UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAR ARMADAS ESPE

DEPARTAMENTO CIENCIAS DE LA VIDA Y AGRICULTURA

INGENIERA EN BIOTECNOLOGA
Biologa Molecular III

Nombres: Criollo Miguel, Morillo Andrea, Suquillo Nadia, Vargas Kathya

NRC: 1659
Fecha: 28/11/2016

TEMA: Enzimas de Restriccin

INTRODUCCION

Las enzimas de restriccin son endonucleasas que reconocen una

secuencia entre 4-8 pb en el ADN. El sitio de reconocimiento se llama
sitio de restriccin, la enzima rompe un enlace fosfodister tanto en
la hebra de arriba como en la hebra complementaria. Estas enzimas
se encuentran en muchas especies de bacterias, donde funcionan in
vivo como parte de un sistema de restriccin y modificacin (sistema
R/M). Este sistema es anlogo a un sistema inmune, y le permite
distinguir a la bacteria entre su propio ADN y el ADN exgeno
(Herverg y Barcia, 2007).

BamHI es una endonucleasa de restriccin tipo II, aislada del

microorganismo Bacillus amyloliquefaciens H, que tiene la capacidad
para reconocer secuencias palindrmicas cortas (6 pb) de ADN y
escindirlas en un sitio diana (Segal, 2005).

La BamHI se une a la secuencia de reconocimiento 5'-GGATCC-3 ', y

escinde estas secuencias justo despus de la 5'-guanina en cada
hebra; es decir que hidroliza los enlaces fosfodister que unen las
bases G y G de cada hebra. Segn (Kenneth, 2008) esta escisin da
como resultado, extremos pegajosos, de modo que los cortes son
escalonados y dan lugar a la formacin de fragmentos de ADN cuyos
extremos tienen una corta regin monocatenaria complementaria.
Los extremos pueden permanecer asociados por puentes de
hidrgeno o desnaturalizarse (segn sean las condiciones de
salinidad, temperatura, etc.).

BamH I genera extremos que son compatibles con los fragmentos

(GATC) generados por Sau3AI, BglI, BamHI, BclI et XhoIl (Segal, 2005).
 REBASE

Fig. 1 Ventana principal de REBASE

Fig. 3 Informacin de la secuencia de

Fig. 2 DNA de
DNA obtenida de GenBank
B.amylolicuefaquefaciens con los
genes de metilasa, grupo control y
endonucleasa

Fig. 4 Secuencia en formato

FASTA del gen de BanH I Fig. 5 Secuencia protica de BanH I en
formato FASTA
En REBASE podemos encontrar informacin general de la enzima
como: el nombre de la bacteria de la cual fue aislada, la secuencia de
reconocimiento y el sitio donde se dar la escisin, la temperatura a
la que se debe trabajar, si presenta o no actividad estrella, etc.

Tambin existe la opcin que muestra grficamente la secuencia de

ADN de B.amylolicuefaquefaciens, la cual tiene una longitud de 3014
pb, se observan tambin los genesde la metilasa, del grupo de
control y de la endonucleasa.

El gen de la metilasa se ubica a partir de la base 351 hasta la base

1622, entre las bases 1656 y 1964 se encuentra el gen del grupo de
control y a partir de la base numero 1981 hasta la 2622, con tamao
de 642 pb, se encuentra el gen de la BamHI y ya la protena en s
tiene un tamao de 213 aa.

Fig. 6 4 Grfico de frecuencias para sitios de reconocimiento en diferentes

organismos

Con el grfico que muestra la frecuencia de sitios de reconocimiento

en genomas secuenciados de diferentes organismos, se pude ver que
la frecuencia mxima para la BamHI es de 434 sitios en
Thermoplasma acidophilum.

Fig 7 Listado de enzimas similares a la

BamH
 Como se muestra existen ms
enzimas que pueden generar
fragmentos compatibles a BamHI
pero que no se encuentran
disponibles comercialmente.

APLICACIONES

Introduccin:

Las endonucleasas de restriccin son las herramientas bsicas de la

biologa molecular. Muchas de ellas muestran actividad estrella en
diferentes condiciones de digestin del DNA incluyendo los ptimos.
Para cuantificar esta propiedad se propone el concepto de ndice de
Fidelidad (FI) que se define como la relacin de la cantidad mxima
de la enzima que no muestra actividad estrella con la cantidad
mnima necesaria para la digestin completa en el sitio de
reconocimiento relacionado para cualquier endonucleasa de
restriccin particular (Roberts, 2005).

Se conoce que las enzimas de restriccin (RE), en condiciones no

ptimas, escinden secuencias similares, pero no idnticas, a sus
secuencias de reconocimiento definidas, a esto se denomina actividad
estrella y existen muchas enzimas con este tipo de actividad, entre
ellas la BamHI.

Experimentalmente, se ha encontrado que las siguientes condiciones

generales pueden aumentar la actividad estrella: alta concentracin
de glicerol (> 5%), alta concentracin de enzima con respecto a ADN
(normalmente> 100 U de enzima por microgramo de DNA), baja
resistencia inica, pH alto, presencia de disolventes orgnicos (tales
como DMSO, etanol) y la sustitucin de Mg 2+ con otros cationes
divalentes (Mn 2+, Co 2+) (Samuelson, 2006).

Los productos de esta actividad son mucho menos predecibles que la

actividad afn lo que hace que sea indeseada, porque por ejemplo en
casos de clonacin las ER generan extremos compatibles para la
ligacin, pero la actividad estrella puede introducir cortes no
deseados en el vector y el inserto disminuyendo el rendimiento de
dichos extremos. En casos como aplicaciones forenses, donde el ADN
cortado por una RE genera una huella digital nica, la actividad
estrella destruir banda(s) existente y generar nueva banda, lo que
complica el anlisis (Sidorova, 2004).

La actividad de la BamHI puede cambiar durante el almacenamiento y

la manipulacin, y por lo tanto la integridad de reaccin y los efectos
de la actividad estrella puede variar. En algunos casos, la actividad
estrella fue ventajosa; en los aos en que haba un nmero limitado
de RE disponible se utiliz la actividad estrella de BamHI para generar
vectores de delecin unidireccionales (Vincze, 2003).

MATERIALES Y MTODOS

Ensayo de determinacin del FI

Se utilizaron ER de New England Biolabs, como soluciones madre de

la concentracin ms alta disponible y se compararon con enzimas de
otros proveedores.

Tpicamente, para medir el FI, se someti una solucin RE madre

concentrada a una serie de diluciones con diluyentes adecuados (50%
glicerol cada uno), para dar 20 concentraciones diferentes (1 x, 0,5 x,
0,25 x, etc.).

Tres microlitros de la solucin de enzima se mezclaron con 0,6 g de

sustrato de ADN en cada uno de los cuatro tampones que se
utilizaron.

Las reacciones se llevaron a cabo en una microplaca de 96 pocillos.

La placa se sell con cinta, se cubri con una tapa, se incub a 37C
durante una hora y se carg en un gel de agarosa.

Despus de la electroforesis, una imagen del gel fue tomada usando

un generador de imgenes UV (Bio-Rad).

Para cada conjunto de reacciones, el FI se calcula en base a la

dilucin de la muestra del primer carril sin primera actividad estrella
comparado con el ltimo carril sin mostrar digestin parcial.

IF para diferentes sustratos

Con la BamHI se compararon los IF obtenidos para diferentes
sustratos de ADN. Todos los sustratos eran de New England Biolabs,
Inc.

El efecto de las formas superenrolladas y lineales de ADN en el FI

Las mismas cantidades de sustrato superenrollado se digirieron con

BamHI y EcoRI, y los IF se compararon para los sustratos
superenrollados y lineales.

RESULTADOS

La definicin de FI

En el extremo derecho, hay muy poca enzima, por lo que poco o

ningn ADN se digiere. A medida que la cantidad aumenta hacia la
izquierda, fragmentos parcialmente digeridos comienzan a aparecer,
estn completamente digeridos cuando la cantidad de la enzima
alcanza un punto crtico, a esto lo llama la cantidad RE ms baja
necesaria para la escisin completa de los sitios afines (LCC). Este
patrn se mantiene pero la cantidad RE contina aumentando hasta
que la actividad estrella comienza a aparecer. Una vez que aparece la
actividad estrella, la banda de escisin normal se escinde
adicionalmente en fragmentos ms pequeos.

Se define al FI, que describe el grado de actividad estrella para a la

BamHI, como la relacin de la cantidad de enzima ms alta que no
muestra actividad estrella (HNS) con la cantidad ms baja necesaria
para la escisin completa de los sitios afines (LCC):

Una variacin de 2 a 4 veces se considera que es idntica dentro del

error experimental. Los IF eran esencialmente los mismos para EcoRI
y BamHI a partir de diferentes proveedores.

RE estn idealmente utilizadas en sus tampones ptimos; sin

embargo, las digestiones de restriccin, que incluyen dos o ms RE
con diferentes tampones ptimas son muy comunes. Por ello, una
seleccin de cuatro tampones de reaccin en lugar de uno se puso a
prueba en este estudio.
Se han encontrado los IF de BamHI y OkrAI a temperatura ambiente
en alrededor de 10 veces mayor que a 37 C.

No existi un efecto sobre el FI de la BamHI en relacin a la forma

superenrrollada o linealizada del DNA.

Discusin y conclusin:

Cada RE tiene su propio FI en cada buffer especfico. El FI puede

proporcionar directrices generales para la eleccin de las condiciones
ptimas RE (BamHI). Si las opciones son limitadas y una enzima con
actividad estrella se deben utilizar, el FI puede ayudar en la eleccin
de las condiciones de reaccin necesarios para obtener la escisin
completa sin causar actividad estrella grave.

Adems de la aplicacin inmediata de estos hallazgos para guiar la

digestin RE, esta definicin tambin sienta las bases sobre las que
ms investigacin se puede hacer sobre el tema de la actividad
estrella.

Introduccin:
Virus de Epstein-Barr (EBV) es un exitoso virus herpes gamma que
infecta a ms del 90% de los adultos y mantiene la infeccin latente
persistente durante toda la vida. La infeccin primaria por el VEB en
las clulas B suele ser asintomtica o causa la enfermedad
autolimitada mononucleosis infecciosa (IM). EBV-HLH es un trastorno
potencialmente mortal que progresa rpidamente. Se caracteriza por
fiebre prolongada, hepatoesplenomegalia, citopenias, disfuncin
heptica, y hiperferritinemia, y que en su mayora se presenta en
nios. Los resultados del sndrome de la activacin de clulas T
anormal y produccin de citoquinas inflamatorias. Los microARN
(miRNA) son un subconjunto de 18-25 nucletidos. Estos ARN no
codificantes regulan negativamente la expresin gnica por
direccionamiento de secuencias complementarias en los ARN
mensajeros. Ellos han demostrado que desempean un papel clave
en el crecimiento y el desarrollo, la regulacin del ciclo celular y la
inmunidad, y su funcin se ha relacionado con ciertas enfermedades
humanas. EBV fue el primer virus humano identificado para expresar
miRNAs. Hasta la fecha, se han encontrado 44 miRNAs VEB
codificada, entre los cuales 4 miRNAs derivan del Bam fragmento HI H
hacia la derecha marco de lectura abierto 1 (BHRF1), y los 40
restantes son codificados por el Bam HI-Una regin transcripcin
hacia la derecha (BART).
Materiales y Mtodos

Los pacientes

Quince pacientes con diagnstico de EBV-HLH se inscribieron en este

estudio en el Hospital de Nios de Beijing, entre septiembre de 2012
y septiembre de 2014. Todos los pacientes con diagnstico de EBV-
HLH cumplen los criterios diagnsticos HLH-2004, as como los
criterios de diagnstico para EBV-HLH. El estado de la infeccin
(infeccin primaria y la reactivacin del EBV) fue definida por pruebas
serolgicas para anticuerpos especficos para los antgenos de EBV. Si
los mtodos serolgicos eran difciles de estado de infeccin por VEB
diagnstico, la deteccin de genoma EBV usando PCR se utiliz para
evaluar la infeccin por VEB. 15 pacientes con diagnstico de la
mononucleosis infecciosa (IM) y 15 nios sanos previamente
infectados con EBV se utilizaron como grupos de control.

Muestra de sangre

Muestras de sangre perifrica con EDTA se obtuvieron de los 45

sujetos. Clulas mononucleares de sangre perifrica se separaron de
4 ml de sangre entera fresca por centrifugacin en gradiente de
densidad usando el Medio de Separacin de Linfocitos y despus se
resuspendieron en medio RPMI 1640. Las suspensiones celulares se
mezclaron con los anticuerpos de taln conjugado magnticos
respectivos contra CD4 + , CD8 + , CD19 + , y CD56 + y se incubaron
durante 30 min a temperatura ambiente.

Cuantificacin EBV-DNA

El ADN total fue extrado de 200 mu plasma L o 1 10 5 clulas

(como un estndar), utilizando ya sea QIAmp DNA Micro Kit (Qiagen,
Alemania) o QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen). La carga viral se
detect mediante PCR en tiempo real cuantitativa (qPCR) usando un
kit comercial EBV ADN cuantitativa (Genes Daan, China). Una carga
viral de 5 10 2 (10 2.70 ) se consider positiva. Las concentraciones
de ADN de EBV en las muestras de clulas se expresaron como copias
por microgramo ( g) de ADN. Las clulas infectadas con EBV se
determinaron mediante la comparacin de la carga viral de tipo
celular especfico. La diana celular fue la subpoblacin de linfocitos
que mostr la carga viral ms alta.

Discusin y Resultados: Este es el primer estudio que reporta el

perfil y el patrn de miRNAs codificados por EBV en nios con EBV-
HLH. EBV, en el que el BART miRNAs se expresa en niveles altos y
BHRF1 miRNAs se expresan en niveles bajos. La expresin de miRNAs
BHRF1 podra estar asociado con VEB ltico de replicacin. (Nivel de
latencia II). El elevado EBV-miRNAs puede estar implicado en el
mecanismo de EBV-HLH. Muchos pacientes con EBV-HLH manifiestan
en la fase precoz de esta enfermedad. Se observ que miR-BART22
se expresa en niveles ms altos en EBV-HLH que los de monocleosis o
nios sanos.

Objetivos:

Se investig la influencia de la variacin gentica del locus de la

transformacin del factor de crecimiento alfa (TGFA) sobre la relacin
entre el tabaquismo y las fisuras orales.

Introduccin:

El labio leporino y la hendidura en el paladar (CL / P) es un defecto de

nacimiento comn, que sus factores de riesgo incluyen genes, el
medio ambiente y su interaccin, el sexo, la ubicacin geogrfica,
nacionalidad, nutricin y el consumo de cido flico). Tambin se ha
informado de que el consumo de tabaco, los frmacos antiepilpticos,
y, posiblemente, consumo de alcohol aumenta la tasa de incidencia
de fisuras orales en los recin nacidos.

Los estudios de anlisis de segregacin se han ampliado mediante el

estudio de genes y desequilibrio de unin. La asociacin detectada
entre CL / P y alelos especficos en el gen transformador factor de
crecimiento alfa (TGFA) apoya fuertemente a TGFA como el mayor
gen componente en CL / P .

El trabajo subsiguiente demostr que durante el desarrollo

craneofacial TGFA se present a niveles altos en el tejido epitelial del
borde medial de los estantes palatinos en el momento de la fusin en
estante. En los cultivos palatales, TGFA promueve la sntesis de la
matriz extracelular y la migracin de las clulas mesenquimales para
asegurar la resistencia del paladar fusionado durante la ruptura de la
costura.

El TGFA gen se localiza en el cromosoma 2p13 11, contiene seis

exones y se extiende por 80 kb del ADN genmico. Tres polimorfismos
comunes del gen TGFA han sido investigados con la susceptibilidad a
la CL / P (RSA I, Taq I en el intrn 5 y BamHI en el exn 6).

Materiales y mtodos:

Las muestras fueron obtenidas en el Hospital Mofid en Tehern, Irn,

en 2013-2015. El grupo control consisti en 218 muestras de ADN de
iranes, sin hendiduras (102 varones y 116 mujeres) cuyas muestras
de sangre estaban disponibles. El grupo de casos consisti en 105
nios (65 varones y 40 mujeres) con CL / P no sindrmica (76 con
labio y paladar hendido y29 solo labio leporino).

Genotipado del gen TGFA:

El genotipado del SNP (Polimorfismo de nucletido simple) se realiz

mediante un ensayo con una reaccin en cadena de polimerasa-
polimorfismo de longitud de fragmentos de restriccin (PCR-RFLP). El
primer para el PCR se dise basndose en la secuencia de flanqueo
SNP descrito en Ensembl genome.

El sitio polimrfico BamH1 se encuentra en el exn VI, por lo tanto,

para la deteccin de la variante de BamH1 en el gen TGFA, el exn VI
del gen se amplific por PCR utilizando condiciones estndar junto
con primers modificados (Forward Primer: gcctggcttatttggggatt 3 'y
cebador inverso: 5'aaagggcaaggaaacacagg'3). Los fragmentos de
ADN se separaron y se visualizaron por electroforesis utilizando 8%
geles de poliacrilamida. Despus de la digestin con la enzima de
restriccin BamHI, el producto amplificado se digiri completamente
con un sitio de restriccin, y dos bandas especficas de 120 pb y 54
pb fueron indicados en el genotipo de tipo silvestre.

Resultados:

El polimorfismo para BamH1 TGFA se genotipo para 76 casos de CL /

P, 29 casos de hendidura de paladar, y 218 controles. En comparacin
con los controles, el anlisis del genotipo de regresin logstica
mostr que el genotipo BamH1 se asoci con una mayor
susceptibilidad de CL / P.
Los anlisis para el riesgo de fisura a partir del tabaquismo materno,
estratificada por la presencia o ausencia de polimorfismo en BamH1
TGFA, revelaron que el riesgo de fisura entre los nios con
polimorfismo en BamH1 TGFA fue mucho mayor que para los nios
con el alelo comn cuando sus madres fumaban cigarrillos.

Conclusiones:

Los resultados de este estudio indican que el fumar de la madre al

primer trimestre de gestacin y mutaciones en el locus TGFA de
lactantes estn asociados con la fisura labial y / o paladar (CL / P) no
sindrmica.

Bibliografa
Herverg y Barcia, M. (2007). Genemol. Obtenido de
http://genemol.org/biomolespa/Enzimas/enzimas-de-restricc.html

Kenneth. (2008). BamHI Complexed with B-DNA.

Roberts RJ. How restriction enzymes became the workhorses of molecular

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Samuelson JC, Morgan RD, Benner JS, Claus TE, Packard SL, Xu S.-Y.
Engineering a rare-cutting restriction enzyme: genetic screening and
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Segal, e. a. (2005). MAnual de Prcticas Biologa molecular . Mxico D.F.:

Publidisa.

Sidorova NY, Rau DC. Differences between EcoRI nonspecific and star
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Vincze T, Posfai J, Roberts RJ. NEBcutter: a program to cleave DNA with

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