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y pruebas bioquimicas
Tema 1 - Microbiologia Clnica
(evolucin histrica, conceptos
generales, organizacin de laboratorio)
Microbiologa - la ciencia que estudia los seres vivos no visibles al ojo
desnudo(microorganismos; aunque se incluyen
metazoos parsitos no microscpicos), queatribuyen el origen de la vida sobre la
tierra y el mantenimiento del equilibrio en la biosfera (en vida libre como saprofitos
o depredadores con distinto grado de simbiosis =>comensalismo, mutualismo o
parasitismo), aunque tambin tienen efectos negativos comoproducir
enfermedades; Los virus y viroides => parsitos endo-celulares obligados (no
se replica en vida libre); Microbiologa medica => estudia a los
microorganismos que afectan al hombre (reino procariota/ bacterias, los eucariotas
del reino Fung, los virus y viroides); Parasitologa => estudia
los eucariotas microscpicas (protozoos) ymacroscpicas (metazoos) de endo o
ectoparsito(los artrpodos estudiados tambin como vectores y reservorios de
enfermedades transmisibles);
Microbiologa medica:
- Microbiologa general => se estudia conocimientos histricos, clasificacin,
estructura y fisiologa de los microorganismos.
- Microbiologa especial => se estudia 4 grupos de agentes
infecciosos(bacteriologa, virologa, micologa y parasitologa) + recientemente los
viroides(moleculas circulares de ARN de bajo peso molecular que carecen de
cubierta proteica) ylos priones (protenas codificadas por genes celulares
y actan como seales reguladoras, responsables de algunas
enfermedades neurolgicas graves - Creutzfeldt-Jacob y el Kuru)
Evolucin histrica de la microbiologa - como ciencia especializada no
aparece hasta finales del siglo XIX; cuatro periodos:
-1 => periodo especulativo (desde la antigedad hasta los primeros
microscopistas)
-2 => desde 1675 hasta la mitad del siglo XIX (descubrimiento de los
microorganismospor Leeuwenhoek en 1675 - constructor de lentes holandes que
invent el microscpio simple)
-3 => periodo de cultivo de microorganismos hasta finales de siglo XIX (Pasteur y
Kochlogro cristalizar a la Microbiologa como ciencia experimental bien asentada.
-4 => desde principios del siglo XX hasta ahora (se
estudian fisiolgica, bioqumica, gentica, ecolgica y surgimiento
de virologa, inmunolgia.
- Redi, Spallanzani y otros fisicos del siglo XVII demostraron que el
microorganismo no se genera espontaneamente (de novo), postularon la teora de
la biognesis (ser vivo nace de otro ser vivo).
- Pasteur (1822-1895) demostr que la fermentacin era producida por
microorganismos en crecimiento.
- Se dobl el interes de muchos naturalistas tras la publicacin de los libros de
Darwin.
- Davaine (1863-1868) encontr grandes cantidades de m.o. en la sangre de las
vacas(bacteridios) y Robert Koch (1843-1910) en 1876 aisl con sus tcnicas de
cultivo puro el bacilo de antrax (Bacillus anthracis); mas tarde Koch y su colegas
confirmaron que las esporas son formas diferenciadas y resistentes de bacilos y
demostraron que la enfermedad poda transmitir sucesivamente a ratones
sanos inoculndose bacilos obtenidos de cultivo puro; basados en los postulados su
maestro Henle, Koch postul siguentes criterios:
- el microorganismo debe estar presente en todos los individuos enfermos
- el m.o. debe poder aislarse del hospedador y ser crecido en cultivo puro
- la inoculacin del m.o crecido en cultivo puro a animales sanos debe provocar
la aparicin de sintomas especficos de la enfermedad en cuestin (cada
enfermedad infecciosa esta causada por un tipo de bacteria diferente)
- el m.o. debe poder ser re-aislado del hospedador infectado de forma experimental.
Las 2 dcadas siguientes, se aislaron una gran variedad de bacterias patgenas; en
Francia el Instituto Pasteur se concentro sobre los procesos infectivos, la
inmunidad del hospedador y la obtencin de vacunas (vacuna antirrbica ensayada
por Pasteur en 1885, contribuye al nacimiento de la inmunolgia).
Conceptos generales y clasificacin - al finales del siglo XIX los
microorganismos se agrupan en un nuevo reino fuera de la teora de Darwin
=> Protistas para los protozoos, las algas microscpicas, los
hongos microscpicos y las bacterias como seres microscpicos; Chatton en
1932 clasifica a los seres vivos en 4 reinos => animalia, plantae, protistas inferiores
o procariotas (bacterias) y protistas superiores o eucariotas (algas, hongos y
protozoos); Whittaker en 1969 agrupa en 5 reinos => animalia, plantae, fungi,
procariotas y protista; Magulis en 1992 los agrupa definitivamente por ahora en 2
superreinos /dominios, 5 reinos y 2 subreinos =>
- Dominio: procaryotae, 1 reino: monera, subreino: archeobacteria y eubacteria
(incluyendo todas las bacterias divididas en grupos)
- Dominio: eucaryotae, con 4 reinos: protista, fung, animalia y plantae (incluyendo
protozoos, hongos, algas, animales y vegetales); protista => son unicelulares
eucariontes pero que no cumplen con las caractersticas para estar en algn otro reino
organismos de este tipo (p.ej. protozoos)
- los virus => un grupo aparte que no se ha integrado en ningn reino y se discute
si son o no seres vivos; es incapaces de reproducirse por si mismos, dependen de
un husped que les proporcione el mecanismo de
la replicacin y sntesis de macromolculas); una vez que han conseguido esto,
salen de la clula infectada produciendo su muerte; hay virus que infectan a celulas
animales, otros a vegetales y otros a bacterias; un virus se define como=> un bloque
de material gentico rodeado por una cubierta proteica que le sirve
como vehculo de transmisin; algunos pueden llevar una envoltura circundante
compuesta de lpidos y carbohidratos; los viroides (30 especies) => agentes
infecciosos (de menor complejidad gentica y estructural conocida) que solo afectan
a plantas superiores; constituidos por 1 cadena de ARN cclica corta que no
codifica protenas; tamao 10 veces menor que los virus (parecen ser una etapa
primitiva de los virus); los priones (proteinceous infectious
particle)=> partculas patgenas de naturaleza proteica sin acido nucleico;
identificados en 1982, aunque desde el siglo XVIII se sospechaba de su existencia;
las enfermedades "prion" en el hombre (encefalopatas espongiformes
transmisibles) afectan al sistema nervioso y se cree que tambin a los musculos.
Organizacin de un laboratorio de microbiologia clnica
Estructura (depende del tamao y caractersticas, espacio que dispone y numero
de personal):
1. reas/ secciones bsicas:
- Seccin de toma de muestras
- Seccin de recepcin y registro de muestras
- Seccin de siembra de muestras
- Seccin de medios de cultivo
- rea de almacn
2. reas/ secciones especializadas:
- Seccin de bacteriologa (se divide en reas => urocultivos, coprocultivos
y parsitos, exudados y anaerobios, hemocultivos)
- Seccin de micobacterias
- Seccin de micologa
- Seccin de antibiticos
- Seccin de serologa o inmuno-microbiologa
- Otras secciones (virologa o biologa molecular)
Tema 3 - Tcnicas de
descontaminacin, desinfeccin y esterilizaci
n
En todo laboratorio de microbiologia se debe tener en cuenta:
- todo material para la recogida de muestra debe estar esterilizado
- todo material para la realizacin de las pruebas debe estar estril
- antes de cualquier esterilizacin, el material debe estar limpio y/o desinfectado
- conviene utilizar material desechable
- el material de uso asptico debe guardarse separadamente del uso sptico
- la limpieza de residuos en el suelo, mesas de trabajo y cualquier superficie se
realiza mediante desinfeccin peridica
- destreza y formacin por parte del personal sanitario de laboratorio
(deben trabajar en condiciones de total asepsia)
- la manipulacin de todo material debe seguir el protocolo de trabajo con medidas
cautelares para la prevencin de accidentes laborales.
- Rayos gamma => para conseguir esterilizacin en fri, producidos por isotopos
radiactivos; presentan un poder de penetracin muy alto, constituyendo
el mtodo de esterilizacin mas utilizado a nivel industrial (materiales de
uso nico o desechable p.ej. guantes, jeringas, catteres, prtesis, vlvulas y que
pudiera alterarse por calor)
- Filtros de Chamberland => son de porcelana porosa, mas caros que los
anteriores y menos utilizados.
Transporte de muestras:
- Metodos convencionales => el mas utilizado es hisopos en tubos
de plstico que llevan incorporados diversos medios de transporte que consiste en
un agar semi-solido, pH regulado, carece de nutrientes, pero contiene tioglicolato
de sodio como reductor, para prolongar la viabilidad de los microorganismos
cuando exista demora entre la recogida y su cultivo; los mas utilizados
=> (1) Medio de Stuart (los exudados farngeos, conjuntivales, nasales y heridas)
que mantiene un pH favorable e impide la deshidratacin de las secreciones
durante el transporte y la oxidacin y autodestruccin enzimtica de
los patgenos presentes (2) Medio de Cary y Blair (muestras fecales) donde
las salmonellas y las shigelas pueden recuperarse hasta 49 das despus de la toma
de muestras y Vibrio cholerae hasta 22 das despus.
[b] Agar Mac Conkey (selectivo para bacilos Gram-) => se siembra por
agotamiento en cuadrantes (puede ponerse un disco de Colistina en el inoculo
para ayudar a la identificacin de E.coli (sensible a colistina - comn en
orinas); crecenbacilos Gram- => Enterobacterias
y tambin Pseudomonas; observaremos las caractersticas de lactosa (+) =>
colonias rojas y lactosa (-) sin cambio de color => rosa.
[c] Agar Citrato de Simmons (solo en algunos protocolos); se siembra
enla lengeta del tubo preparado en pico de flauta; las colonias
consumidoras decitrato (+) => vira a azul y las que no, permanece verde; se
usa para la diferenciacin deEnterobacterias (para diferenciar entre coliformes y
coliformesfecales. Los coliformes fecales no fueron capaces de utilizar el citrato
como fuente de carbono ni a las sales de amonio como fuente de nitrgeno. Los
coliformes no fecales como Enterobacter aerogenes o Salmonella
enteritidis podan utilizar el citrato en este medio dando una reaccin alcalina) en
base a su capacidad de utilizar el citrato (mediante citrato permeasa)
[b] Agar Yersinia CIN => para buscar colonias de Yersinia spp (rosa
clarito- Yersinia pestis, Yersinia enterocolitica y Yersinia pseudotuberculosis.) que
aparece como lactosa (+), sensible a Colistina y bacilos Gram- e
mviles, fermentador de manitol. La inhibicin selectiva de organismos gram
negativos y gram positivos se obtiene mediante cristal violeta (inhibidor de
Gram+), desoxicolato sdico (inhibidor de Gam+) y los agentes antimicrobianos:
cefsulodina, Irgasan (Triclosan) y novobiocina (inhibidor de S.epidermidis).
[c] Agar Campylosel => crecer Campylobacter spp (bacilos Gram- con
flagelos) como colonias pequeas translucidas, sensibles a Nalidixico (especies C.
coli y C.jejuni)resistente a Nalidixico el C. fetus, en fresco aparecen en coma/en S,
ureasa (+) oxidasa (+)catalasa (+); al hacer la prueba del hipurato C.jejuni seran
(+) y C.coli (-); P. hipurato=> un procedimiento cualitativo para determinar la
capacidad de las bacterias de hidrolizar enzimticamente (hipuricasa) el hipurato
sdico que da lugar a acido benzoico y glicina un compuesto de color morado.
[e] Agar McConkey (solo en algunos protocolos) => los coliformes aparecern
como colonias rojas por ser lactosas (+); no es necesario???
[f] Agar TCBS /tiosulfato citrato bilis sacarosa (detectar Vibrio cholerae)
=> aparecen colonias de color amarillo sacarosa (+), oxidasa (+) y son bacilos
Gram- pleomrficos; el extracto de levadura y la peptona proporcionan el nitrgeno
y las vitaminas. El citrato sdico, el tiosulfato sdico, la bilis de buey y un pH
alcalino fuerte inhiben los organismos Gram+ y suprimir los coliformes (inhibidor
para la mayora de las entero-bacterias), favoreciendo el crecimiento de Vibrio
cholerae porque este organismo essensible a los entornos cidos. La alta
concentracin de sodio favorece el crecimiento de Vibrio cholerae que
es halotolerante (tolera el medio salado) y de otras especies de Vibrio, cuya mayora
es haloflica. La sacarosa (+) es un carbohidrato fermentable, y el cloruro sdico
estimula el crecimiento. El tiosulfato sdico es una fuente de azufre y acta con el
citrato frrico como indicador para detectar la produccin de cido
sulfhdrico/SH2. El azul de bromotimol y el azul de timol son indicadores de pH.
En Mc, Vibrio Cholerae es lactosa (-).
[a] Agar Sangre (medio general) => buscamos Streptococcus B hemoliticos del
grupo B (S.agalactiae), que aparecern como colonias pequeas translucidas con
un halo de B hemlisis alrededor de la colonia; son cocos Gram+, catalasa y oxidasa
(-), anaerobio facultativo, prueba de ltex (+).
[b] Agar chocolate => buscamos Haemophilus spp como colonias muy
pequeas grisceas que crecen bien por ser grmenes exigentes en su crecimiento
que requieren factor X y/o V (proceden de la degradacin de la Hb); tambin
podemos colocar discos de factor X y/o V y mirar el satelitismo; al fresco
como coco-bacilos inmviles, Gram-; oxidasa y catalasa variable.
[f] Agar Sabouraud (se puede incluir para detectar Candidas spp)
[c] Agar McConkey => donde creceran Enterobacterias y otros bacilos Gram-.
[a] Agar sangre => crecern casi todo tipo de microorganismos, con
caractersticas hemolticas de algunos de ellos.
[b] Agar chocolate => crecern casi todo tipo de grmenes, sobre todo exigentes.
[c] Agar McConkey => crecern Enterobacterias y otros bacilos Gram- poco
exigentes.
[d] Agar CNA => agar columbia colistina nalidixico (sangre de cordero), selectivo
para Gram (+)
[e] Agar ASA => agar sangre anaerobios selectivo para bacilos Gram- anaerobios
yBacteroides.
3. Agar de Thayer y Martin (Agar New York City) => no permite el crecimiento
de muchos microorganismos, pero si permite aislar gonococos y meningococos
(Neisseria); Comp: agar chocolate/ sangre calentado + formula polyvitex
(vitaminas y aminocidos) + VCAT (vancomicina => inhibe los Gram+, colistina =>
inhibe los coliformes /Gram-,anfotericina =>
antifngico, trimetropinsulfametroxazol => antibitico de amplio espectro).
10. Medio eosina azul de metileno /EMB (Medio Levine) => selectivo y
diferencial, para aislamiento de entero-bacterias Gram- (E.coli, Enterobacter,
Salmonella, Shigella, Proteus, Klebsiella) Comp: alto contenido de
lactosa (indicador fermentadora), eosina azul de metileno (indicador de pH y
inhibidor los Gram+ y las floras de Gram- fastidiosas).
12. Medio Kliger o KIA (Kliger Iron Agar) => medio solido en tubo (color
caramelo); muy semejante y mas utilizado es TSI (triple sugar, iron) + 10 gr de
sacarosa; muy utilizado para la identificacin de entero-bacterias, pruebas de la
lactosa, glucosa, gas y SH2; Comp: lactosa (indicador de L+), peptonas,
glucosa, citrato frrico amoniacal y tiosulfato sdico (componentes para producir
SH2), rojo fenol (indicador de pH); los grmenes productor de SH2+ => Proteus,
Salmonella y Citrobacter; los productores del gas CO2+ => Salmonella y
Citrobacter y E.coli.
16. Medio caldo F-Selenito (selectivo) => medio enriquecido con fosfato para el
aislamiento de Salmonella; Comp: selenito sdico (inhibidor de flora Gram+ y
Gram- excepto Salmonella); despus tambin se hace cultivo con agar SS.
17. Medio agar S-S (color caramelo) => aislamiento de las bacterias patgenas
importantes Salmonella y Shigella; Comp: lactosa (indicador fermentadora de
L),tiosulfato sdico y citrato de hierro (indicador de SH2), sales biliares y verde
brillante(inhibidor bacillos Gram+), rojo neutro (indicador de pH); L+ (coliformes
- E.Coli y Klebsiella) => rojas o rosadas; L- y SH2- => incoloras (tpico
de Shigella); L- y SH2+con la precipitacin de hierro => negro (tpico
de Salmonella).
24. Medio Schaedler con vitamina K3 (caldo o agar solido) => para cultivo
deanaerobios (estrictos y facultativos); La presencia de factores de crecimiento
como el extracto de levadura, la hemina y la vitamina K3 y la adicin de sangre de
cordero permite el crecimiento incluso de las especies ms exigentes.
El agente reductor (L-cistina) y la elevada concentracin de dextrosa en el medio
favorecen el crecimiento
de especies anaerobias p.ej. Lactobacillus, Streptococcus, Clostridios y Bacteroides.
2. Eubacterias Gram+ con 13 grupos (17-29); en este grupo hay los que
provocan patologia humana (la mayoria).
Cocos => genero - Staphylococcus y Streptococcus
Bacilos esporulados => genero - Bacillus (aerobio) y Clostridium (anaerobio)
Bacilos regulares no esporulados => genero - Lactobacillus y Listeria
Bacilos irregulares no esporulados:
- Familia Corynebacteriaceae (genero - Corynebacterium)
Micobacterias:
- Familia Mycobacteriaceae (genero - Mycobacterium)
Para la asignacin de una bacteria, se siguen las normas recogidas por el cdigo
internacional de nomenclatura bacteriana y adquieren validez cuando ha sido
publicado por el Intl Journal of Systematic Bacteriology; bien en un articulo o bien
dentro de los sistemas en las listas de las bacterias aprobadas que incluyen sus
nmeros; una especie bacteriana, viene definida por un nombre genrico de un
nombre especifico latinizado o helenizado y concuerdan gramaticalmente; la inicial
de genero va con letra maysculas y el de especie con minsculas; tanto el nombre
de genero o especie se escriben con letra cursiva/ italica o en su defecto, subrayado;
en la denominacin de un especie, la palabra que define genero puede ser abreviada
a su inicial seguida de un punto (p.ej. E.coli o E.coli); los nombres de las bacterias
no se eligen de manera arbitraria, sino que pueden ser descriptivos, p.ej.
Staphilococcus aureus (cocos en forma de racimos - dorados); o pueden dar
homenaje a un autor p.ej. Pasteurella, Bacilo de Koch, tambin puede dar referencia
a un acontecimiento p.ej. Legionella; el nombre generico es nico; para referirse a
un especie o varios especies no determinadas su genero => E.spp/ sp; algunas de
las categoras taxonomia superiores, se forman aadiendo las palabras que las
asignan distintas terminaciones, p.ej. aceae; para el orden => ales (sufijo) p.ej.
Mycoplasmatales; todas las categoras taxonoma se expresa en cursiva o itlica.
FLORAS BACTERIANAS
Flora Normal de la especie humana => la poblacin de microorganismos
comensales que normalmente coloniza la piel y las membranas mucosas de las
personas adultas sanas; la piel y las mucosas colonizadas por microorganismos
dinmicos => cambios cualitativos y cuantitativos constantemente; 2 poblaciones:
1. La flora residente (FR) => un numero relativamente fijo de especies de
microorganismos (comensales y oportunistas) en una zona definida (si se producen
alteraciones, suelen ser temporales); permanecen intactas; encuentran condiciones
fisiolgicas y nutritivas adecuadas; no es esencial para la vida, pero es normalmente
beneficiosa (produce vitamina K en el intestino y ayudan en la absorcin de
nutrientes y impide la colonizacin de microorganismos potencialmente patgenos.
2. La flora transitoria (FT) => microorganismos no patgenos o potencialmente
patgenos, que colonizan la piel o las mucosas en periodo corto de tiempo; tiene
poca importancia, pero si la flora residente se altera, la flora transitoria puede
multiplicarse y producir infecciones.
La supresin de FR => vaci ecolgico => ocupacin de microorganismos
ambientales o de otras zonas de cuerpo => infecciones.
FR oportunistas => los que tienen acceso a lugares estriles; algunos ejemplos:
- Streptococcus viridans son comensales del tracto respiratorio superior y de la
boca, si alcanza el torrente sanguneo => si vlvula cardaca daada => posible
endocarditis;
- Bacteroides son comensales del intestino grueso => si apendicitis perforada =>
posible peritonitis o bacterimia.
- Infecciones de pacientes inmunodeprimidos por causas diversas (cncer,
leucemias, linfomas, SIDA)
- E.coli es comensal del colon => lugar estril (o no habitual) a traves de uretra =>
infeccin urinaria
Las causas de las interpretaciones errneas => no se toma en cuenta al
microorganismo como patgeno o se le descarta (como mero contaminante); la
omisin o inclusin de una especie en una de las categoras no implica que no
pueda ser aislada en otra zona del cuerpo o que en condiciones especiales, pueda
producir enfermedad.
Tipos de microscopios:
Microscopio de campo oscuro si dentro de la muestra hay elementos
transparentes, con un indice de refraccin diferente al del medio que los circunda,
la luz es difractada e incide sobre el objetivo y pueden ser visualizados; permite la
observacin de seres microscpicos transparentes y no teidos (Treponema
pallidum preparacin en fresco).
Coloracin vital - es una tcnica intermedia entre los exmenes en fresco y las
tcnicas de tincin despus de fijacin previa???; consiste en teir las muestras
bacterianas con colorantes muy diluidos, permite al microorganismo acumular
parcialmente dichos colorantes; la dilucin debe ser muy altas para que no resulten
toxicas para las bacterias, evitando la muerte de tales grmenes; material =>
microscopio, asa de siembra estril, portaobjetos, cubreobjetos, mechero, papel de
filtro, una suspensin de muestra problema,
aceite de inmersin, altas diluciones de colorantes para disminuir su toxicidad (rojo
neutro en solucin acuosa al 1:1.000 o 10 lambas : 10 ml y azul de metileno en
solucin acuosa al 1:1.000 o 1:500).
(2) Tincin negativa => es un tincin simple (1 solo colorante => tinta china o
solucin acuosa de nigrosina al 1%) con diferencias que no necesita fijacin previa
(no mata las bacterias), permite observar caractersticas estructurales de la bacteria
ademas de su morfologa sobre un fondo oscuro, como es la presencia de capsulas
p.ej. los neumococos;se basa en => colorante acido cargado negativamente, los
microorganismos no se tien (se quedan claros y brillantes sobre un fondo teido
oscuro); para obtener una capa fina (para dejar pasar el paso de luz del microscopio
y evitar a formarse grietas al secarse el colorante) se puede hacer una extensin con
el borde de otro portaobjetos; resultado => se observan las capsulas (si las tienen)
en forma de un halo mas claro que rodea el cuerpo de la bacteria.
(3) Tinciones diferenciales => fijacin previa (en general por calor), se utiliza 2
colorantes (el ultimo es de contraste), permite visualizar su morfologa y
caractersticas estructurales (composicion de la pared bacteriana, su resistencia a la
decoloracin cida (t.Gram y t.ZhielNeelsen).
(4) Tinciones estructurales => fijacin previa (en general por calor), se utiliza al
menos 2 colorantes, nos permite observar su morfologa y caractersticas
estructurales como esporas, flagelos, cilios, capsulas, corpsculos metacromticos
(utiliza 1 solo colorante???).
Material => tubo de cultivo (KIA/kliger iron agar y TSI/triple sugar iron), agujas y
asas de siembra, estufa de cultivo, muestras de problema; si se realiza en placa de
cultivo (Hektoen y SS);
Tcnica => a partir de un cultivo puro y reciente de microorganismo problema se
tomara una muestra con una aguja; sembrar en picadura (tubo de KIA o TSI) o con
agotamiento en cuadrante (Hektoen o SS); incubar durante 18-24 horas; si la
tcnica se realiza conBrucella (microaerofila), se debe incubar con una atmsfera
de CO2.
Resultados => SH2 positivo (Salmonela y Proteus) se observa a lo largo de la
linea de inoculacin ennegrecimiento del medio; SH2 negativo (Brucella y
Shigella) no se ennegrece el medio.
Bacteria con enzimas desulfurasas (activada por la fermentacin de azucar) +
indicador de pH/sales de Fe + fuente de S + (H+) => H2S gas + indicador pH =>
precipitado negro insoluble/ puntos negros (FeS)
Material => placa sembrada con microorganismo problema, asa de plstico, papel
de filtro, porta, reactivo oxidasa de Kovacs.
Tcnica => mezclar una pequea muestra pura con el reactivo en el papel de filtro
que se sita por encima de una porta, esperar 30-60 segundos y se observar el
posible cambio de color; otra manera: se aade directamente el reactivo oxidasa de
Kovacs sobre las colonias de la placa Petri con agar sangre y tambin en otro medio;
si son oxidasa positivo toman un color marrn y en seguida pasan a negro
parduzco.
Resultados => oxidasa+ aparece un color purpureo en el papel, si se desarrolla el
color a los 10-60" se considera oxidasa retardado positivo, despus de 60" es
negativo; oxidasa-no se produce color.
Pruebas de catalasa
La catalasa es una enzima que se encuentra en la mayora de los microorganismos
aerobios y anaerobios facultativos que contienen citocromo; es un enzima
fundamental que acta sobre el perxido de hidrgeno /H2O2 (es un producto final
de la degradacin aerobica oxidativa de los hidratos de carbono); si se acumula
H2O2, estos grmenes moriran; fundamento: si el microorganismo tiene el enzima
catalasa y se pone en contacto con H2O2 => se descompone en H2O +
O2; aplicacin => diferenciacin deStreptococcus (-) de Staphylococcus (+) y
Micrococcus (+);
Material => multiprueba de API; reactivo => Nit A y Nit B, Zinc en polvo,
microorganismo; el medio no debe contener azufre ya que si el microorganismo es
productor de H2S (acido sulfhdrico) este impide la formacin de color; tcnica =>
hacemos un inoculo a partir de un cultivo puro reciente de 12-24 horas, inoculamos
el medio; incubar a 37C durante 12-24 horas, agregar 1 gota de Nit A y 1 gota de
Nit B, observar si hay un cambio o no antes de 30 segundos (se interpreta rpido,
ya que el color puede desaparecer); si no se forma color, se aade al tubo un poco
de polvo de Zinc;resultados => hay 2 posibilidades de que
sean Nitratasa+ (Haemophilus y Branhamella Catarallis): [1] cuando aparece
color rojo o rosado fuerte al aadir el reactivo A y B que indica la reduccin de
nitratos a nitritos; [2] al aadir polvo de zink no se desarrolla color indica
formacin de otros productos nitrogenados; Nitratasa- => cuando se forma color
rojo o rosado al aadir polvo de zinc en menos de 30 segundos.
Prueba de Ureasa (se hace en manual y con el sistema API) - detecta la presencia
de la ureasa en los microorganismos cuando se observa la alcalinizacin de un
medio liquido; la ureasa cataliza la hidrlisis de la urea => carbonato amnico, que
sube el pH, con lo que el medio se alcaliniza; aplicacin => diferenciar Proteus
(+) de otras Enterobacteriaceas / E.coli (-) o positivo retardado (+) como
Klebsiella;
Material => tubos de cultivo, asas, pipeta Pasteur, estufa de cultivo o bao mara.
Reactivo => caldo urea de Stuart/ urea-indol (de color mbar) y microorganismo
de problema
Tcnica => con el asa estril se toma una muestra de cultivo puro reciente 18-24
horas; inoculamos el microorganismo en un tubo con caldo urea de Stuart; incubar
37C; la reaccin se produce entre 1-4 horas
Resultados => en ureasa (+) el caldo de color mbar vira a rosa fuerte durante el
tiempo de reaccin (1-4 horas); en ureasa (-) no vira el indicador; algunas cepas de
Klebsiella, Enterobacter, Brucella, requieren 6 das de incubacin.
Prueba de Coagulasa (se hace con el kit comercial que contiene Acs anti
coagulasa) - observar la coagulacion del plasma en forma de grumos o
precipitacin al ponerse en contacto el microorganismo con el reactivo (si se utiliza
el plasma en la prueba); la coagulasa es un enzima producido por microorganismos
capaz de coagular en plasma;aplicacin => diferenciar Staphylococcus
aureus (coco Gram+, catalasa+, beta hemoltico + y coagulasa+) de otro
Staphylococcus; esta prueba solo se hace si el germen es coco Gram+,
catalasa+, beta hemoltico +; tcnica => (usando el kit comercial /prueba de ltex)
seguir la instruccin de la casa comercial que hacen el
reactivo; resultados =>coagulasa+ se observa en forma de grumos (si se utiliza un
plasma como reactivo => se observara la formacin de un hilo de fibrina en la
reaccin) y en coagulasa- no se forma grumos.
2. Derivados de betalactmicos:
* Aztreonam - se utiliza comnmente frente a las infecciones causadas
por Pseudomonas aeruginosa, pero su espectro abarca a
las enterobacterias (incluida Escherichia coli), como p.ej. Klebsiella, Haemophilus,
Citrobacter y Proteus.
6. Otros
* Fosfomicina - es un ATB de origen espaol de un amplio espectro que acta
sobre la pared celular (se usa en infeccin urinaria)
* Acido fucsidico - acta sobre la sntesis proteica y destaca su accin
sobreStaphylococcus aureus.
Estudio de la orina
Funcin del rin:
- La eliminacin de nuestro organismo de una importante cantidad
deresiduos metablicos, muchos de ellos intiles, y de otros que incluso
pueden comportarse como txicos.
- La regulacin de la composicin de los fluidos de nuestro organismo
facilitando as, tanto la supervivencia de las clulas como el optimo desarrollo de
todos los procesos metablicos.
- El control hormonal de la presin arterial (adrenalina, noradrenalina)
- El control de los niveles orgnicos del calcio (mineral corticoides aldosterona, 1,25
dihidroxicolecalciferol)
- El control de la eritropoyesis (eritropoyetina)
El orden cronolgico de
un anlisis general=> caractersticas fsicas macroscpica - sedimentacin (a
1500 rpm durante 10-15 minutos) - pruebas bioqumicas (tiras reactivas); la
muestra sobrante se debe guardar hasta que la analtica haya concluido; hay que
revisar los resultados del sedimento concuerdan con las pruebas qumicas y
comprobar las anomalas detectadas han sido confirmadas.
Estructuras organizadas
- Hemates: pueden proceder de cualquier parte del sistema renal; en gran
numeroindica infeccin, traumatismos, neoplasias y litiasis renal; presencia normal
de 1-2/campo o como una contaminacin menstrual; pueden confundirse con
levaduras y cristal de oxalato clcico monohidratado; con tincin Gram se
diferenciar => los hemates son teidos de rojo, levaduras de violeta y cristales
incoloros; es importante distinguir entre macro-hematuria (se ve en el sedimento
de color rojizo) y micro-hematuria (nicamente se detecta al
microscopio), tambin si el color rojo observado macroscpicamente procede
de hemates o Hb (al centrifugar el sedimento, el color rojizo de Hb permanece).
- Celulas tubulares /renales /cuboideas: son de tamao 1/3 mayores que los
leucocitos; su forma normal es redonda con ncleo grande y cntrico; un
sedimento normal 0-1/campo; aumentado en pielonefritis y glomerulonefritis.
Estructuras no organizadas
Cristales: en general son productos finales del metabolismo que adoptan formas
cristalinas segn la condiciones fsico-qumicas de la orina (la pH sobretodo,
densidad, temperatura, etc.) y se excretan a nivel urinario; se diferencian en 3
grupos:
(1) Cristales endognos normales - no corresponden a alteraciones metablicas ni
funcionales, muy frecuente en el sedimento y pueden aparecer en
orinas recin emitidas.
(2) Cristales endognos patolgicos - reflejan
trastornos metablicos o afectacin grave de algn rgano o sistema y muy raras
veces aparecen en orina.
(3) Cristales exgenos - aparecen en la orina tras la introduccin en el
organismo(va enteral o parenteral) diversas sustancias (contrastes radiolgicos/
contraste radiopaco va endovenosa y medicamentos p.ej. sulfonamidas, etc.)
- Cristales de acido rico: en orinas cidas; son birrefringentes; de formas
variadas(p.ej. agujas); color entre marrn rojizo, el amarillo e incluso incoloros;
indica una situacin patolgica o concentraciones elevadas de acido rico; un
sedimento normal 0-2/campo.
- Cistina: en orinas cidas; tiene significacin clnica por si solos => aparecen
comoconsecuencia de cistinuria; aspecto incoloro con forma de
placas hexagonales, regulares finas y transparentes; es imprescindible una vez
observados en el sedimento, confirmar la concentracin de cistina en la orina.
Examen citolgico:
- celulas hematolgicas => se redactan con nmeros y abreviaturas (p.ej. 6-8 L/C =
no.leucocitos por campo); se informa si existe piuria y hematuria y si se
forma acmulos.
- celulas epiteliales => se redactan con adjetivos: escasas (algunas 1-3) -
moderada (3-4) -abundante (6-8) - intensa (muy abundante 10-12); las
importantes son las renales y las de transicin; las celulas escamosas (de
las vas bajas), se informan cuando son abundantes.
- cilindros: se redactan al igual que las celulas; es importante identificarlos
e indicar en el informe el tipo de cilindro.
Examen qumico (en un sedimento de orina normales, es frecuente no incluirlos
en el informe):
- cristales => se redactan con adjetivos; cuando son muy abundante, se habla de
"diatesis".
- compuestos amorfos => se redactan con adjetivos
Examen microbiolgico:
- bacterias => se redactan con adjetivos; es necesario especificar el tipo de m.o. y su
movilidad
- levaduras => se informa con adjetivos.
Clasificacion
A. segn el tipo de hemolisis (capacidad de romper hemates -
produce hemlisis alrededor de sus colonias en AS) => gamma hemoltico,
alfa hemolticos/ hemlisis parcial (decoloracin parda verdosa -
S.viridans);beta hemolticos/ hemlisis total (halos de transparencia grandes
entorno a su colonia) -grupos A, B, C, D (enterococo) G y F; estreptococo NO Beta-
hemolticos - grupo D,S.viridans y S.pneumoniae (alfa y gamma)
(4) Streptococcus del grupo D => son alfa, beta y gamma hemolticos;
resistentes a agentes externos y ATB;
- los enterococos => S.faecalis y S.faecium; son saprofitos del intestino del
hombre;crecen bien en NaCl 6,5% (a diferencia de los NO enterococos); hidrolizan
la bilis esculina; son alfa-beta-gamma hemolticos; resistente a la bacitracina;
puede producir infeccin urinaria e herida.
- los No enterococos => S.bovis, S.equinus y S.anginosos (afecta vacas y
caballos);hidrolizan la bilis esculina; resistente a la bacitracina;
Caractersticas antignicas:
- Ag somtico / Ag O => es lipo-polisacrido, termo-estables, se encuentra en la
pared bacteriana, es una endo-toxina (la parte polisacrido es muy antignico y la
parte lipdica es inactiva bioqumica-mente).
- Ag capsular / Ag K => se encuentra en la capsula bacteriana, es polisacrido, es
anti-fagocitaras (relacionado con la virulencia de ciertas especies como E.coli K-
1 y Salmonella thyphi).
- Ag flagelar /Ag H => es caracterstico de las cepas mviles, es proteico y
responsable de la accin patgena de la bacteria.
Cuadros clnicos
1. Infecciones entricas (S.typhi - fiebres tifoideas o S.paratyphi A,B o C -
para-tifoideas); Las fiebres tifoideas son transmitidas al hombre va oral (alimentos
crudos, poco hechos, mal conservados y aguas contaminadas), llega al estomago,
resiste la acidez gstrica, pasa al intestino delgado (leon), penetra por endocitosis
destruyendo parte de las celulas de la mucosa intestinal; una vez dentro las
salmonellas son fagocitadaspor macrfagos y transportadas por
diferentes vas y provoca bacterimia => todo sucedeen el periodo
de incubacin (8-15 das); comienzo brusco de signos y sintomas
=>los macrfagos les transportan hacia el bazo, higado y MO,
produciendo multiplicacin de nuevas salmonellas, volver al intestino
generando placas ulceradas, necrosacin de placas de Peyer y en casos mas graves
originar perforacin y hemorragias.
Las fiebres para-tifoideas son mucho mas leve con un periodo de incubacin de
entre 7-10 dias con bacterimia y estado febril que dura varias semanas; no
hay perforacin intestinal ni hemorragias ni invasin de salmonellas a
otros rganos;cuadros clnicos => dolores de cabeza, fiebres altas, anorexia,
astenia/ cansancio; preciso un tratamiento que dura 9-10 das.
2. Infecciones gastrointestinales y enterocolitis (S.enteritidis - la mas
frecuente,S.choleraesuis, S.typhimurium y otras); periodo de incubacin 12-
36 horas; se transmite por alimentos contaminados
con una concentracin de salmonellas de 10 millones a mil millones/ml, depende
de tipo de la cepa; el alimento les facilita su llegada a pasar el estomago y llegar al
intestino delgado colonizando el leon y el ciego, se penetran por fagocitosis al
epitelio y se multiplican originando una inflamacin que genera cuadros diarreicos
con dolor abdominal (perdidas de electrolitos y agua), fiebres altas,
nauseas, vmitos; re quiere un tratamiento de re-hidratacin que dura 6 das - las
floras se encargan de eliminarlas.
Accin patgena e inters clnico - los cuadros clnicos son variables segn el
tipo de toxina que originen; algunas cepas de E.coli forman Ag O y K anti-
fagocitaras yresistencia a bactericidas y ATB (alto poder invasivo); otras cepas
forman endo-toxinas, causante de cuadros febriles y diarreicos; otras cepas tienen
un mecanismo de accin anlogo al de Shigella con menor gravedad; a veces
la entero-toxina que producen es parecida a la de Vibrio cholerae que causa perdida
masiva de agua y electrolitos.
- si la cepa de E.coli forma una entero-toxina citotxica parecida a Shigella =>
cuadros diarreicos en brotes epidmicos que afectan a nios y lactantes
(E.coli entero-patgena)
- si forma una entero-toxina semejante a Vibrio cholerae => procesos diarreicos en
nios, adultos, originndose espordica-mente brotes epidmicos (diarrea del
viajero - E.colientero-toxgena)
- si forma una entero-toxina citotxica similar a S.disenteriae => procesos
diarreicos graves, hemorragico espordicamente en brotes (E.coli entero-
hemorragica)
- si presenta ciertos plsmidos que incrementan su capacidad de invasin =>
cuadros diarreicos graves que afectan a nios, adultos con brotes epidmicos en
casos aislados (E.coli entero-invasiva)
Las cepas de E.coli se distingue con sueros antignicos; E.coli tambin puede
provocar infecciones urinarias (cistitis, pielonefritis, etc), infecciones biliares,
heridas, meninges (meningitis en neonatos).
Aislamiento, pruebas bioqumicas - diagnostico
Toma de muestra representativa de alimento, agua, heces, exudado; frotis de Gram;
medios de cultivo Mc, Levine; pruebas bioqumicas => lactosa+, indol+, citrato-
, sensible a la Colistina.
Para que se produzca el ttanos es necesario una serie de condiciones tales como
que el microorganismo germine (condiciones adecuadas de anaerobiosis); tras una
herida profunda (cortante, punzante, mordeduras, araazos, partos, abortos,
quemaduras, ulceras por decubito) o herida superficiales (rozaduras) se pueden
infectar y formar costra que facilita la infeccin anaerobia; en las condiciones
favorables de anaerobiosis, las esporas de Clostridium tetanii en el ambiente pasan
a la herida, germinan y tras un periodo de incubacin (5-7 das), se origina
su accin patgena; es rara que se produzca de forma local en la zona de entrada; la
forma generalizada es mas habitual y mas grave; es importante la deteccin precoz
y medidas profilcticas (vacunacin se renueva cada 10 aos).
Genero Borrelia - son espiroquetas de mayor tamao con espiras mas amplias e
irregulares con extremos afilados y son mviles; las especies patgenas para el
hombre y los animales, originan fiebres recurrentes endmicas y epidmicas;
es microaeroflica con un metabolismo fermentativo; se tien con facilidad de
Gram- y se puede cultivar in vitro, pero requiere medios muy especficos; las
especies mas importantes del genero Borrelia, se transmiten por piojos y por
garrapatas.
Accin patgena e inters clnico - las fiebres recurrentes son una enfermedad
muy cosmopolita, en ocasiones endmica a condiciones de salubridad muy baja;
tras la picadura del vector, ya sea garrapata o piojo, pasan las borrelias a la sangre
del husped, ayudadas por el rascado que provoca el aplastamiento del piojo
/garrapata, que dar lugar a micro-traumas en la piel y facilitan el paso de dichas
borrelias; despus de unos7 das de incubacin se originan fiebres, dolores
musculares, cefalea, etc; clnica que dura unos 10 das y luego desaparecer,
produciendo posteriormente recurrencias; no es una enfermedad grave y es fcil de
tratar, especialmente con tetraciclinas.
Genero Leptospira - son espiroquetas muy finas con espiras regulares, muy
numerosas y apretadas, con sus extremos ligeramente incurvados y mviles; se
tien dbilmente con Gram, tambin se pueden teir con Giemsa; su metabolismo
es oxidativo (crecimientoaerobio); existe en la naturaleza leptospiras saprofitas y
parsitas; puede originar de forma casual leptospirosis en el hombre con cuadros
febriles; el reservorio son animales, consideradas como zoonosis.
Genero Campylobacter - son bacilos Gram- cortos con forma de coma, espiral o
alas de gaviota (en cultivos jvenes); son microaeroflicos, mviles por
un nico flagelo polar; no fermentan los carbohidratos, oxidasa+ y catalasa+;
habitan el tracto gastrointestinal de muchos animales; en el hombre se asocian
a infecciones gastrointestinales (via de entrada oral/ digestiva), fundamentalmente,
y cada vez en mayor grado a infecciones extra-intestinales (meningitis,
endocarditis, artritis sptica), especialmente en pacientes con SIDA.
Metodos indirectos:
- Prueba de la urea rpida (de Christensen) => un trozo de biopsia se inocula en un
medio con alta concentracin de urea y un indicador de pH.
- Prueba de la urea respiratoria => el paciente ingiere urea marcada y tras un
periodo de tiempo se mide el nivel de CO2 espirado; se puede emplear urea
marcada con C13, que se detecta con un espectrofotmetro de masas y urea
marcada con C14 detectada con un contador de centelleo
(un mtodo diagnostico rpido y no invasivo, pero requiere un equipo especial par
al lectura).
- Prueba serologa => para detectar Acs utilizando la tcnica de ELISA.
Tema 26 -
VIROLOGA CLNICA (caractersticas genera
les de los virus)
Introduccin - virus es un parsito intracelular estricto que requiere infestar
una clula para sintetizar sus componentes y ensamblar nuevos viriones; son de
muy pequeos tamaos (filtrables) y se caracteriza por su mecanismo
de replicacin, organizacin y composicion; virologa clnica se remonta al siglo
XX y la composicion de un virus fue determinada por Schlesinger en 1933; en
los ltimos aos se han descubierto otros agentes infecciosos mas simples como los
viroides y los priones;
- los viroides => moleculas circulares de ARN de bajo Pm sin cubierta
proteica que causan enfermedades a las plantas, infectar a los hombres y animales;
- los priones => son protenas que parecen estar codificadas por genes celulares
y actan como seales reguladoras en las celulas que invaden, resistentes a los
procesos fsico-qumicos que inactivan a los virus y no producen respuesta inmune
o inflamatoria en el husped; provocan prurigo lumbar de las ovejas y cabras
(scrapie), encefalopata espongiforme en las vacas y enfermedades neuro-
degenerativastransmisibles en el hombre (p.ej. Creutzfeldt-
Jacob /encefalopata espongiforme progresiva y sndrome de Gerstman-
Straussler-Streinker y el kuru); la patogenia (de todas)se caracterizan por
desordenes progresivos como ataxia (dificultad motrica), demencia, deterioro
cognitivo y motor; tras un periodo de incubacin largo (meses o
aos), aparecer los sintomas clnicos; el tropismo de la infectividad es SNC,
seguido por el bazo y ndulos linfticos; en el cerebro se
detecta acumulacin anormal de protena-prion en el genoma del husped; los
priones son resistentes a las proteasas e induce una degeneracin neuronal.
Concepto de virus - es un bloque de material gentico (ADN o ARN) rodeado de
una cubierta protena (cpside) que le sirve como vehculo para su transmisin;
algunos presenta membrana lipdica (envuelta) que se adquieren de la
membrana citoplasmtica de la clula infectada durante el proceso de salida; los
virus envueltos tienen un matriz proteica que sirve como puente entre la
nucleocpside y la envoltura; carecen de organelas citoplasmticas para crecer y
multiplicarse, por lo que necesitan la maquinaria de una clula husped, pero
si poseen algunos enzimas (nucleasas, transcriptasas, etc.); virin es
la partcula viral completa (genoma + nucleocpside); se clasifican por el tipo
de husped que parasitan (virus animales, vegetales, bacterifagos)
Virus ARN
1. De simetra cubica o icosaedrica sin envuelta - mono-catenario de
polaridad (+) que utiliza su propio ARN como mensajero (pueden ser
inmediatamente traducidos por la clula husped ya que no se necesita transcribir
ARNm) con la excepcin de Reoviridae(bicatenarios) que utilizan su propia ARN
polimerasa para transcribir ARNm; todos se ensamblan en el citoplasma de
la clula husped y son resistentes al ter.
- Familia Reo-viridae => tamao intermedio (60-80 nm de dimetro),
los nicos bicatenarios; el mas importante para el hombre es
el Rotavirus (provoca problemas diarreicos), tiene forma redonda.
- Familia Calici-viridae => son pequeos (35-39 nm), tienen poca importancia en
microbiologa clnica; el mas importante /patgeno para el hombre es el virus de
Norwalk (productor de gastroenteritis) y el virus de Hepatitis E (su inclusin no
es definitiva)
- Familia Picorna-viridae => son pequeos (20-30 nm); los gneros mas
importantes son los Enterovirus (>70 enterovirus que incluyen el Poliovirus,
Echovirus, Cosxackievirusy el virus de la hepatitis A) y los Rhinovirus (>100
rhinovirus).
- Familia Parvo-viridae => de tamao muy pequeo 18-26nm con genoma ADN
mono-catenario; la mayora no tienen importancia clnica, excepto parvovirus
B19, pertenece al genero Parvovirus que causa eritema infeccioso.
- Familia Papova-viridae => son de tamao pequeos 45-55nm con ADN de tira
circular; el genero mas importante es el Papilomavirus o virus de las
verrugas con 66 tipos depapilomavirus humanos (PVH); los Papovavirus en general
producen enfermedades latentes y crnicas y algunos son oncognicos.
c. De simetra compleja
- Familia Pox-viridae => son virus animales mas grandes 230x400nm de forma
ladrillo o ovoide; se caracteriza como la nica familia de virus ADN que se replica y
ensambla en el citoplasma, pues contienen una RNA polimerasa ADN
dependiente (no necesita la maquina nuclear), de hecho su replicacin es posible en
celulas a-nucleadas (sin ncleo); son resistentes al ter y poseen una doble
envuelta (una la adquieren en el aparato Golgi y la otra en la
membrana citoplasmtica; los mas importante son virus de la viruela, virus de la
vacuna o vaccinia y virus del molluscum contagiosum.
Principales familias de virus de inters clnico
1. Virus ARN (mono-catenario)
1.1. Familia Reo-viridae (tamao mediano 60-80nm - icosaedrico - sin envuelta
- se ensamblan en el citoplasma) - contiene 6 gneros, nicamente cabe
destacar Rotavirus)
Rotavirus (forma de rueda - el nico bicatenario) => descubiertos en 1973 en
nios con gastroenteritis; el nico con importancia clnica (agente causal
degastroenteritis espordica y epidmica en lactantes y nios; la infeccin suele
ser asintomtica en neonatos; afecta principalmente a nios entre 6-24 meses; la
prevalencia mxima en invierno y raramente en verano; periodo de incubacin 1-
3 das, precediendo los vmitos a la diarrea que suele mantenerse de 4-5 das; el
virus se detecta en heces (dura bastante horas fuera del husped)
1.5. Familia Retro-viridae (de tamao grande +/- 100nm - icosaedrica - con
envuelta - de polaridad+ - se ensamblan en el citoplasma) => poseen enzima
transcriptasa inversa / retro-transcriptasa; a esta familia pertenece el virus de la
inmuno-deficiencia humana VIHque se estudia aparte.
Estructura se distinguen una serie de estructura del virus que dan lugar a
losmarcadores serolgicos:
-Ag de superficie => HBsAg o Ag Australia (marcador de infecciosidad, codificado
por el gen S) que induce a la formacin de HBsAc o anti-HBs que confiere
inmunidad.
-Ag del core o nucleo-cpside => HBcAg codificado por el gen C que no se detecta
en sangre pero si su HBcAc (marcador epidemiolgico que se mantiene de por
vida); IgM-HBcAc se detecta como marcador ms fiable de hepatitis B aguda.
-Ag soluble => HBeAg que induce al HBeAc (HBeAg es el marcador de
pronstico de la enfermedad, ya que se correlacionan con el nivel de replicacin del
virus; HBeAc es unmarcador de buena evolucin).
-Adems se distinguen su genoma ADN y una polimerasa.
- El virin completo se denomina partcula de Dane, ya que existen formas
incompletas en sangre (como p.ej. HBsAg).
Tipos de infeccin:
1-Coinfeccin => infeccin simultneamente por ambos virus (VHB y VHD); el
curso natural de VHB no se modifica; al resolverse la infeccin de VHB, re resuelve
tambin la de VHD; clnicamente la hepatitis es ms grave y la tasa de hepatitis
fulminantes es mayor (hasta 20%).
2-Sobreinfeccin => cuando el VHD sobre infecta a portadores crnicos de VHB;
aqu sise modifica el curso natural de VHB y la mayora de las sobreinfecciones
(70%) desembocan en hepatitis crnica y acaban en cirrosis entre 15-20 aos.
El pronstico de VHD depende de marcadores de replicacin del virus (anti-HBe)
=> puede acabar en hepatitis crnica o cirrosis; cuando no hay marcadores
de replicacin => puede evolucionar a la curacin.
DIAGNOSTICO DE LA INFECCION
A-Hepatitis Aguda
Marcadores de rutina (los que se suelen pedir al laboratorio):
VHA => anti-VHA IgM
VHB => HBsAg o Ag Australia y HBc IgM
VHC => anti-VHC (totales)
VHD => anti-VHD IgM (en pacientes ADVP)
B-Hepatitis Crnica
Marcadores de rutina:
VHB => HBsAg y anti-HBc total (IgM + IgG)
VHD => anti-VHD total (en pacientes ADVP positivos para HBsAg)
VHC => anti-VHC
Criterios de interpretacin:
-La presencia de HBsAg y anti-HBc total asociada a hepatitis crnica => es
diagnostica de hepatitis B crnica; la presencia adicional de anti-VHD total =>
indica una sobre infeccin crnica por ambos VHB y VHD.
-La presencia de anti-VHC asociada a hepatitis crnica => es altamente indicativa
de hepatitis C crnica, aunque no es un diagnostico seguro; la deteccin de ARN
viral en suero mediante PCR ayuda a establecer el diagnostico, pero un resultado
negativo aislado no lo descarta, ya que la viremia es intermitente en muchos
casos; dado el alto costo de mtodos de confirmacin de anti-VHC, se considera que
una re comprobacin del resultado positivo mediante un segundo mtodo de
cribado (mtodo screening con tcnica de ELISA) que utilice Ags obtenidos por
tecnologa diferente, es suficiente para establecer la presencia de anti-VHC en
pacientes con hepatitis crnica.
VIH o SIDA
b) Reguladores => genes que regulan la replicacin viral y el papel de todos ellos
no est completamente dilucidado
Epidemiologia las vas de transmisin del virus => por sangre, sexual y
vertical-perinatal; en Espaa la tasa de transmisin por sangre es importante (el
principal grupo afectado son los UDVP/ ADVP y homosexual), a diferencia de
Francia o EEUU, donde los mas afectados son homosexuales; en cuanto a las tasas
de transmisin madre-hijo oscilan 15-50%, cobrando una especial importancia en
frica; la transmisin al personal sanitario o similar es 0,2% y requiere contacto
con mucosas de la sangre o liquido corporal infeccioso (o tambin de lquidos
donde se haya cultivado al virus).
Sintomatologa clnica de SIDA desde que una persona se infecta hasta que
se desarrolle la enfermedad, suele transcurrir 6-10 aos; el estudio de la evolucin
de SIDA puede realizarse por las manifestaciones clnico que van apareciendo o por
marcadores bioqumicos (el descenso de la cifra de linfocitos T4); a partir del
1996 la determinacin de la cantidad de virus circulante en la sangre de la persona
infectada (carga viral) se ha convertido en principal marcador de la evolucin de la
enfermedad.
Fases de la enfermedad
(1) fase de la infeccin aguda => la mayora de los pacientes experimentan al cabo
de unas 3 semanas de haber infectado con el virus una serie de sntomas
pseudogripales como fiebre, cefalea, eritema, adenopatas y sensacin de mal
estar, desaparecen despus de 1-2 semanas; durante esta fase, el VIH se multiplica
a gran velocidad; en un primer momento se produce un descenso de la cifra de
linfocitos (total), pero dentro de poco alcanzan las cifras normales en respuesta de
una activacin del sistema inmunolgico; los individuos son altamente contagiosos
durante esta fase;
(2) fase asintomtica que puede durar 10 aos o incluso mas; durante este periodo,
el virus continua replicndose, causando destruccin progresiva del sistema
inmune; durante esta fase, el recuento de los linfocitos es normal;
(3) fase sintomtica precoz, se suele iniciar el desarrollo del sntoma clnico
caracterstica de la enfermedad; apareciendo infecciones oportunistas de carcter
leve p.ej. de tipo viral => CMV, Herpes zoster, de tipo bacterianas
=> Mycobacterium, Legionella, infestacin de parsitos => Pneumocystis
carinii, Cryptosporidium, algunos hongos => Aspergillus yCndida;
(4) fase avanzada en la que aparecen infecciones y tumores, definitorios del
SIDA(sarcoma de Kaposi) que adems, puede complicarse con un cuadro
neurolgico (demencia del SIDA) con alteraciones motoras y del rea cognitiva,
debido a la accin directa del virus sobre SNC; la supervivencia media de los
pacientes con la SIDA ya desarrollado suelen ser 18-125 semanas, dependiendo del
tipo de infeccin que tenga; en ningn caso habr supervivencia cuando estn en
esta fase.
**) El Western Blot es ms utilizado y permite diferenciar los Acs frente a las
distintas protenas del virus; tiene distintos criterios para la interpretacin de los
resultados (OMS, CDC, Cruz Roja) y los resultados se clasifiquen en:
-Positivos => lo ms aceptado es que haya bandas de envoltura (g41, gp120 y
gp160) y adems bandas del core (p24, p31 y p66) o de la polimerasa o de ambos.
-Indeterminados => se detecta la presencia de alguna banda frente a alguna
protena del virus (solo algunas protenas del core en pacientes con lupus y factor
reumatoide).
-Negativo => ausencia de banda o que no se corresponde a ninguna del virus (a
estas personas se hace un seguimiento durante 6 meses, para descartar que no sean
falsos negativos).
La tcnica de WB consiste bsicamente en la incubacin de unas tiras de
nitrocelulosa en los que sean transferido las protenas de los virus, bsicamente las
estructuras con el suero del problema durante un tiempo que oscila 2-4 horas hasta
los 18 horas; tras cual se revela la presencia de Acs frente a diferente protenas del
virus mediante diferentes tcnicas inmuno-enzimticas dependiendo del
fabricante; el resultado ser la aparicin de bandas coloreadas de mayor o menor
intensidad en el lugar de la tira donde estn situadas las protenas de VIH contra
las cuales existen Acs en el suero del problema; la lectura puede hacerse de manera
manual, comparando las bandas con un control (+) o de manera automatizada por
densitometra; recordar en valores absolutos, la cifra de CD4 900-1500
linfocitos/m3 de sangre (en valores relativos 35-45%); las de CD8 600-900
linfocitos/m3 de sangre; cuando la cifra de CD4 disminuye por debajo de las 200-
400 linfocitos/m3 de sangre, ser indicativo de SIDA.
*) Los mtodos de cribado (ELISA) son ms sensibles y ms especficos, siendo lo
ms novedoso los de 3 generacin con capacidad de detectar IgG e IgM, acortando
el periodo de ventana.
*) Las tcnicas de centros especializados => cultivo y PCR; la PCR es una tcnica
con mucho futuro que presenta una enorme sensibilidad y especificidad, pero no
estn al alcance de la mayor parte de los laboratorios; una importancia aplicacin
de estas tcnicas es el diagnostico de hijos y madres portadoras del VIH.
- Aglutinacin en ltex => a las moleculas de ltex se les une varias molculas de
Acs conocidos y cuando se pone en contacto con una solucin que contiene el Ag (la
muestra problema) se origina una aglutinacin que puede visualizarse; es
una tcnica sencilla, sensible, re-producible y barata. Su sensibilidad depender de
la pureza del Ac utilizado.
- Inmunofluorescencia directa (IFD) => el Ag unido a una fase solida, en este caso
un portaobjetos, se pone en contacto con el Ac marcado con una sustancia
fluorescente (p.ej. isocianato de fluoresceina, rodamina, europio, etc.); tras un
periodo de incubacin, se lava para eliminar el exceso de Acs y se observa al
microscopio de luz ultravioleta; esta tcnica nos permite demostrar no solo
la reaccin Ag-Ac, sino tambin la localizacin exacta donde se produce (superficie
celular, citoplasma, ncleo...).