rojo se dice que forman el espectro
visible, pues proceden de la descomposicin de la luz blanca.
Las radiaciones de longitud de onda inferior al violeta se llaman radiaciones
ultravioletas, rayos X y rayos gamma, por orden decreciente en la longitud de
onda.
Las radiaciones de longitud de onda superior al rojo son las denominadas
infrarrojas, microondas y ondas de radio, por orden creciente de longitud de
onda.
Figura 22. Representacin de mayor a menor longitud de onda del

espectro de la radiacin
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Tabla 2. Colores de la luz visible.
Longitud de onda de Color absorbido Color observado

absorcin mxima (nm)
380-420 Violeta Amarillo verdoso
420-440 Azul-Violeta Amarillo
440-470 Azul Naranja
470-500 Verde-Azul Rojo
500-520 Verde Prpura
520-550 Verde-Amarillento Violeta
550-580 Amarillo Azul-Violeta
580-620 Naranja Azul
6.1.2. La radiacin electromagntica y su interaccin con la materia

Los modelos explicativos de la estructura de la materia que tienen como
fundamento las caractersticas ondulatorias de las partculas que la constituyen
proporcionan un marco de referencia conveniente para describir las interacciones
entre la radiacin electromagntica y la materia. Estas interacciones a su vez son
el fundamento de las aplicaciones espectroscpicas.
La energa radiante se encuentra constituida por fotones cada uno de los cuales
tiene como caracterstica una longitud de onda. Toda la radiacin
electromagntica se mueve a la misma velocidad en el vaco y esa velocidad de
desplazamiento en el vaco es la mxima observada en el universo. En algn
medio material, la interaccin entre los campos elctricos y magnticos que
existen en la materia y los correspondientes de la radiacin pueden llegara a
reducir esa velocidad de propagacin; por esta razn es solamente en el vaco en
donde se observa esa velocidad mxima
Si se asigna una longitud de onda caracterstica a cada tipo de radiacin, la
propagacin de esa onda se har con una frecuencia tal que al multiplicarla por
su longitud debe dar la velocidad de propagacin.
=c/ (5)
=c/ (6)
Donde:
Lambda (): longitud de onda.
Nu (): frecuencia de esa onda.
C: velocidad de la luz en el vaco, su valor es: 2,99792458108 ms-1.
- 61 -
Cristina Ayuso Aixa
La radiacin electromagntica que constituyen las ondas de radio de banda AM,

de la frecuencia 1000 kHz tiene una longitud de 2,99792458108 ms-1/1,0106
s-1 = 299,8 m. Esta onda se convierte en seal, la cual se interpreta mediante el
uso de un circuito apropiado que se encuentra en el aparato receptor de radio.
Ondas ms cortas que la referida anteriormente son las que se interpretan con
los ojos, sin ayuda de ningn traductor construido artificialmente. La radiacin
electromagntica que se percibe como color rojo tiene una longitud del orden de
los 700 nm, por lo tanto su frecuencia es 2,99792458108 ms-1/7,010-7 m =
4,281014 s-1. Es decir 428 THz (terahercios).
La energa asociada a cada una de estas ondas, se obtiene mediante la ecuacin
de Planck:
E = h / (7)
Para las dos ondas descritas anteriormente las energas respectivas sern:
EAM = 6,626075510-34 Js1,0106 s-1 = 6,62610-28 J
Eroja = 6,626075510-34 Js4,281014 s-1 = 2,83610-19 J
6.1.3. Absorcin y emisin de radiacin por parte de la materia.

Una descripcin simplificada de la estructura de la materia permite explicar los
enlaces entre los tomos para formar molculas en trminos de localizacin de
ciertas partculas subatmicas, como los electrones, entre esos tomos. Esas
partculas evidencian sus caractersticas ondulatorias ya que interactan con la
radiacin electromagntica. La molcula en su forma estable bajo las condiciones
ambientales se encuentra en un determinado nivel energtico. Si se logra hacer
incidir sobre esa molcula un fotn de radiacin electromagntica con la energa
apropiada, la molcula aumenta su contenido energtico absorbiendo ese fotn.
Se dice entonces que la molcula ha pasado a un estado excitado.
La molcula excitada se encuentra en un estado que no es estable en las
condiciones ambientales corrientes, por lo tanto tiende a volver a la condicin
estable, y para conseguirlo emite un fotn con la misma energa que se excit
anteriormente. Por lo tanto cuando un elemento irradia energa no lo hace en
todas las longitudes de onda, solamente en aquellas de las que est provisto.
Esas longitudes de onda sirven para caracterizar a cada elemento. Tambin
ocurre que cuando un elemento recibe energa no absorbe todas las longitudes
de onda, sino solo aquellas de las que es capaz de proveerse. Coinciden por
tanto, las bandas del espectro en las que emite radiacin con los huecos o lneas
negras del espectro de absorcin de la radiacin, como si un espectro fuera el
negativo del otro.
6.1.4. Ley de Bouguer - Lambert - Beer

1. Ley de Bouguer
La ley de Bouguer surge para describir de forma correcta, sin excepcin, la

absorcin de la radiacin monocromtica por varios espesores de un medio ho-
- 62 -
mogneo. La energa de la radiacin transmitida disminuye en forma exponencial

al aumentar en forma aritmtica el espesor del medio absorbente.
El descubrimiento de Bouguer se puede formular en forma matemtica como
sigue:
dI
- = 1I (8)
db
El signo negativo indica que la energa disminuye con la absorcin. Podemos
expresar esta ecuacin con los siguientes clculos: la disminucin de la energa
radiante por unidad de espesor del medio absorbente es proporcional a la
energa radiante:
I1 l
dI
- = 1 dl (9)
I0
I 0
- (ln I1 ln I 0 ) = 1l (10)
ln I 0 ln I1 = 1l (11)
I0
ln = 1l (12)
I1
Y resolviendo la integral entre los lmites I0/I y 0/l:
I0
log = 2 l (13)
I1
Donde:
I1 = intensidad de luz transmitida.
I0 = intensidad de luz incidente.
= coeficiente de extincin en unidades de M-3 cm-1.
se refiere a las sustancias en general, sin estar en disolucin.
2. Ley de Lambert
Cuando un rayo de luz monocromtica pasa a travs de un medio absorbente, su

intensidad disminuye exponencialmente a medida que la longitud del medio
absorbente aumenta.
I1 = I 0 10 l (14)
- 63 -
Cristina Ayuso Aixa
I0
log = l (15)
I1
3. Ley de Beer
Cuando un rayo de luz monocromtica pasa a travs de un medio absorbente, su

intensidad disminuye exponencialmente a medida que aumenta la concentracin
de la sustancia absorbente en el medio.
I1 = I 0 10 c (16)
I0
log = c (17)
I1
Donde C = concentracin de la sustancia absorbente

La combinacin de las leyes de Bouguer, Lambert y de Beer, y a travs de sus
observaciones establecieron relaciones de la variacin de la intensidad de luz
transmitida por una muestra con el espesor de ella o con la concentracin de la
sustancia, para materiales translcidos. Estas relaciones se conocen como la ley
de Bouguer Lambert - Beer o ley general de la espectrofotometra que permite
hallar la concentracin de una especie qumica a partir de la medida de la
intensidad de luz absorbida por la muestra.
Esta ley se puede expresar en trminos de potencia de luz o de intensidad de
luz, asumiendo luz monocromtica, como:
I1 = I 0 10 cl (18)
Donde:
l, es la longitud de la trayectoria del haz de luz a travs de la muestra o el
espesor de la celda en cm.
Figura 23. Representacin de la absorcin de un haz de luz

atravesando una cubeta de tamao l.
- 64 -
La relacin I1 / I0 se conoce como transmitancia, T, y es la medida primaria que

se realiza en los instrumentos para medir la absorcin de luz por parte de una
muestra. Si la relacin se expresa en forma porcentual, entonces se llama
porcentaje de transmitancia:
I1
%T = 100 (19)
I0
La luz absorbida sera I0 I1, es decir, la diferencia entre la intensidad de la luz

incidente y la intensidad transmitida despus de pasar a travs de la muestra. A
veces se expresa en forma porcentual, en funcin de la transmitancia medida
como:
Porcentaje de absorcin = (Tblanco Tmuestra) 100 o absorbancia.
Cuando se toma el logaritmo decimal negativo de la relacin It / I0, entonces:
I1
log = log T (20)
I0
O podemos tomar tambin la ecuacin
I0
log = log I 0 log I1 (21)
I1
La relacin que representa la cantidad de luz absorbida por la muestra es

-log I1 / I0 = - log T, y recibe el nombre de Absorbancia, y se designa con la letra
A.
La ley de Bouguer Lambert - Beer se puede entonces escribir de las siguientes
formas:
I0
= 10 lc (22)
I1
log T = lc (23)
log T = A = lc (24)
El coeficiente de absortividad molar , es funcin de la longitud de onda, del

ndice de refraccin de la solucin y es caracterstico de cada sistema soluto-
solvente. Es una propiedad intensiva, que no depende de la concentracin de la
sustancia y representa la absorcin de luz por parte de un mol de soluto para
una longitud de onda dada.
Si no se conoce el peso molecular de la sustancia se puede expresar como:
A = lc (25)
El registro de la variacin del coeficiente de absortividad molar , o de la

absorbancia A, o de la transmitancia T, en funcin de la longitud de onda da
- 65 -
Cristina Ayuso Aixa
origen a lo que se denomina "espectro" o curva espectral de una sustancia

qumica e indica las caractersticas de absorcin de dicha sustancia con relacin a
la longitud de onda. En muchas ocasiones la curva espectral se presenta como
absorbancia vs longitud de onda y el espectro se denomina espectro de
absorcin, o en funcin de la transmitancia, denominndose el espectro, espectro
de transmisin.
De igual forma cuando se registra la emisin de radiacin en funcin de la
longitud de onda, los espectros se denominan como espectros de emisin, o
espectros de fluorescencia.
6.1.5. Aplicacin de espectrofotometra

La espectrofotometra es un mtodo analtico que utiliza los efectos de la
interaccin de las radiaciones electromagnticas con la materia (tomos y
molculas) para medir la absorcin o la transmisin de luz por las sustancias.
Tambin se refiere a los mtodos cuantitativos de anlisis qumico que utilizan la
luz para medir la concentracin de las sustancias qumicas. Se conocen como
mtodos espectrofotomtricos, y segn sea la radiacin utilizada, como
espectrofotometra de absorcin visible (colorimetra), ultravioleta e infrarroja.
Es una de las tcnicas experimentales ms utilizadas para la deteccin especfica
de molculas. Se caracteriza por su precisin, sensibilidad y su aplicabilidad a
molculas de distinta naturaleza (contaminantes, biomolculas, etc) y estado de
agregacin (slido, lquido, gas). Los fundamentos fsico-qumicos de la
espectrofotometra son relativamente sencillos.
Las molculas pueden absorber energa luminosa y almacenarla en forma de
energa interna. Esto permite que se inicien ciclos vitales de muchos
organismos, entre ellos el de la fotosntesis en plantas y bacterias. La Mecnica
Cuntica nos dice que la luz est compuesta de fotones cada uno de los cules
tiene una energa:
H c
E fotn = h = (26)

donde c, como ya se ha expresado anteriormente, es la velocidad de la luz, es
su frecuencia, su longitud de onda y h la constante de Planck. Cuando decimos
que una sustancia qumica absorbe luz de longitud de onda , esto significa que
las molculas de esa sustancia absorben fotones de esa longitud de onda.
Cuando una molcula absorbe un fotn en este intervalo espectral, se excita
pasando un electrn de un orbital del estado fundamental a un orbital excitado
de energa superior. De esta manera la molcula almacena la energa del fotn:
A + h A* (27)
E ( A* ) = E ( A) + E fotn (28)
- 66 -
Como la energa se conserva, la diferencia de energa entre el estado

fundamental de la molcula (A) y su estado excitado (A*) debe ser exactamente
igual a la energa del fotn. Es decir, una molcula slo puede absorber fotones
cuya energa h sea igual a la energa de un estado molecular excitado. Cada
molcula tiene una serie de estados excitados discretos (o bandas) que
dependen de su estructura electrnica y que la distinguen del resto de
molculas. Como consecuencia, el espectro de absorcin, es decir, la luz
absorbida en funcin de la longitud de onda, constituye una verdadera sea de
identidad de cada sustancia o molcula.
Cuando dos o ms sustancias aparecen mezcladas en una misma muestra sus
espectros de absorcin aparecen superpuestos tal como se representa en la
siguiente figura:
Figura 24. Espectros de absorcin de dos sustancias mezcladas con

distinta absorcin.
6.1.6. Espectrofotmetro
Los espectros de absorcin se miden mediante un instrumento denominado
espectrofotmetro. Los instrumentos constan de una fuente de luz blanca
caracterizada por un espectro de emisin continuo en un intervalo amplio de
longitudes de onda y de un monocromador (Prisma) que acta como filtro ptico
transmitiendo un haz de luz de longitud de onda fija e intensidad. Este haz de luz
penetra en la cubeta de anlisis donde se encuentra la muestra. Un detector
sensible a la luz mide la intensidad de luz en el haz de salida.
Figura 25. Esquema representativo del funcionamiento del

espectrofotmetro.
- 67 -
Cristina Ayuso Aixa
La intensidad del haz de luz se va atenuando a medida que atraviesa la cubeta

debido a la absorcin de las molculas de la muestra. El ritmo de absorcin
depende de la intensidad inicial de luz y de la concentracin de molculas. De
esta manera, cuando un haz de luz de intensidad I recorre una distancia dL en
una muestra con una concentracin de molculas [B], se produce una atenuacin
de intensidad dI dada por:
dI = cI dl (29)
La constante k se denomina coeficiente de absortividad molar.

La expresin anterior se puede integrar de la siguiente forma:
dI
= cl (30)
I
I1 l
dI
I I = c0 dl (31)
0
I1
ln = cl (32)
I0
Lo cual da lugar a la ley de Bouguer Lambert Beer:
I0
A = ln = cl (33)
I1
6.1.7. Partes del espectrofotmetro

El espectrofotmetro, bsicamente consta de los siguientes componentes:
1. Fuente de luz: Lmpara que emite una mezcla de longitudes de onda.
2. Colimador (Rendija): Conjunto de lentes que enfocan la luz convirtindola en

un haz de rayos paralelos.
3. Monocromador: Dispositivo que selecciona luz de una nica longitud de onda.
4. Detector fotoelctrico: Transductor de luz en electricidad. La luz provoca el

desplazamiento de electrones en el metal del detector, produciendo una
corriente elctrica que es proporcional a la intensidad de la luz recibida.
5. Registrador (programa): Mide la seal del detector, la compara y genera una

medida en una escala determinada.
- 68 -
Figura 26. Esquema de las partes de un espectrofotmetro.
Figura 27. Espectrofotmetro UV-Visible utilizado en el mtodo

experimental.
6.1.8. Aplicaciones de la espectrofotometra visible y ultravioleta

La espectrofotometra es de gran utilidad en el anlisis de espacies qumicas
sobre todo para el qumico analtico.
En bioqumica se utiliza por ejemplo para:
1. Identificar compuestos por su espectro de absorcin.
2. Conocer la concentracin de un compuesto en una disolucin.
3. Determinar la glucosa en sangre en un laboratorio de anlisis qumico.
4. Seguir el curso de reacciones qumicas y enzimticas.
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Cristina Ayuso Aixa
6.2. La derivada
La derivada de una funcin en un punto es el valor de la pendiente de la recta
tangente en dicho punto. La pendiente est dada por la tangente del ngulo que
forma la recta tangente a la curva (funcin) con el eje de las abscisas, en ese
punto.
Figura 28. Recta tangente a la parbola x2.
La derivada de una funcin mide el coeficiente de variacin de dicha funcin. Es

decir, provee una formulacin matemtica de la nocin del coeficiente de cambio.
El coeficiente de cambio indica lo rpido que crece (o decrece) una funcin en un
punto (razn de cambio promedio) respecto del eje X de un plano cartesiano de
dos dimensiones. Por ejemplo si tomamos la velocidad de algo, su coeficiente es
la aceleracin, la cual mide cunto cambia la velocidad en un tiempo dado.
El concepto de derivada es uno de los dos conceptos centrales del clculo
infinitesimal. El otro concepto contrario es la "anti derivada" o integral; ambos
estn relacionados por el teorema fundamental del clculo. A su vez, los dos
conceptos centrales del clculo estn basados en el concepto de lmite, el cual
separa las matemticas previas, como el lgebra, la trigonometra o la geometra
analtica del clculo. Quiz la derivada es el concepto ms importante del clculo
infinitesimal.
La derivada es un concepto que tiene muchas aplicaciones. Se aplica en aquellos
casos donde es necesario medir la rapidez con que se produce el cambio de una
magnitud o situacin. Es una herramienta de clculo fundamental en los estudios
de Fsica, Qumica y Biologa, o en ciencias sociales como la Economa y la
Sociologa. Por ejemplo, cuando se refiere a la grfica de dos dimensiones de f,
se considera la derivada como la pendiente de la recta tangente del grfico en el
punto x. Se puede aproximar la pendiente de esta tangente como el lmite
cuando la distancia entre los dos puntos que determinan una recta secante
tiende a cero, es decir, se transforma la recta secante en una recta tangente.
Con esta interpretacin, pueden determinarse muchas propiedades geomtricas
de los grficos de funciones, tales como concavidad o convexidad.
Algunas funciones no tienen derivada en todos o en alguno de sus puntos. Por
ejemplo, una funcin no tiene derivada en los puntos en que se tiene una
tangente vertical, una discontinuidad o un punto anguloso. Afortunadamente,
- 70 -
gran cantidad de las funciones que se consideran en las aplicaciones son

continuas y su grfica es una curva suave, por lo que es susceptible de
derivacin.
Las funciones que son diferenciables (derivables si se habla en una sola
variable), son aproximables linealmente.
Es importante entender qu es una funcin matemtica para hablar de
derivadas. Una ecuacin que relaciona dos variables x e y puede entenderse
como una funcin, siempre y cuando a cada valor de x le corresponda uno y
solamente un valor de y.
La correspondencia entre estas dos variables se puede abstraer mediante parejas
(x,y), donde y es el valor numrico que resulta de evaluar la ecuacin usando
algn nmero x. Tales parejas se pueden interpretar como puntos geomtricos
en un plano cartesiano de manera que, al graficar muchos puntos, se obtiene un
dibujo que representa la funcin.
Por ejemplo, dada la funcin
x
y= (34)
x2 +1
Las parejas se obtienen dando valores arbitrarios a x y calculando y, como se

muestra en la siguiente tabla:
Tabla 3. Clculo de los valores x e y de la funcin.
x y
-5 -0,192
-4 -0,235
-3 -0,3
-2 -0,4
-1 -0,5
0 0,0
1 0,5
2 0,4
3 0,3
4 0,235
5 0,192
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Cristina Ayuso Aixa
Figura 29. Representacin grfica de la funcin y.
En esta tabla se obtienen valores para puntos (x,y) que pueden ser graficados en
un plano cartesiano con ejes x e y. En lenguaje matemtico las funciones se
denotan sustituyendo la variable y por f(x) e indicando as que f(x) es una
funcin de x. Es decir, indica que la variable ser, en este caso, x. La funcin
anterior tendra el aspecto siguiente:
x
f ( x) = (35)
x +1
2
Y del mismo modo, los puntos tendran el aspecto (x,f(x)).

Se suele imaginar la derivada en un punto x para la funcin f(x) como la
pendiente (inclinacin) que existe en el punto (x,f(x)). En la grfica de una
funcin, la pendiente representa la rapidez con que cambia dicha funcin: si la
pendiente es muy grande, entonces la funcin en este punto crece muy deprisa;
si la pendiente es muy pequea, entonces la funcin crece muy despacio en ese
punto. En trminos geomtricos, est pendiente es "la inclinacin" de una lnea
recta que toca el punto en el que se evala la derivada de la funcin. Esta
inclinacin (un valor numrico) depende de la forma que tiene la funcin en esa
zona del grfico que la representa en el plano cartesiano.
Derivar una funcin no es en absoluto complicado si se sabe utilizar las reglas de
derivacin descubiertas por Gottfried Leibniz e Isaac Newton. Dichas reglas son
fruto de un concienzudo esfuerzo puramente lgico. Se puede comparar el
proceso que lleva a una regla de derivacin al proceso utilizado para obtener la
famosa solucin que resuelve las ecuaciones de segundo grado de forma
automtica, y que est descrito en la mayora de libros de texto. Se requiere un
poco de prctica para aplicar correctamente la reglas de derivacin sin caer en
errores elementales.
Utilizando las reglas de derivacin sobre una funcin, se obtiene otra funcin
llamada derivada, o bien primera derivada. Si se denota por f(x) a una funcin y
g(x) a la funcin que resulta de derivar f(x), entonces g(a) representa la
pendiente que existe en el punto geomtrico (a,f(a)). La funcin g(x) representa
la pendiente que posee la recta tangente a cualquier punto de la funcin, siendo
stos de la forma (x,f(x).
- 72 -
6.2.1. Definicin de derivada como un lmite

En terminologa clsica, diferenciacin manifiesta el coeficiente en que una
cantidad "y" cambia a consecuencia de un cambio en otra cantidad "x".
En matemticas coeficiente es un factor multiplicativo que pertenece a cierto
objeto como una variable, un vector unitario, una funcin base, etc.
En fsica coeficiente es una expresin numrica que mediante alguna frmula
determina las caractersticas o propiedades de un cuerpo.
Figura 30. Representacin en la que muestra los incrementos de la

funcin en x y en y.
En nuestro caso, observando la grfica anterior, el coeficiente del que hablamos

vendra representado en el punto 'P' de la funcin por el resultado de la divisin
representada por la relacin (dx / dy), que como puede comprobarse en la
grfica, es un valor que se mantiene constante a lo largo de la lnea recta azul
que representa la tangente en el punto 'P' de la funcin. Esto es fcil de entender
puesto que el triangulo rectngulo formado en la grafica con vrtice en el punto
'P', por mucho que lo dibujemos mas grande, al ser una figura proporcional el
resultado de (dx /dy) es siempre el mismo.
Esta definicin, que es laboriosa de calcular algebraicamente por la regla de los
cuatro pasos, constituye la aproximacin ms veloz a la derivada, puesto que el
acercamiento a la pendiente de la recta tangente es tanto por la derecha como
por la izquierda de manera simultnea.
Tambin puede definirse alternativamente la derivada de una funcin en
cualquier punto de su dominio de la siguiente manera:
f ( x) f ( h)
f ' ( x) = lim h x (36)
xh
La cual representa un acercamiento de la pendiente de la secante a la de la
tangente ya sea por la derecha o por la izquierda segn el signo de h, en la cual
es posible cancelar siempre el factor " x - h " en lugar de solo h. El aspecto de
este lmite est relacionado ms con la velocidad instantnea del movimiento
uniformemente acelerado que con la pendiente de la recta tangente a una curva.
- 73 -
Cristina Ayuso Aixa
No obstante su aparente diferencia, el clculo de la derivada por definicin con

cualquiera de los lmites anteriormente expresados, proporciona siempre el
mismo resultado. El estudiante debe utilizar el que le resulte ms conveniente.
En particular, se tiene que la derivada de la funcin en el punto x = a (varios
autores prefieren utilizar la notacin "xo" en lugar de a) se define como sigue:
f ( a + h) f ( a ) f ( x ) f (a )
f ' (a) = lim h0 = lim xa (37)
h xa
Si este lmite existe, de lo contrario, f '(a) no est definida. Esta ltima expresin
coincide con la velocidad instantnea del movimiento continuo uniforme
acelerado en cinemtica.
Aunque podran calcularse todas las derivadas empleando la definicin de
derivada como un lmite, para lo cual se tendra que ser muy hbil en el clculo
de lmites indeterminados de la forma 0 sobre 0 (lo cual sera muy laborioso),
existen reglas bien establecidas, conocidas como teoremas para el clculo de
derivadas, las cuales permiten calcular la derivada de una funcin de acuerdo a
su forma sin tener que calcular forzosamente el lmite y hacer los cuatro pasos
cada vez. Tales reglas se deducen sucesivamente de la definicin de derivada y
de reglas previas, como puede apreciarse en todo buen texto de clculo
infinitesimal.
El conocimiento de todas las expresiones anteriores y su significado representan
el acercamiento epistmico ms completo posible en torno a la definicin de
derivada, y con ello, al aspecto esencial del clculo diferencial.
6.2.2. Segunda derivada

La segunda derivada es un teorema o mtodo de clculo matemtico en el que
se utiliza para efectuar una prueba simple correspondiente a los mximos y
mnimos relativos.
Dada una funcin f: I R derivable, se dice que es convexa si las rectas
tangentes en cada punto quedan por debajo de la grfica de f. Si en cambio las
rectas tangentes quedan por encima de la grfica, se dice que f cncava.
Figura 31. Representacin de la segunda derivada.
- 74 -
Sea a perteneciente a I, se dice que a es un punto de inflexin de f, si f pasa de

cncava a convexa en a o viceversa. Un punto de inflexin se caracteriza
tambin porque la recta tangente a la curva que pasa por l atraviesa la grfica.
1. Si f (x) > 0 para todo I, entonces f es convexa.
2. Si f (x) < 0 para todo I, entonces f es cncava.
3. Si f (a) = 0 y la derivada segunda es positiva a la izquierda de a y negativa

a la derecha (o viceversa), entonces a es un punto de inflexin de f.
A partir de las proposiciones anteriores, se puede establecer el siguiente criterio

para el estudio de extremos relativos:
1. Si f (a) = 0 y f (a) < 0, entonces f tiene un mximo relativo en a.
2. Si f (a) = 0 y f (a) > 0, entonces f tiene un mnimo relativo en a.
6.2.3. Espectroscopia derivada en los espectros de absorcin:

En la espectrofotometra derivada, los espectros se obtienen representando
grficamente la primera derivada o una derivada de orden mayor, de la
absorbancia o de la transmitancia, con respecto a la longitud de onda. A menudo
estas representaciones grficas revelan detalles espectrales que se pierden en un
espectro ordinario.
A veces se pueden realizar las medidas de concentracin de un analito
determinado en presencia de un interferente con ms facilidad y exactitud.
En muchas zonas de las regiones ultravioleta y visible la relacin seal/ruido no
es un factor limitante serio, es en estas regiones donde ms se utilizan los
espectros derivados. Como desventaja hay que sealar que una reduccin en la
relacin seal/ruido acompaa a la obtencin de las derivadas.
Muchas de las aplicaciones ms importantes de la espectroscopia derivada en las
regiones ultravioleta y visible son las identificaciones cualitativas de especies, en
las cuales la observacin en detalle de un espectro derivado hace posible
distinguir entre compuestos que tienen espectros solapados.
La espectrofotometra de longitud de onda dual ha demostrado ser
particularmente til para la obtencin de espectros de absorcin
ultravioleta/visible de especies presentes en disoluciones turbias, donde la
dispersin de la luz elimina los detalles en el espectro de absorcin.
Por ejemplo, tres aminocidos, el triptfano, la tirosina y la fenilalanina
contienen cadenas aromticas secundarias, que presentan picos de absorcin
agudos en la zona de 240 a 300 nm.
Estos picos agudos no estn claros en los espectros de las preparaciones de
protenas tpicas, tales como la albmina bovina o de huevo, ya que las
molculas grandes dispersan fuertemente la radiacin, dando lugar slo a un
pico de absorcin suave tal como el que aparece en la figura 32. La estructura
fina aromtica se descubre en los espectros de primera y segunda derivada,
como muestran las curvas de la figura 32.
- 75 -
Cristina Ayuso Aixa
Figura 32. Representaciones del espectro de absorcin y primera y

segunda derivada.
Es relativamente fcil caracterizar protenas cuando la absorcin de cromforos

est presente en la regin visible. Sin embargo, es ms difcil obtener la
informacin estructural de absorcin de las protenas en la regin ultravioleta, es
aqu donde muchas transiciones individuales electrnicas que se superponen en
su estructura, son encontradas. No slo los tres aminocidos aromticos
(fenilalanina, tirosina y triptfano), sino tambin cisteina, histidina y los
componentes ultravioletas visibles de cromforos visibles, como el grupo hemo,
contribuyen a la absorbancia ultravioleta de protenas que causan espectros sin
estructura. No obstante, una mejor resolucin puede ser alcanzada, mediante el
clculo de la segunda o la cuarta derivada en los espectros. La segunda derivada
de espectroscopia es el mtodo ms extensamente usado, en particular para la
deteccin de cambios estructurales. La cuarta derivada de espectroscopia tiene la
ventaja que un mximo en el espectro original corresponde a un mximo en la
derivada del espectro. Adems, las cuartas derivadas son ms selectivas para
cintas estrechas que las segundas derivadas, y ellos permiten un estudio ms
detallado del ambiente de los tres aminocidos aromticos.
Un cambio de una protena, un cambio de conformacin, una variacin de
hidratacin, una disociacin, o una desnaturalizacin, pueden causar un cambio
de ambiente de uno o varios de estos aminocidos. Sin embargo, el espectro
ultravioleta visible de una protena es amplio y sin rasgos distintivos: los cambios
interesantes son enmascarados por las contribuciones de todos los otros
aminocidos aromticos cuyo ambiente no ha cambiado.
- 76 -
6.2.4. Segunda derivada de espectroscopia

La segunda derivada de espectroscopia es el medio para extraer informacin del
espectro original. En contraste con los espectros relativamente sin rasgos
distintivos, las segundas derivadas se caracterizan por afilados picos y valles. La
Figura 33 muestra el espectro ultravioleta de una levadura, la Figura 34 muestra
la segunda derivada del espectro de la Figura 33.
Figura 33. Espectro de una levadura.
En la segunda derivada del espectro de la protena, la relacin entre la intensidad

mxima, a travs de los valores, y las posiciones de los picos y valles estn en
funcin de las cantidades relativas de los aminocidos y la polaridad de los
mismos en los entornos de las tirosinas y los triptfanos.
Figura 34. Segunda derivada del espectro de la levadura
Extrayendo el significado fsico de los cambios de la segunda derivada de los

espectros, se sabe la composicin de aminocidos de la protena y la utilizacin
de los espectros constituyentes en los espectros observados.
- 77 -
Cristina Ayuso Aixa
6.2.5. Cuarta derivada de espectroscopia

La selectiva mejora de la resolucin en las derivadas de espectroscopia es
llevada an ms lejos en la cuarta derivada. De un punto de vista metodolgico,
las derivadas, por lo general, son calculadas cambiando un espectro de una
longitud de onda determinada y la posterior substraccin del espectro original.
Por lo tanto permite estudiar con criterio selectivo ciertas transiciones
electrnicas, segn sus anchuras de cinta espectrales. Como en el caso de la
segunda derivada de espectroscopia, la amplitud y la posicin de las cintas
espectrales derivadas de los aminocidos aromticos son relacionadas con la
polaridad del medio.
- 78 -
CAPTULO 7: SOFTWARE E
INSTRUMENTACIN
7.1. RasMol
RasMol es un programa de grficos moleculares para la visualizacin de
protenas, cidos nucleicos y molculas pequeas. El programa est dirigido a
mostrar, la enseanza y la generacin de la publicacin de imgenes de calidad.
El programa ha sido desarrollado en la Universidad de Edimburgo por la Unidad
de Investigacin de Biocomputacin y el Departamento de Estructura
Biomolecular de Investigacin y Desarrollo de Glaxo en Greenford, Reino Unido.
Figura 35.Representacin de la molcula de DNASA.
- 79 -
Cristina Ayuso Aixa
RasMol coordina los archivos en varios formatos y muestra interactivamente la

molcula en la pantalla en una variedad de colores y representaciones muy
variadas.
Actualmente apoya formatos de archivo de entrada como Brookhaven Protein
Databank (PDB), Tripos' Alchemy, Sybyl Mol2 formats, Molecular Design
Limited's (MDL) Mol file format, Minnesota Supercomputer Center's (MSC) XMol
XYZ format y CHARMm format files. Si la conectividad de la informacin y / o
estructura secundaria de informacin no est contenida en el expediente se
calcula automticamente.
La estructura de la molcula cargada puede ser mostrada en alambre, esqueleto,
bastones, en espacio completo, bolas y bastones, cintas, hebras, dibujo y
superficie molecular. Los tomos tambin pueden ser etiquetados con cadenas
de texto arbitrario mediante la opcin etiquetas.
Figura 36. Representacin de la molcula de BSA en esqueleto.
- 80 -
Figura 37. Representacin de la molcula de BSA en bolas y bastones.
Diferentes partes de la molcula se pueden mostrar de color independiente del

resto de la molcula o mostrados simultneamente en diferentes
representaciones. La molcula puede ser rotada, trasladada, hacerle zoom
interactivamente utilizando el ratn, las barras de desplazamiento, la lnea de
comandos o una marca en el cuadro adjunto.
Figura 38. Representacin independiente y simultnea de los

aminocidos de Tirosina de la molcula de DNASA
- 81 -
Cristina Ayuso Aixa
RasMol tambin puede leer una lista de comandos preparados a partir de un

"script 'archivo (o por medio de la comunicacin) para que una determinada
imagen o el punto de vista se restablezcan rpidamente. RasMol tambin puede
crear un archivo de comandos que contiene los comandos necesarios para
regenerar la imagen actual y mostrarla de la manera que se desee.
Figura 39. Cuadro de comandos de RasMol.
Por ltimo, la imagen puede ser prestada por escrito en una variedad de
formatos tanto both raster and vector PostScript, GIF, PPM, BMP, PICT, Sun
rasterfile, MolScript input script o Kinemage.
RasMol se ejecutar sobre una amplia gama de arquitecturas y sistemas,
incluyendo SGI, sun4, sun3, sun386i, DEC, HP y E & S, IBM RS/6000, Cray,
Sequent, DEC Alpha (OSF / 1, OpenVMS y Windows NT), IBM PC (en Microsoft
Windows, Windows NT, OS / 2, Linux, * BSD y BSD386), Apple Macintosh
(Sistema 7.0 o posterior), PowerMac y VAX VMS (DEC bajo Windows). UNIX y
requieren un SLB versiones de 8 bits, 24 bits o 32 bits de Windows X frame
buffer (X11R4 o posteriores). La versin X de RasMol en Windows proporciona
soporte opcional para la aceleracin de la prestacin de la memoria compartida
(a travs de la XInput y extensiones de MIT-SHM) si estn disponibles.
7.2. Vision Pro

Vision Pro es un poderoso y verstil servicio de softwareTM que ofrece un
instrumento avanzado de control y capacidades de manipulacin de datos.
Creado para optimizar y aporta una visin fcil de usar, en un entorno grfico
para el anlisis espectrofotomtrico.
- 82 -
Pro software ofrece una completa serie de opciones mejorar la productividad de

su instrumento de UV-visible. El mtodo de instalacin, la recopilacin de datos,
clculos, el informe de presentacin, el cumplimiento de la normativa y todos los
aspectos de su anlisis se pueden realizar la serie de software Vision Pro.
Vision Pro software cuenta con avanzadafuncionalidad de escaneado, nico y
mltiple; fija las mediciones avanzadas de longitud de onda, completa la
correccin de longitud de onda de referencia y completa el anlisis cuantitativo.
Adems, incluye un componente de anlisis simultneo de concentracin de
mltiples componentes.
Ofrece una avanzada herramienta de clculo a tiempo real o despus de correr el
procesamiento de datos. A su vez, tambin incorporada en la hoja de clculo la
funcionalidad de UV programadas por el usuario y proporciona clculos
completos de la flexibilidad como formato de resultados finales. Vision Pro tiene
la posibilidad de presentar un informe donde se puede incluir mtodos, grficos y
datos flexibles del compositor.
La aplicacin permite la fusin de ADN el control de la calefaccin/ refrigeracin
de los ciclos. Esto ahorra tiempo y permite realizar experimentos hasta 6 veces
ms rpido que con la temperatura fija tradicional de rampas.
Vision Life tambin ofrece una amplia gama de mtodos de clculo de
temperatura que pueden tambin ser ampliada con el uso UV calc.
Este software es ideal para laboratorios que necesitan producir la publicacin de
resultados de calidad hacia la informacin que se aporta a los clientes.
El software automatiza la enzimtica en experimentos de anlisis de alimentos,
orientando al usuario paso a paso a travs del mtodo, clculos, y la
presentacin de datos.
El software est diseado especficamente para graficar el anlisis y para
presentar informes. Adems le permite lanzar cualquier paquete de anlisis a
datos externos, incluyendo Microsoft Excel, sin tener que salir de la aplicacin
Vision Pro. La importacin / exportacin de datos permite la fcil circulacin de
datos entre otros programas.
7.3. Thermo Scientific Evolution 300

El Thermo Scientific Evolution 300 es el espectrofotmetro utilizado en el
mtodo experimental.
Es el espectrofotmetro ms rpido de doble haz de investigacin de su clase.
Equipado con una amplia muestra del compartimiento y una coleccin de ms de
70 accesorios, que permite analizar cualquier muestra con una gran facilidad.
- 83 -
Cristina Ayuso Aixa
Figura 40. Espectrofotmetro Evolution 300 UV-Visible.
El Evolution 300 cuenta con una evolucin real de diseo de doble haz, ancho de
banda variable, y una larga vida de la lmpara de xenn que garantiza la
confianza mxima en el anlisis de la muestras. La capacidad de ancho de
banda variable de anlisis se puede acomodar en 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, y 4,0 nm
para todas las necesidades analticas que se precisen. Para mayor seguridad, la
lmpara de mercurio y la validacin del carrusel de calibracin automatizada de
accesorios proporcionan verificacin de rendimiento para garantizar el
cumplimiento de las normativas.
El espectrofotmetro combina la agilidad de una rpida tasa de adquisicin de
datos con una temperatura controlada por clulas-cambiador o una poderosa
rpida mezcla de accesorios para aumentar la funcionalidad.
Los accesorios para Evolution 300 pueden ser instalados y eliminados sin
necesidad de reiniciar el instrumento. Los accesorios son inmediatamente
detectados por el software Vision Pro configurndolos automticamente.
Todas las aplicaciones comunes, como la exploracin, anlisis de longitud de
onda fija, y la cintica, se pueden controlar directamente desde Vision Pro. Para
aplicaciones avanzadas, tambin incluye un poderoso conjunto de software para
el anlisis exacto de sus muestras.
7.4. Autoclave
Un autoclave es un dispositivo que sirve para esterilizar material mdico o de
laboratorio, utilizando vapor de agua a alta presin y temperatura, evitando con
las altas presiones que el agua llegue a ebullicin. El fundamento del autoclave
es que coagula las protenas de los microorganismos debido a la presin y
temperatura, aunque recientemente se ha llegado a saber de algunos
- 84 -
microorganismos, as como los priones, que pueden soportar las temperaturas de

autoclave.
Las autoclaves funcionan permitiendo la entrada o generacin de vapor de agua
pero restringiendo su salida, hasta obtener una presin interna de 103 kPa, lo
cual provoca que el vapor alcance una temperatura de 121 grados centgrados.
Un tiempo tpico de esterilizacin a esta temperatura y presin es de 15 a 20
minutos.
Para realizar este proceso hay que seguir lo siguientes pasos:
1. Mirar el nivel del agua del interior del autoclave, asegurarse que este a nivel
de la cesta de carga o a un nivel un poco superior.
2. Cargar la cesta con el material a autoclavar.
3. Cerrar la tapa apretando bien la manivela de cierre.
4. Comprobar que la vlvula de vapor y desage este bien cerrada.
5. Poner el autoclave en marcha.
6. Una vez finalizado el proceso, parar la mquina y abrir la vlvula de vapor

(nunca abrir la tapa superior) para que salga el vapor de agua a alta presin.
7. Una vez ya no salga ms vapor de agua aflojar la manivela de cierre y abrir el

autoclave.
8. Dejar enfriar el material.
9. Coger el material con guantes de proteccin.
Figura 41. Autoclave
- 85 -
CAPTULO 8:MTODO
EXPERIMENTAL
8.1. Reactivos8
Protena BSA (Bovine Serum Albumin).
Protena DNAsa 1 (Desoxyrribonuclease I).
Disolucin tampn bsica.
Disolucin tampn cida.
cido Clorhdrico (HCl).
Hidrxido de Sodio (NaOH).
Agua Destilada (H2O).
8.2. Instrumentacin
Espectrofotmetro Evolution 300 UV-Visible.
Cubetas de cuarzo con volumen interno de 1ml.
pH-metro de la marca CRISOM.
Agitador magntico.
Autoclave.
Pipetas aforadas de volumen 10 ml.
8 Consultar las fichas de seguridad en el anexo adjunto a la memoria del proyecto.
- 87 -
Cristina Ayuso Aixa
Micropipeta.
Eppendorfs.
Tubos de centrfuga de 15 ml.
Puntas de pipeta.
Gradilla de puntas.
Vasos de precipitados.
Pera o succionador.
Pipetas Pasteur.
8.3. Procedimiento experimental

Sondeando la estructura de la protena y la dinmica de la segunda derivada del
anlisis de absorcin en el ultravioleta:
Se describe un enfoque para el estudio de la estructura de la protena utilizando
la regin ultravioleta del espectro de absorbancia (UV), donde los cambios de la
absorbancia de los aminocidos aromticos son inducidos por la
desnaturalizacin trmica o por medio cido-base.
El mtodo se basa en la hiptesis de que a medida que se desnaturalice la
protena irn cambiando la estructura terciaria y secundaria de las protenas, lo
que provocar el cambio de posicin respecto del solvente de lo aminocidos
aromticos.
Se ha investigado el potencial de este mtodo de sonda de medicin de la
dinmica de las protenas de alta resolucin de segunda derivada de los
espectros de los rayos UV, en funcin de la temperatura y de cambios de medio
cido-base de dos protenas de diferentes propiedades fsicas y qumicas, para
representar cadenas laterales totalmente expuestas. Se demuestra que los
pequeos cambios en la posicin del mximo de la longitud de onda de Phe, Tyr
y Trp, puede ser medido con fiabilidad, y que la magnitud y la direccin del
rastreo de picos se ven influidos por varios factores, como el tamao y carga de
la protena, y el medio o ambiente local y la accesibilidad de los grupos
aromticos de los disolventes.
Aspectos dinmicos de la estructura de la protena se han convertido cada vez
de ms inters debido a su papel potencial en la estructura de la protena, la
estabilidad y funcin. La estructura y las mociones de las cadenas polipeptdicas
en protenas, pueden ser estudiadas por una serie de mtodos, cada uno de ellos
dando una imagen distinta de la estructura dinmica, debido a la escala de
tiempo y la magnitud de las propuestas de resolucin, que pueden ser probadas
por una particular tecnologa.
Se pueden alcanzar imgenes de alta resolucin mediante RMN (Keniry Carver y
2002, Adams et al. 2004), ERS (Poluektov et al. 2003), de intercambio de
istopos de seguimiento por espectrometra de masas (Zhang y Smith 1993; Yan
et al. 2004) y espectroscopia infrarroja (Yu et al. 2004). A ms baja resolucin,
- 88 -
con una nica imagen de protenas, el comportamiento dinmico es

proporcionado por el uso de un pequeo soluto neutro como O2 y acrilamida
(Lakowicz et al. 1983; Fasano et al. 2003; Ruiz et al. 2003) para estudiar el
enfriamiento de la protena en la fluorescencia.
Para obtener una imagen ms completa de la estructura tridimensional de la
protena y de su dinmica de desnaturalizacin, la espectroscopia de absorbancia
ultravioleta se puede utilizar para monitorizar las seales de los tres aminocidos
aromticos: Phe, Tyr y Trp. El espectro de absorbancia de cada uno de estos
aminocidos contiene una amplia superposicin de varios picos de entre 200 y
300 nm.
Estos se derivan de las bandas ms dbiles en la participacin de las transiciones
de los electrones de los anillos aromticos (Donovan 1969; Wetzel et al. 1980).
El clculo de la derivada de una curva de absorbancia mejora y facilita la
resolucin del complejo espectro de orden cero (Giese y francs en 1955; Grum
et al. 1972). En la segunda derivada del espectro (d2A/d 2), la absorbancia que
se derivan de estos residuos es resuelta como mnimos en la regin espectral de
245-270 nm (Phe), 265-285 (Tyr), y 265-295 nm (Trp) y, por tanto, la
superposicin espectral se reduce significativamente (Ichikawa y Terada 1977;
Balestrieri et al. 1978; Levine y Feferici 1982; Kueltzo et al. 2003).
Acontecimientos recientes en alta resolucin de espectroscopia ultravioleta de
absorbancia, permiten que la derivada en la posicin de los picos defina una
resolucin mayor y tambin acercarse a 0,01 nm.
Por lo tanto, pequeos cambios en las posiciones de los mximos de absorbancia
se pueden detectar, y son la base de los estudios descritos en este proyecto.
El anlisis de la segunda derivada de los espectros se ha utilizado para
cuantificar el contenido de aminocidos (Ichikawa y Terada 1977, 1979;
Balestrieri et al. 1978, 1980, Levine y Federici 1982), detectar cambios
conformacionales en trminos de alteraciones en la cadena lateral, en
microentornos aromticos ( Solli y Herskovits 1973; Ichikawa y Terada, 1979;
Mach et al. 1991; Mach y Middaugh 1994), y ms recientemente, para generar
diagramas de fase emprica analizando la estabilidad de las protenas de una
serie de condiciones de la solucin (Kueltzo et al. 2003 ).
Para complementar estas aplicaciones, el mtodo aqu descrito utiliza la
desnaturalizacin de los grupos aromticos Phe, Tyr y Trp, para tratar las
caractersticas de la estructura de la protena.
8.3.1. Procedimiento
1. Se introducen dos cubetas de cuarzo vacas y se realiza una lnea base con
alta resolucin de 240 a 850 nm, de la que se obtiene una recta de
calibracin, ahora se tiene la certeza de tener el espectrofotmetro a punto.
2. Fijamos el mtodo de barrido con los siguientes datos:
Modo dato: Absorbancia.
Lambda de inicio a 240 nm.
- 89 -
Cristina Ayuso Aixa
Lambda de parada 340 nm.
Ancho de banda de 10 nm.
Velocidad barrido: Intelliscan
Intervalo de datos con Alta Resolucin.
Lmpara: de Xenn (en la desnaturalizacin trmica se fijaran tantos

ciclos como C se quiera aumentar hasta la temperatura final).
Suavizado Muy Alto para eliminar los posibles ruidos que se puedan
detectar.
Activar Tabla de Resultados con Registro de Picos en 100 (lo mximo que
registra la mquina, para que nos coja todos los posibles, despus ya se
descartaran).
3. Se introduce en la primera cubeta la protena a tratar y en la segunda (cubeta

de referencia) el medio a contrarrestar (agua destilada).
4. Finalmente se guardan los datos en modo lote resultados, para analizarlos en

el software Vision Pro, y tambin como ASCI para poderlos tratar
posteriormente con procesadores de textos y hojas de clculo.
- 90 -
CAPTULO 9:
RESULTADOS
EXPERIMENTALES
Se quiere estudiar la desnaturalizacin trmica y cido-bsica de dos protenas

globulares mediante la monitorizacin de los mximos de absorbancia de los
aminocidos aromticos en la regin ultravioleta.
Posteriormente se comparar esta evolucin graficada con el patrn de cada
aminocido y con la estructura primaria de las protenas escogidas para este
estudio.
9.1. Protena BSA (Albumin Serum Bovine)

9.1.1. Desnaturalizacin trmica
Se prepara una disolucin en agua de [BSA] = 10 mg/ml. Se pone en
funcionamiento el procedimiento anteriormente expuesto, y se obtiene un
seguimiento de los cambios de absorbancia de la protena. En esta ocasin se
definen 7 ciclos de temperatura, fijando un aumento de temperatura de 30 C
hasta 90C.
Se observa que en las regiones de 2400024320 nm y 33680-34000 nm, la

protena BSA no muestra absorcin en ultravioleta visible.
Se deduce que los aminocidos aromticos absorben en las siguientes regiones

espectrales:
- 91 -
Cristina Ayuso Aixa
Fenilalanina: regin espectral de 245 a 270 nm.
Tirosina: regin espectral de 265 a 285 nm.
Triptfano: regin espectral de 265 a 295 nm.
Se grafican los resultados obtenidos del barrido espectral, dentro de las

anteriores regiones.
Cuando se estudia la segunda derivada esta absorbancia se representa en valor
absoluto.
273,00
1
267,00 3
4
Absorbancia
5
261,00
6
7
255,00
8
249,00 10
11
243,00
30,00 40,00 50,00 60,00 70,00 80,00 90,00
Temperatura
Figura 42. Representacin de la desnaturalizacin trmica con BSA en

la regin espectral de Fenilalanina.
- 92 -
290,00
1
285,00
2
280,00 4
Absorbancia
6
275,00
7
8
270,00
9
265,00
260,00
30,00 40,00 50,00 60,00 70,00 80,00 90,00
Temperatura

la regin espectral de Tirosina.
300,00
1
295,00 2
3
290,00 4
5
285,00 6
Absorbancia
7
280,00 8
9
275,00 10
11
270,00 12
13
265,00 14
15
260,00
30,00 40,00 50,00 60,00 70,00 80,00 90,00
Temperatura

la regin espectral de Triptfano.
- 93 -
Cristina Ayuso Aixa
9.1.2. Desnaturalizacin cido- Base

Se prepara una disolucin en agua de [BSA] = 10 mg/ml, seguidamente, se pone
en funcionamiento el procedimiento anteriormente expuesto, obteniendo un
seguimiento de los cambios de absorbancia de la protena. En esta ocasin se
fijan 11 ciclos a diferente pH, se descarta hacer un estudio a pH 7 dado que el
agua destilada se encuentra dentro de este trmino con un pH de 617, por tanto
nuestra disolucin de agua ms BSA se encuentra a pH de 688 y no comporta
ninguna desnaturalizacin.
protena BSA no muestra absorcin en ultravioleta - visible.
espectrales:
Se grafican los resultados obtenidos del barrido espectral dentro de las

279,00
275,00 1
2
271,00
3
267,00
4
Absorbancia
263,00 5
6
259,00
7
255,00
8
251,00 9
10
247,00
243,00
1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 8,00 9,00 10,00 11,00 12,00
pH
Figura 45. Representacin de la desnaturalizacin por medio cido-bsico con

BSA en la regin espectral de la Fenilalanina.
- 94 -
290,00
286,00 1
2
282,00
3
Absorbancia
278,00 4
5
274,00
6
270,00 7
8
266,00
262,00
1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 8,00 9,00 10,00 11,00 12,00
pH
Figura 46. Representacin de la desnaturalizacin por medio cido - bsico con

BSA en la regin espectral de la Tirosina.
298,00
1
294,00 2
3
290,00
4
286,00 5
Absorbancia
6
282,00
7
278,00 8
9
274,00
10
270,00 11
12
266,00
262,00
1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 8,00 9,00 10,00 11,00 12,00
pH
Figura 47. Representacin de la desnaturalizacin por medio cido -

bsico con BSA en la regin espectral de la Triptfano.
- 95 -
Cristina Ayuso Aixa
9.2. Protena DNAsa (Deoxyribonuclease I

Pancreas Bovine)
9.2.1. Desnaturalizacin Trmica
Se prepara una disolucin en agua de [DNAsa] = 08787 mg/ml, seguidamente
se pone en funcionamiento el procedimiento anterior, obteniendo un seguimiento
de los cambios de absorbancia de la protena.
espectrales:

Cuando se estudia la segunda derivada, esta absorbancia se representa en valor
absoluto.
Tambin se hace uso de la cuarta derivada, para obtener el recorrido de los picos
ms significativos que aparecen en los espectros graficados en este captulo.
290,00
285,00
1
280,00
275,00 2
270,00
3
265,00
Absorbancia
4
260,00
255,00 5
250,00
6
245,00
240,00
20,00 25,00 30,00 35,00 40,00 45,00 50,00 55,00 60,00 65,00 70,00 75,00 80,00 85,00 90,00 95,00
Temperaturas
Figura 48. Representacin de la desnaturalizacin trmica con DNAsa en la regin

espectral de Fenilalanina.
- 96 -
330,00
1
320,00
2
310,00
3
300,00
4
290,00
Absorbancia
5
280,00
6
270,00
7
260,00
8
250,00
20,00 25,00 30,00 35,00 40,00 45,00 50,00 55,00 60,00 65,00 70,00 75,00 80,00 85,00 90,00 95,00
Temperaturas

espectral de Tirosina.
340,00
1
330,00 2
320,00 3
4
310,00
5
300,00
6
Absorbancia
290,00 7
8
280,00
9
270,00
10
260,00
20,00 25,00 30,00 35,00 40,00 45,00 50,00 55,00 60,00 65,00 70,00 75,00 80,00 85,00 90,00 95,00
Temperaturas
espectral de Triptfano.
- 97 -
Cristina Ayuso Aixa
9.2.2. Desnaturalizacin cido Base

Se prepara una disolucin en agua de [DNAsa] = 08787 mg/ml, seguidamente
se pone en funcionamiento el procedimiento anteriormente expuesto, obteniendo
un seguimiento de los cambios de absorbancia de la protena
Se obtiene que los aminocidos aromticos muestran unas regiones en forma de
picos, expresadas en las siguientes regiones espectrales:

anteriores regiones espectrales.
Cuando se estudia la segunda derivada, esta absorbancia se representa en valor
absoluto.
Tambin se hace uso de la cuarta derivada, para obtener el recorrido de los picos
ms significativos que aparecen en los espectros graficados en este captulo.
270,00
1
265,00
2
Absorbancia
260,00
3
255,00 5
6
250,00
7
245,00
1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 8,00 9,00 10,00 11,00 12,00
pH
Figura 51. Representacin de la desnaturalizacin por medio cido-

bsico con DNAsa en la regin espectral de la Fenilalanina.
- 98 -
285,00
280,00
1
2
Absorbancia
275,00
3
4
270,00 5
6
265,00 7
260,00
1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 8,00 9,00 10,00 11,00 12,00
pH

bsico con DNAsa en la regin espectral de la Tirosina.
295,00
1
290,00
2
285,00 3
Absorbancia
4
280,00
5
275,00 6
7
270,00
8
265,00
9
260,00 10
1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 8,00 9,00 10,00 11,00 12,00
pH

bsico con DNAsa en la regin espectral de la Triptfano.
- 99 -
Cristina Ayuso Aixa
9.3. Comparacin de la evolucin graficada con la

estructura primaria de las protenas.
9.3.1. Estructura primaria de BSA.
1 A 585 ASP ALA HIS LYS SER GLU VAL ALA HIS ARG PHE LYS ASP
2 A 585 LEU GLY GLU GLU ASN PHE LYS ALA LEU VAL LEU ILE ALA
3 A 585 PHE ALA GLN TYR LEU GLN GLN CYS PRO PHE GLU ASP HIS
4 A 585 VAL LYS LEU VAL ASN GLU VAL THR GLU PHE ALA LYS THR
5 A 585 CYS VAL ALA ASP GLU SER ALA GLU ASN CYS ASP LYS SER
6 A 585 LEU HIS THR LEU PHE GLY ASP LYS LEU CYS THR VAL ALA
7 A 585 THR LEU ARG GLU THR TYR GLY GLU MET ALA ASP CYS CYS
8 A 585 ALA LYS GLN GLU PRO GLU ARG ASN GLU CYS PHE LEU GLN
9 A 585 HIS LYS ASP ASP ASN PRO ASN LEU PRO ARG LEU VAL ARG
10 A 585 PRO GLU VAL ASP VAL MET CYS THR ALA PHE HIS ASP ASN
11 A 585 GLU GLU THR PHE LEU LYS LYS TYR LEU TYR GLU ILE ALA
12 A 585 ARG ARG HIS PRO TYR PHE TYR ALA PRO GLU LEU LEU PHE
13 A 585 PHE ALA LYS ARG TYR LYS ALA ALA PHE THR GLU CYS CYS
14 A 585 GLN ALA ALA ASP LYS ALA ALA CYS LEU LEU PRO LYS LEU
15 A 585 ASP GLU LEU ARG ASP GLU GLY LYS ALA SER SER ALA LYS
16 A 585 GLN ARG LEU LYS CYS ALA SER LEU GLN LYS PHE GLY GLU
17 A 585 ARG ALA PHE LYS ALA TRP ALA VAL ALA ARG LEU SER GLN
18 A 585 ARG PHE PRO LYS ALA GLU PHE ALA GLU VAL SER LYS LEU
19 A 585 VAL THR ASP LEU THR LYS VAL HIS THR GLU CYS CYS HIS
20 A 585 GLY ASP LEU LEU GLU CYS ALA ASP ASP ARG ALA ASP LEU
21 A 585 ALA LYS TYR ILE CYS GLU ASN GLN ASP SER ILE SER SER
22 A 585 LYS LEU LYS GLU CYS CYS GLU LYS PRO LEU LEU GLU LYS
23 A 585 SER HIS CYS ILE ALA GLU VAL GLU ASN ASP GLU MET PRO
24 A 585 ALA ASP LEU PRO SER LEU ALA ALA ASP PHE VAL GLU SER
25 A 585 LYS ASP VAL CYS LYS ASN TYR ALA GLU ALA LYS ASP VAL
26 A 585 PHE LEU GLY MET PHE LEU TYR GLU TYR ALA ARG ARG HIS
27 A 585 PRO ASP TYR SER VAL VAL LEU LEU LEU ARG LEU ALA LYS
28 A 585 THR TYR GLU THR THR LEU GLU LYS CYS CYS ALA ALA ALA
29 A 585 ASP PRO HIS GLU CYS TYR ALA LYS VAL PHE ASP GLU PHE
30 A 585 LYS PRO LEU VAL GLU GLU PRO GLN ASN LEU ILE LYS GLN
31 A 585 ASN CYS GLU LEU PHE GLU GLN LEU GLY GLU TYR LYS PHE
32 A 585 GLN ASN ALA LEU LEU VAL ARG TYR THR LYS LYS VAL PRO
33 A 585 GLN VAL SER THR PRO THR LEU VAL GLU VAL SER ARG ASN
- 100 -
34 A 585 LEU GLY LYS VAL GLY SER LYS CYS CYS LYS HIS PRO GLU
35 A 585 ALA LYS ARG MET PRO CYS ALA GLU ASP TYR LEU SER VAL
36 A 585 VAL LEU ASN GLN LEU CYS VAL LEU HIS GLU LYS THR PRO
37 A 585 VAL SER ASP ARG VAL THR LYS CYS CYS THR GLU SER LEU
38 A 585 VAL ASN ARG ARG PRO CYS PHE SER ALA LEU GLU VAL ASP
39 A 585 GLU THR TYR VAL PRO LYS GLU PHE ASN ALA GLU THR PHE
40 A 585 THR PHE HIS ALA ASP ILE CYS THR LEU SER GLU LYS GLU
41 A 585 ARG GLN ILE LYS LYS GLN THR ALA LEU VAL GLU LEU VAL
42 A 585 LYS HIS LYS PRO LYS ALA THR LYS GLU GLN LEU LYS ALA
43 A 585 VAL MET ASP ASP PHE ALA ALA PHE VAL GLU LYS CYS CYS
44 A 585 LYS ALA ASP ASP LYS GLU THR CYS PHE ALA GLU GLU GLY
45 A 585 LYS LYS LEU VAL ALA ALA SER GLN ALA ALA LEU GLY LEU
A travs del software Rasmol, se introduce la estructura primaria de la protena

Albmina y se seleccionan los tres aminocidos aromticos a estudiar.
Simultneamente, una vez visualizados estos aminocidos, se puede localizar su
posicin en la molcula. A continuacin se exponen unas tablas con los
resultados obtenidos.
Tabla 4. Localizacin de las 31 Fenilalaninas.
Aminocido Posicin en la molcula Aminocido Posicin en la molcula

Phe 22BA Externa Phe 27A Interna
Phe 36A Externa Phe 56BA Interna
Phe 49A Externa Phe 70A Interna
Phe 4BBA Interna Phe 554 Interna
Phe 11A Interna Phe 551A Interna
Phe 19A Interna
- 101 -
Cristina Ayuso Aixa
Tabla 5. Localizacin de las 18 Tirosinas.

Tyr B4A Externa Tyr 14BA Interna
Tyr 161A Externa Tyr 30A Interna
Tyr 13BA Interna Tyr 411A Interna
Tabla 6. Localizacin del Triptfano.
Aminocido Posicin en la molcula

Trp 214A Interna
9.3.2. Esctructura primaria de DNAsa
1 A 373 ACE ASP GLU ASP GLU THR THR ALA LEU VAL CYS ASP ASN
2 A 373 GLY SER GLY LEU VAL LYS ALA GLY PHE ALA GLY ASP ASP
3 A 373 ALA PRO ARG ALA VAL PHE PRO SER ILE VAL GLY ARG PRO
4 A 373 ARG HIS GLN GLY VAL MET VAL GLY MET GLY GLN LYS ASP
5 A 373 SER TYR VAL GLY ASP GLU ALA GLN SER LYS ARG GLY ILE
6 A 373 LEU THR LEU LYS TYR PRO ILE GLU HIC GLY ILE ILE THR
7 A 373 ASN TRP ASP ASP MET GLU LYS ILE TRP HIS HIS THR PHE
8 A 373 TYR ASN GLU LEU ARG VAL ALA PRO GLU GLU HIS PRO THR
9 A 373 LEU LEU THR GLU ALA PRO LEU ASN PRO LYS ALA ASN ARG
10 A 373 GLU LYS MET THR GLN ILE MET PHE GLU THR PHE ASN VAL
11 A 373 PRO ALA MET TYR VAL ALA ILE GLN ALA VAL LEU SER LEU
12 A 373 TYR ALA SER GLY ARG THR THR GLY ILE VAL LEU ASP SER
13 A 373 GLY ASP GLY VAL THR HIS ASN VAL PRO ILE TYR GLU GLY
14 A 373 TYR ALA LEU PRO HIS ALA ILE MET ARG LEU ASP LEU ALA
15 A 373 GLY ARG ASP LEU THR ASP TYR LEU MET LYS ILE LEU THR
16 A 373 GLU ARG GLY TYR SER PHE VAL THR THR ALA GLU ARG GLU
17 A 373 ILE VAL ARG ASP ILE LYS GLU LYS LEU CYS TYR VAL ALA
18 A 373 LEU ASP PHE GLU ASN GLU MET ALA THR ALA ALA SER SER
- 102 -
19 A 373 SER SER LEU GLU LYS SER TYR GLU LEU PRO ASP GLY GLN
20 A 373 VAL ILE THR ILE GLY ASN GLU ARG PHE ARG CYS PRO GLU
21 A 373 THR LEU PHE GLN PRO SER PHE ILE GLY MET GLU SER ALA
22 A 373 GLY ILE HIS GLU THR THR TYR ASN SER ILE MET LYS CYS
23 A 373 ASP ILE ASP ILE ARG LYS ASP LEU TYR ALA ASN ASN VAL
24 A 373 MET SER GLY GLY THR THR MET TYR PRO GLY ILE ALA ASP
25 A 373 ARG MET GLN LYS GLU ILE THR ALA LEU ALA PRO SER THR
26 A 373 MET LYS ILE LYS ILE ILE ALA PRO PRO GLU ARG LYS TYR
27 A 373 SER VAL TRP ILE GLY GLY SER ILE LEU ALA SER LEU SER
28 A 373 THR PHE GLN GLN MET TRP ILE THR LYS GLN GLU TYR ASP
29 A 373 GLU ALA GLY PRO SER ILE VAL HIS ARG
1 D 260 LEU LYS ILE ALA ALA PHE ASN ILE ARG THR PHE GLY GLU
2 D 260 THR LYS MET SER ASN ALA THR LEU ALA SER TYR ILE VAL
3 D 260 ARG ILE VAL ARG ARG TYR ASP ILE VAL LEU ILE GLN GLU
4 D 260 VAL ARG ASP SER HIS LEU VAL ALA VAL GLY LYS LEU LEU
5 D 260 ASP TYR LEU ASN GLN ASP ASP PRO ASN THR TYR HIS TYR
6 D 260 VAL VAL SER GLU PRO LEU GLY ARG ASN SER TYR LYS GLU
7 D 260 ARG TYR LEU PHE LEU PHE ARG PRO ASN LYS VAL SER VAL
8 D 260 LEU ASP THR TYR GLN TYR ASP ASP GLY CYS GLY ASN CYS
9 D 260 GLY ASN ASP SER PHE SER ARG GLU PRO ALA VAL VAL LYS
10 D 260 PHE SER SER HIS SER THR LYS VAL LYS GLU PHE ALA ILE
11 D 260 VAL ALA LEU HIS SER ALA PRO SER ASP ALA VAL ALA GLU
12 D 260 ILE ASN SER LEU TYR ASP VAL TYR LEU ASP VAL GLN GLN
13 D 260 LYS TRP HIS LEU ASN ASP VAL MET LEU MET GLY ASP PHE
14 D 260 ASN ALA ASP CYS SER TYR VAL THR SER SER GLN TRP SER
15 D 260 SER ILE ARG LEU ARG THR SER SER THR PHE GLN TRP LEU
16 D 260 ILE PRO ASP SER ALA ASP THR THR ALA THR SER THR ASN
17 D 260 CYS ALA TYR ASP ARG ILE VAL VAL ALA GLY SER LEU LEU
18 D 260 GLN SER SER VAL VAL PRO GLY SER ALA ALA PRO PHE ASP
19 D 260 PHE GLN ALA ALA TYR GLY LEU SER ASN GLU MET ALA LEU
20 D 260 ALA ILE SER ASP HIS TYR PRO VAL GLU VAL THR LEU THR
Utilizando el software Rasmol se seleccionan los tres aminocidos aromticos a

estudiar. Simultneamente, una vez visualizados estos aminocidos, se puede
localizar su posicin en la molcula. A continuacin se exponen unas tablas con
los resultados obtenidos.
- 103 -
Cristina Ayuso Aixa
Tabla 7. Localizacin de las 22 Fenilalaninas.

Phe B2D Externa Phe 266A Externa
Phe B4D Externa Phe 6D Interna
Phe 21A Externa Phe 11D Interna
Phe 109D Externa Phe 31A Interna
Phe 192D Externa Phe 128D Interna
Tabla 8. Localizacin de las 32 Tirosinas.

Tyr 1BBA Externa Tyr 239D Externa
Tyr 19BA Externa Tyr 240A Externa
Tyr 24D Externa Tyr 279A Externa
Tyr 32D Externa Tyr 362A Externa
Tyr 47D Externa Tyr 21BA Interna
Tyr 54D Externa Tyr 53A Interna
Tyr 69A Externa Tyr 60D Interna
Tyr 76D Externa Tyr 63D Interna
Tyr 91A Externa Tyr 65D Interna
Tyr 151D Externa Tyr 253D Interna
Tyr 211D Externa
- 104 -
Tabla 9. Localizacin de los 7 Triptfanos.

Trp 79A Externa Trp B6A Interna
Trp 158D Externa Trp 240A Interna
Trp 181D Externa Trp 356A Interna
Trp 194D Externa
El objetivo de tabular los resultados que nos ofrece la estructura primaria a

travs del programa, es visualizar con facilidad que aminocidos se encuentran
dentro de la molcula. stos sern los que al aplicar cualquier tipo de
desnaturalizacin sufrirn los cambios, permitiendo observar los cambios de
absorbancia.
En este estudio, por tanto, vase dnde se producirn estos cambios si
aplicamos las dos desnaturalizaciones mencionadas a lo largo del captulo en la
protena de BSA y en la protena de DNAsa.
En una desnaturalizacin trmica de la protena BSA se observa que los

cambios se producen entre un rango de 60 a 90C en todas las regiones
espectrales. Se destaca que, en la regin de la Tirosina hay un cambio
significativo a 80C de 261 a 273 nm.
En una desnaturalizacin por medio cido-bsico de la protena BSA se

observa que los cambios se producen entre los pH 5-6 y 9-11 en las tres
diferentes regiones espectrales.
En una desnaturalizacin trmica de la protena DNAsa I, aparece un salto

en la regin espectral correspondiente a la Fenilalanina a una temperatura
de 35C. Mientras que en las dos regiones restantes, los cambios
significativos se producen a 75-80C.
En una desnaturalizacin por medio cido-bsico de la protena DNAsa de

pncreas bovino, a un ph de 2 y 8 de la regin espectral de la Fenilalanina,
sobresalen posibles cambios de los aminocidos a estudiar. Mientras que,
a partir de 280 nm, es decir en la regin que corresponde al Triptfano,
estos cambios se producen a un pH de 9 y 11.
Inicialmente, antes de desnaturalizar la protena mediante cualquiera de los dos

mtodos utilizados, algunos de los aminocidos aromticos se encuentran en el
interior de la protena. Estos aminocidos en un espectro realizado tanto a
temperatura ambiente como a pH 7, no son apreciados. Al desnaturalizar, estos
grupos cambian de posicin y salen hacia el exterior, situndose en un ambiente
que les permita no estar apantallados y absorber. Es aqu cuando en el espectro,
se observan los cambios de absorbancia, y por eso decimos que la protena se ha
desnaturalizado.
- 105 -
CAPTULO 10:
CONCLUSIONES
Una alternativa para el estudio de la estructura de la protena es utilizar la

radiacin ultravioleta (UV), donde los cambios de absorbancia de los aminocidos
aromticos de la protena provocados por la desnaturalizacin trmica o de pH
son detectables.
Aunque se utilicen protenas con diferentes propiedades fsicas y qumicas, stas
se desnaturalizan cambiando su estructura si se les aplica un cambio de
temperatura, de pH, de medio, de luz, presin, etc.
En los espectros originales, generalmente, se observa un slo pico de absorcin
suave. La aplicacin de la segunda y de la cuarta derivada permite y facilita
enormemente observar los picos de absorcin del espectro.
Los espectros de las protenas desnaturalizadas permiten observar aminocidos,
que anteriormente estaban en el interior de la molcula y que no absorbian por
estar apantallados por el resto de aminocidos, que ahora una vez
desnaturalizada la protena, salen y absorben, pudiendo ser detectados en el
espectro.
En las protenas de BSA y DNAsa ocurre lo que anteriormente se ha dicho.
Grupos aromticos que inicialmente estn en el interior de la protena salen al
exterior cambiando de posicin cuando se desnaturaliza trmicamente o por
medio cido-base.
En el caso de la desnaturalizacin trmica de la BSA se observan alteraciones a
60 y a 80 C, en cambio en la DNAsa las variaciones ya se percibien de los 30
hasta los 80 C, a partir de esta temperatura la protena est completamente
desnaturalizada.
Para la desnaturalizacin por medio cido-base de la BSA se manifiestan
alteraciones en la zona cida a un pH de 5 y en la zona bsica a 9. En cambio,
para la protena de DNAsa las variaciones se observan en la zona cida a pH 3,
sin embargo en la zona bsica esta protena es estable, detectando muy
pequeas variaciones a pH 8.
- 107 -
CAPTULO 11:
EVALUACIN
ECONMICA
Para realizar la evaluacin econmica de este proyecto se han tenido en cuenta

los gatos correspondientes a:
Costes de material y energa.
Costes de personal
Amortizaciones
11.1. Costes de material y energa

Para calcular los costes de este apartado se han tenido la cuenta los materiales y
productos utilizados y la electricidad.
Empezaremos detallando la parte de material y productos. El precio tanto de
material como producto se ha obtenido multiplicando el precio unitario por la
cantidad que se necesita y sumndole un IVA del 7%.
Tabla 10. Precio productos.
Cantidad (G) Precio envase Total ()

Albmina de suero bovino 20 60,24 60,24
Desoxirribonucleasa I de
0,1 88,30 88,30
pncreas bovino
Total () 148,54
- 109 -
Cristina Ayuso Aixa
Tabla 11.Material
Cantidad Precio () IVA 7% () Total ()

Puntas micropipeta 100 11,00 0,77 11,77
Gradilla para puntas 1 29,60 2,07 31,67
Tubos de centrfuga 5 27,00 1,89 28,89
Vasos de
3 6,00 1,26 19,26
precipitados
Pera 1 6,00 0,42 6,42
Pipetas Pasteur 50 13,20 0,92 14,12
Total () 112,13
A continuacin se detalla la parte de electricidad. Para calcularlo se ha estimado

el consumo en el laboratorio. Se han utilizado facturas de luz de la ciudad para el
clculo ya que no se conoca el tipo de contratacin que poda tener el
laboratorio. Es decir el clculo de la energa es aproximado.
Tabla 12. Costes electricidad
Periodo 3
Potencia kW 4,4
Precio kW (/mes) 1,581887
Consumo (kWh) 180
Precio kWh () 0,089868
Subtotal() 37,0571484
Impuesto Elec. () 1,894619463
Conservacin () 0,81
IVA 16% () 6,361882858
Total 46,12
11.2. Costes de personal

Para el clculo de los costes de personal se tiene que tener en cuenta el sueldo
bruto anual de cada trabajador as como las horas trabajadas. Mediante la
siguiente formula se han calculado los costes.

SBA+SS
Coste Personal()=RH(horapersona) aopersona
N horas trabajadas
ao
- 110 -
Tabla 13.Costes Personal
Horas
Cuota SS Horas
Trabajadores n trab. SBA () trabajadas Total ()
() trabajadas
anuales
Tcnico Laboratorio 1 15000 4800 170 1760 1912,50
Total () 1912,50
11.3. Costes amortizaciones

Para el clculo de las amortizaciones hay que tener en cuenta el coste inicial de
los aparatos adems de la vida til de estos. Mediante la siguiente formula se
obtienen los costes para la amortizacin de nuestro proyecto.
Valor Amortitzable()
Cuota cuadrimestral=
2Tiempo Vida til (aos)
Tabla 14.Costes amortizaciones
Precio IVA 7% Precio Tiempo Cuota Cuota

() () total () vida til Anual () cuatrimestral ()
Espectrofotmetro 15000,00 1050,00 16050,00 15 1070,00 535,00
pH-metro 600,00 42,00 642,00 10 64,20 32,10
Agitador
200,00 14,00 214,00 10 21,40 10,70
Magntico
Autoclave 4500,00 315,00 4815,00 10 481,50 240,25
Peltiers 6000,00 420,00 6420,00 15 428,00 214,00
Micropipeta 221,70 15,52 237,22 4 59,30 29,65
Cubetas de cuarzo 83,70 5,86 89,56 5 17,91 8,96
Pipeta aforada 10
38,10 2,67 40,77 4 10,20 5,10
mL
Total () 1075,76
El coste del proyecto es la suma de los costes de las anteriores partes, que
queda resumido en la siguiente tabla:
- 111 -
Cristina Ayuso Aixa
Tabla 15.Costes totales del proyecto
Coste ()
Productos 148,54
Material 112,13
Luz 46,12
Personal 1912,50
Amortizaciones 1075,76
Total 3295,05
- 112 -
CAPTULO 12:
BIBLIOGRAFA
12.1. Referencias bibliogrficas

[1] Albert L.Lehninger. Bioqumica.Las Bases moleculares de la estructura y Funcion Celular.
Ediciones Omega,S.A. Barcelona
[2] Juli Peret,Ramon Sendra, Merc Pamblanco, Carme Ba. Fonaments de Bioqumica. Educaci
Material. Universitat de Valencia 2005.
[3] Donald Voet, Judith.G.Voet. Biochemistry. Ediciones Omega,S.A.
[4] X Fuentes Arderiu, M. J. Castieiras Lacambra, J. M. Queralt Compa. Bioqumica Clnica y
Patologa Molecular: Volumen 1. Reverte. 1998.
[5] Robert Thornton Morrison, Robert Neilson Boyd. Qumica Orgnica. Pearson Educacin. 1998.
[6] Douglas A. Skoog, Donald M. West. Fundamentos de qumica analtica. Cengage Learning
Editores. 2005.
[7] Gregory A Petsko,Dagmar Ringe. Protein Structure and Function. Published by New Science
Press Ltd,2004.
[8] Carlos Gmez, Moreno Calera. Estructura de Protenas. Editorial Ariel,2003.
[9] Rodney F. Boyer. Modern Experimental Biochemistry. Addison-Wesley Publishing Company
[10] Colin Ratledge, Bjrn Kristiansen. Basic Biotechnology. Cambridge University Press.
[11] Laura H.Lucas, Baran A.Ersoy, Lisa A.Kueltzo, Sangeeta B.Joshi, Duane T. Brandau, Nagarajan
Thyagarajapuram, Laura J.Peek, C.Russell Middaugh. Probing protein structure and dynamics
by second-derivative ultraviolet absorption analysis of cation interactions. Protein Science
(2006). Published by Cold Spring Harbor Laboratory Press.
[12] Reinhard Lange, Claude Balny. UV-visible spectroscopy under high pressure. Elseiver Science
B.V. 2002.
- 113 -
Cristina Ayuso Aixa
12.2. Bibliografa de Consulta

[1] Gerardo Turcatti, Sannah Zoffmann, John A. Lowe III, Susan E. Drozda, Grard Chassing, Thue
W. Schwartz, Andr Chollet. Characterization of Non-peptide Antagonist and Peptide Agonist
Binding Sites of the NK1 Receptor with Fluorescent Ligands. The Journal of Biological
Chemistry. 1997.
[2] Hans Binder. Gran Lindblom. A Molecular View on the Interaction of the Trojan Peptide
Penetratin with the Polar Interface of Lipid Bilayers. Biophysical Journal. 2004.
[3] JoAnne McLaurin and Avijit Chakrabarttty. Characterization of the interactions of Alzheimer -
amyloid peptides with phospholipid membranes. Eur. J. Biochem. 1997.
[4] Charalambos Fotakis, Dionisios Christodouleas, Petros Chatzigeorgiou, Maria Zervou,Nikolas-
Ploutarch Benetis, Kyriakos Viras, Thomas Mavromoustakos. Development of a CP 31 P NMR
Broadline Simulation Methodology for Studying the Interactions of Antihypertensive AT1
Antagonist Losartan with Phospholipid Bilayers. Biophysical Journal. 2009.
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Dynamics Simulations. Biophysical Journal. 2009.
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Phospholipid Bilayers: A Neutron Diffraction Study. Biophysical Journal. 1996.
[9] Martina Dyck, Andreas Kerth, Alfred Blume, Mathias Lsche. Interaction of the Neurotransmitter,
Neuropeptide Y, with Phospholipid Membranes: Infrared Spectroscopic Characterization at the
Air/Water Interface. The Journal of physical chemistry. 2009.
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Membrane Mimic. Biophysical Journal. 1999.
[11] Lingang Zhang, Jichun Hu, Zuhong Lu. Preparation of Liposomes with a Controlled Assembly
Procedure. Journal Of Colloid and Interface Science. 1997
[12] Indu R. Chandrashekar, Sudha M. Cowsik. Three-Dimensional Structure of the Mammalian
Tachykinin Peptide Neurokinin A Bound to Lipid Micelles. Biophysical Journal. 2003.
[13] Keniry Carver y 2002, Adams et al. 2004.
[14] Yuan et al. 2003.
[15] Zhang y Smith 1993; Yan et al. 2004.
[16] Yu et al. 2004.
[17] Lakowicz et al. 1983; Fasano et al. 2003; Ruiz et al. 2003.
[18] Donovan 1969; Wetzel et al. 1980.
[19] Giese y francs en 1955; Grum et al. 1972.
[20] Ichikawa y Terada 1977; Balestrieri et al. 1978; Levine y Feferici 1982; Kueltzo et al. 2003.
[21] Ichikawa y Terada 1977, 1979; Balestrieri et al. 1978, 1980, Levine y Federici 1982.
[22] Solli y Herskovits 1973; Ichikawa y Terada, 1979; Mach et al. 1991; Mach y Middaugh 1994.
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- 114 -
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- 115 -

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NDICE MEMORIA

ndice memoria ..........................................................................................1

4.1.2. Enlaces de los pptidos .......................................................... 35

6.2.1. Definicin de derivada como un lmite ...................................... 73

Las protenas globulares comprenden un grupo de sustancias muy diferentes

1.1. Interpretacin de las estructuras de las

1.1.1. Estructuras cristalinas

errores en las determinaciones de la estructura por rayos-X en las molculas

1.1.2. Conservacin de sus conformaciones nativas

1. La molcula de una protena en un cristal se halla esencialmente en disolucin

2. Una protena puede cristalizar en una o varias formas o "hbitos",

3. La evidencia ms fuerte de que las protenas cristalizadas poseen estructuras

1.1.3. Percepcin ms eficaz en forma simplificada

1.2. Determinacin de la estructura proteica

1.3. Estructura Terciaria

1.3.1. Hlices y hojas

carecen de hlices . Sin embargo, la mayor parte de las protenas poseen

1.3.2. Variacin de la polaridad en las cadenas laterales

1.3.3. Ordenacin por eficacia

070. El interior de una protena es, por tanto, ms semejante a un cristal

1.3.4. Dominios en los polipptidos

Figura 1. Una subunidad del enzima deshidrogenasa del 3 fosfato de

Una cadena polipeptdica oscila hacia atrs y hacia adelante en el interior de un

1 Referencia Figura 1: Fonaments de Bioqumica. Juli Perit/Ramon Sendra.

globular pequea. En realidad, la protelisis limitada de una protena con varios

1.3.5. Estructuras supersecundarias

1. La forma ms corriente de estructura supersecundaria es la unidad , en la

2. Otra estructura supersecundaria corriente, el meandro , est constituida por

3. En una unidad , dos hlices antiparalelas se empaquetan una contra otra,

4. Las hojas extendidas se arrollan frecuentemente para formar barriles . Se

Las estructuras supersecundarias pueden tener significado funcional y

2 Protein Structure and Function. Gregory A Petsko, Dagmar Ringe.

Figura 2. Representacin ideal del dominio al que se une el coenzima

1.3.6. Patrones de plegamiento de protenas

3 Referencia Figura 2: Fonaments de Bioqumica. Juli Perit/Ramon Sendra.

2.1. Fuerzas electrostticas

determinar el trabajo necesario para separar dichas cargas a una distancia

En la que k = 90 x 109 J m C-2 y D es la constante dielctrica del medio en el

2.1.1. Interacciones inicas

2.1.2. Interacciones dipolo-dipolo

Las interacciones entre dipolos permanentes son determinantes estructurales

2.2. Fuerzas por enlace de hidrgeno

energa libre de los enlaces de hidrgeno entre la protena nativa y la protena

2.3. Fuerzas hidrofbicas

La insinuacin de un grupo no polar en el interior de su estructura la altera: Un

Figura 3. Preferencia en las orientaciones de las molculas de agua que

Esta orientacin constituye una ordenacin de la estructura del agua, ya que el

Figura 4. Estructura del clatrato (n-C4H9)3S+F- 23 H2O

Las magnitudes de las variaciones de entropa que se producen cuando las

En las protenas los efectos de las fuerzas hidrofbicas se mencionan, con

2.4. Desnaturalizacin de las protenas

1. Las variaciones de pH alteran los estados de ionizacin de las cadenas

2. Los detergentes, algunos de los cuales perturban de modo significativo las

3. Las concentraciones elevadas de sustancias orgnicas solubles en el agua,

Figura 5. Representacin de las molculas de sacarosa y etilenglicol

El orden de eficacia de los diversos iones en la estabilizacin de una protena,

Figura 6. Representacin de la serie Hofmeister

Los iones de las series de Hofmeister que tienden a desnaturalizar a las

Figura 7. Representacin de la molcula de urea y del in guanidinio

Los agentes caotrpicos aumentan la solubilidad de las sustancias no polares en

3.1. Extraccin y purificacin

2. Si contiene una cadena polipeptdica sencilla o mltiple.

3. El peso molecular de las cadenas polipeptdicas.