La Universidad del Zulia

Facultad Exp. De Ciencias

Divisin de Extensin
Muestras clnicas para el diagnstico bacteriolgico
Contenido prctico.

1
 Prctica No 2. Accin de los agentes fsicos y qumicos sobre los Microorganismos
Prof. Ricardo Alonso Silva A.
INTRODUCCIN
El uso efectivo de los procesos de esterilizacin, desinfeccin y
antisepsia, constituye un factor importante en la prevencin y
profilaxis de las enfermedades infecciosas. Sin embargo aun
cuando la definicin de estos trminos se maneja tericamente,
es comn observar su mal empleo prctico. La exacta
distincin y conocimiento bsico de cmo lograr y manejar
cada uno de estos procesos, es importante en el control y
eliminacin de microorganismos no deseados.
1. Esterilizacin: es el conjunto de procedimientos
fsicos o qumicos que permiten destruir o eliminar los
microorganismos patgenos o saprofitos incluyendo
sus esporas.
2. Desinfeccin: procedimiento que destruye las
formas vegetativas de todos los microorganismos
pero no necesariamente las esporas.
3. Asepsia: es el conjunto de tcnicas utilizadas para
prevenir contaminaciones e infecciones. Como
ejemplo estn las tcnicas y procedimientos
destinados a impedir la contaminacin del personal,
material y medios de cultivo en la prctica
bacteriolgica y los procedimientos empleados en los
quirfanos para eliminar o disminuir el riesgo de
infecciones.
4. Sptico: se refiere a la presencia de
microorganismos en tejidos vivos produciendo o
provocando putrefaccin o sepsis.
5. Antispticos: sustancia que se aplica sobre tejidos
vivos para prevenir, inhibir o eliminar el crecimiento
de bacterias.
6. Desinfectante: sustancia qumica que se aplica
sobre objetos inanimados para prevenir, inhibir o
eliminar el crecimiento de bacterias.
7. Sanitizante: sustancia que solo se aplica a sistemas
inanimados para disminuir la carga microbiana total.
8. Saneamiento: reduccin de la poblacin microbiana
a niveles considerados seguro segn las normas de
salud pblica establecidas. Ejemplo: la adicin de
cloro al agua de consumo humano.
9. Agente bactericida: agente que destruye las
bacterias inactivando en forma irreversible funciones
esenciales de las mismas.
10. Agente bacteriosttico: agente que inhibe la
reproduccin de las bacterias ejerciendo una accin
potencialmente reversible sobre funciones celulares;
por esta razn la supresin de este tipo de agente
permite que se restablezcan las funciones celulares y
por ende el crecimiento bacteriano.
AGENTES FISICOS EMPLEADOS EN LA ELIMINACIN DE
MICROORGANISMOS.
Entre los agentes fsicos que actan sobre las bacterias, los
ms importantes son el calor y las radiaciones ionizantes,
aunque la filtracin tambin puede considerarse como un
mtodo fsico de esterilizacin mediante el cual se separan de
unos lquidos los microorganismos suspendidos en l. De estos
agentes el calor es el ms confiable y aplicado universalmente
en la esterilizacin y cuando sea posible, debe ser el mtodo
de eleccin.
I. CALOR:
La resistencia de los microorganismos al calor vara con la
especie y su capacidad de esporulacin. Las formas
vegetativas generalmente mueren a los 55 o 60 C durante 30
min; sin embargo, los esporulados soportan temperatura de
hasta 100C por varias horas. La accin letal del calor es una
relacin temperatura/tiempo afectada por muchas condiciones,
entre ellas: temperatura empleada, tiempo de exposicin, tipo
de microorganismo, estado fisiolgico del microorganismo,
propiedades fsicas y qumicas del medio ambiente en que
viven, tamao inicial de la poblacin entre otras.
Los procedimientos prcticos en los que se emplea el calor
para la destruccin de los microorganismos se dividen en dos
categoras:
1. Incineracin o llama directa para objetos que deban
ser destruidos o para la esterilizacin rpida de
objetos pequeos.
2. Flameo por pasaje rpido de agujas, pipetas Pasteur,
boca de los tubos de ensayo o pequeos
instrumentos a travs de la llama del mechero.
3. Aire caliente: Horno Pasteur.
La esterilizacin al calor hmedo se puede llevar a cabo
mediante:
a. Vapor a presin: Autoclave.
b. Vapor libre o esterilizacin fraccionada: Tindalizacin.
1. Esterilizacin al calor seco directo
(INCINERACIN): es un procedimiento que consiste
en colocar directamente con la llama del mechero el
objeto o material que se desea esterilizar. En las
prcticas bacteriolgicas es de aplicacin rutinaria la
esterilizacin del asa y la aguja de siembra, tambin
es de utilidad en la eliminacin de residuos
hospitalarios.
2. Esterilizacin mediante aire caliente: este mtodo
de esterilizacin utiliza los hornos Pasteur. Los
objetos a esterilizar mediante este paso se someten
a altas temperaturas por tiempo prolongado (180C
por 2hrs o 160C por 3hrs), para garantizar la muerte
2
 de las formas vegetativas y de las esporas
bacterianas. La aplicacin de este mtodo permite
esterilizar objetos estables al calor, tales como:
recipientes de porcelana o vidrio, instrumento
quirrgico y sustancias como aceites, grasas,
gelatinas, polvos, gasas y algodn, entre otros, por
ser impermeables al vapor de agua o porque se
requieren secos para no alterar su naturaleza. Este
mtodo no se recomienda para la esterilizacin de
lquidos, material orgnico (suero, aminocidos,
antibiticos y otros), ni material plstico que pudiera
alterarse o daarse.
3. Esterilizacin mediante vapor bajo presin: este
procedimiento se basa en que a mayor presin de
vapor, mayor temperatura; principio que se aplica en
el autoclave Chamberland.
La esterilizacin por autoclave es altamente eficaz ya
que esteriliza con un perjuicio mnimo el material.
El tiempo y temperatura de operacin para alcanzar
la esterilizacin, depende de la naturaleza y volumen
del material a esterilizar y el tipo de recipiente a
emplear. Por este mtodo se esterilizan materiales
estables al calor tales como: medios de cultivos,
objetos de goma resistentes, lencera quirrgica,
objetos quirrgicos y material contaminado, entre
otros.
No se recomienda su uso para la esterilizacin de
sustancias inmiscibles en agua, tales como las
grasas, parafinas y aceites debido a que, al no ser
alcanzados por el vapor, los microorganismos
contenidos en ella sobreviven.
Tampoco se recomienda su uso en la esterilizacin
de sustancias termolbiles (sustancias que puedan
ser alteradas o destruidas por exposicin a altas
temperaturas) como antibiticos, aminocidos,
protenas, soluciones con una alta concentracin de
azucares (10% o ms) y otros.
En forma generalizada, el autoclave es un recipiente
de cobre en cuyo fondo se coloca una porcin de
agua que es calentada por gas o por electricidad
(Figura 1). Sobre este reposa una tapa con la que se
cierra hermticamente y lleva adems un manmetro
indicador de la presin, una vlvula de seguridad y
una llave de salida de vapor que debe cerrarse una
vez que ha salido todo el aire del interior del aparato,
indicado por la expulsin de un chorro continuo de
vapor.
Figura 1. Conformacin del autoclave.
La temperatura habitual de esterilizacin es de
121C correspondiente a 15lbs de presin,
mantenida por 15 minutos. Estas cifras solo son
vlidas para el vapor saturado; la presencia de aire
en la cmara del autoclave impide la elevacin de la
presin y por consiguiente de la temperatura.
Tambin es necesario tener presente que en la
prctica diaria, a veces se requiere emplear
condiciones diferentes; por ejemplo, si van a
esterilizar grandes volmenes de material o de
lquidos, es necesario prolongar el tiempo de
exposicin de 30 a 40 min, esto debido a que los
materiales colocados en el centro tardarn ms en
alcanzar la temperatura de esterilizacin.
Los medios de cultivo que contienen glucosa deben
esterilizarse a 115C, ya que a temperaturas
superiores la glucosa carameliza, por consiguiente,
en estas ocasiones el tiempo tambin debe ser
mayor (30 min. aproximadamente).
El efecto destructivo de las temperaturas elevadas sobre los
microorganismos depende del tipo de calor. El calor hmedo
que se difunde a travs del agua o vapor de agua, mata
desnaturalizando las protenas celulares por coagulacin (la
desnaturalizacin es ms rpida cuando la humedad es
mayor), las interacciones entre los pares de bases se alteran y
las interacciones de los lpidos se disuelven desapareciendo su
asociacin normal interna y con las protenas de la membrana
celular. La accin rpida del calor hmedo depende en buena
parte del alto valor de calor latente del agua (540 cal x g-l), ello
hace que los objetos se calientes rpidamente por
condensacin de agua en su superficie.
Los efectos tales como el calor seco, que se difunde por
contacto directo del microorganismo con la fuente de calor,
habitualmente se deben a la oxidacin de los componentes
intracelulares y a efectos txicos por niveles elevados de
electrolitos como consecuencia de la deshidratacin, el
proceso de oxidacin es ms lento que el de la coagulacin.
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4. Vapor libre o esterilizacin fraccionada
(Tindalizacin): se utilizan cuando la sustancias
qumicas no pueden ser calentadas por encima de
100C sin que resulten daadas (suero, plasma,
soluciones con 10% o ms de carbohidratos, entre
otros). Consiste en el calentamiento del material
entre 50 -100C hasta por una hora o ms para
destruir las formas vegetativas. Este proceso se
repite hasta por 3 das consecutivos con sucesivos
periodos de incubacin, periodos de incubacin en
estufa a 30-37C durante 24 hrs., para permitir que
las esporas germinen y se transformen en formas
vegetativas que son destruidas en la segunda o
tercera exposicin. La tindalizacin puede practicarse
en bao Mara a una temperatura entre los 50 y
100C o en el autoclave con la llave de escape de
vapor abierta para los materiales que soportan la
temperatura de ebullicin.
Existen otros procedimientos en los cuales se utiliza
el calor hmedo continuo para disminuir la carga
microbiana o para destruir microorganismos
patgenos, pero que no son considerados mtodos
de esterilizacin al no garantizar la destruccin de
esporas: estos mtodos son ebullicin, vapor fluyente
y pasteurizacin.
5. Ebullicin: destruye las formas vegetativas de la
mayora de las bacterias patgenas, no afecta su
formas esporuladas cuya presencia es fuente de
contaminacin y representa un peligro potencial de
infeccin. La prctica de exponer instrumentos a
ebullicin es ms una desinfeccin que una
esterilizacin. La ebullicin solo esteriliza cuando se
aplica en forma discontinua (Tindalizacin).
6. Vapor fluyente: se puede obtener dejando abierta la
llave del autoclave. Presenta el mismo inconveniente
del mtodo anterior al no garantizar la destruccin de
esporas, a excepcin de cuando es utilizado en
forma discontinua (tindalizacin).
7. Pasteurizacin: no es un procedimiento de
esterilizacin como tal ya que no destruye las
esporas de los microorganismos esporulados. La
temperatura seleccionada para este proceso se basa
en el tiempo trmico mortal de microorganismos que
se consideren potencialmente patgenos tales como
Mycobacterium tuberculosis y la Coxxiella burnetti,
ambos resistentes al calor adems de que pueden
ser transmitidos por el consumo de leche cruda, es
por ello que la pasteurizacin de la leche se realiza a
62,8C por 30min, o a una temperatura ligeramente
superior (71,7C) durante 15seg. (Flash de
pasteurizacin), la pasteurizacin no se implementa
en microbiologa clnica, sino se deja en otras ramas
de las ciencias microbiolgicas tales como la
industrial, farmacutica y alimentaria, para la
conservacin de la leche, vino, cerveza o
medicamentos.
Otros mtodos trmicos empleados en el control de
poblaciones microbianas pero que no garantizan la destruccin
de esporas no microorganismos termo-resistentes son la
refrigeracin y la congelacin:
8. Refrigeracin y congelacin: la refrigeracin y
congelacin previenen el desarrollo de bacterias en
materiales susceptibles de descomposicin, pero no
es un mtodo de esterilizacin, aunque muchas
clulas microbianas puedan ser destruidas.
Cuando la temperatura es ligeramente inferior al punto de
congelacin del medio (-1C y -10C), el citoplasma bacteriano
queda en sobrefusin (sin congelar), pero como la tensin de
vapor de agua en el interior es mayor que en el exterior, existe
una tendencia a restablecer el equilibrio, que puede ser:
perdida de agua (cuando la congelacin se efecta
lentamente), o bien por cristalizacin del agua en el interior de
la clula (cuando la congelacin se realiza rpidamente).
En ambos casos, la consecuencia es que las sales
intracelulares se concentran, lo que supone que la solucin del
citoplasma puede llegar a saturarse con precipitacin de sales.
Este facto lleva a varias consecuencias:
Los cristales de sales de sodio y la alta concentracin
de electrolitos provocan la desnaturalizacin de las
protenas y daos a la membrana a modo que
puedan salir componentes del citoplasma (fosfato,
ribosoma, pptidos y nucletidos) procedente de la
actuacin de la ribonucleasa y peptidasas latentes).
Otro efecto de menor importancia es el dao
mecnico a la pared celular y a la membrana
provocado por los cristales de hielo.
La manera de realizar la descongelacin y el nmero de ciclos
de congelacin-descongelacin es otro factor a tomar en
cuenta. La descongelacin lenta es ms letal que la rpida ya
que aumenta el volumen de cristales de hielo.
El grado de muerte por congelacin se puede desglosar en dos
componentes:
1. El efecto inmediato: muertes que ocurren al
congelarse la muestra.
2. El efecto de almacenamiento, consistente en la lenta
prdida de viabilidad debida al tiempo que
permanecen las bacterias sobrevivientes en estado
congelado, y que depende de la temperatura a la que
se mantenga la muestra.
La congelacin se aplica en laboratorios para preservar
muestras bacterianas durante largos periodos de tiempo. Con
el objetivo de maximizar la viabilidad bacteriana el mayor
tiempo posible, es importante tomar en cuenta cmo se efecta
tanto la congelacin como la descongelacin. Una vez
congeladas las bacterias sobrevivientes conservan su
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viabilidad durante mucho tiempo, siempre que la temperatura
se mantenga por debajo del punto eutctico.
II. RADIACIONES
Las radiaciones comnmente empleadas en procesos de
esterilizacin o desinfeccin pueden ser, ionizantes o no
ionizantes, entre las ionizantes la ms empleada es la luz
ultravioleta (UV), producida artificialmente con lmparas de
vapores de mercurio. La radiacin UV es absorbida por las
clulas especialmente por los cidos nucleicos donde esta
realiza el dao ms importante. El efecto a nivel del ADN en la
clula vegetativa se debe a la formacin de dmeros de piridina
(T-T; T-C o C-C)(c) entre dos pirimidinas adyacentes en la
misma hebra de ADN. Su efecto principal es la distorsin local
de la configuracin de la doble hlice alterando los procesos de
replicacin y transcripcin y secundariamente, en el
crecimiento y respiracin bacteriana.
Inicialmente el uso de la luz U.V fue letal para las bacterias, sin
embargo, actualmente no lo es debido a que las mismas han
desarrollado mecanismos de reparacin del ADN que les
permite restituir las funciones alteradas. Por esta razn y
debido a que la luz UV es de baja energa y posee un bajo
poder de penetracin (no penetra slidos, an la lmina ms
fina de vidrio retiene un alto porcentaje de UV y penetra muy
poco en lquidos), la radiacin UV no puede considerarse como
agente esterilizante. Se emplea principalmente en el control de
infecciones transmitidas por el aire como en la desinfeccin de
reas cerradas (salas hospitalarias, quirfanos, cabinas
bacteriolgicas y laboratorios farmacuticos).
Figura 2. Lmpara U.V
Las radiaciones ionizantes de valor prctico como agentes
esterilizantes son los rayos gamma y los rayos catdicos, por
su mayor capacidad de producir efectos letales sobre las
bacterias y su alto poder de penetracin. Los efectos de las
radiaciones ionizantes dependen de la dosis de exposicin, es
decir, de la cantidad de radiacin suministrada, y de la dosis de
adsorcin, que es la fraccin de la dosis de exposicin que
realmente es absorbida por el sistema biolgico (es decir, de la
dosis biolgicamente efectiva).
Las radiaciones ionizantes tienen muchas aplicaciones en
medicina y la industria farmacutica para la esterilizacin de
artculos tales como: hilos quirrgicos, material desechable
como inyectadoras, agujas, bisturs, catteres, plstico y
equipos de transfusin. La esterilizacin por radiacin produce
poca elevacin de la temperatura, por lo que tambin se le
llama esterilizacin fra.
Figura 3. Esquema de penetracin de las radiaciones
ionizantes (Rayos alfa, beta y gamma).
III. FILTRACION
La filtracin, en sentido bacteriolgico, es un proceso que tiene
por objeto esterilizar lquidos lbiles al calor. El mtodo
consiste en hacer pasar el lquido por dispositivos especiales
llamados filtros, constituidos por un elemento poroso como la
porcelana, tierra de infusorios o diatomeas, asbesto, amianto,
arena, steres de celulosa y otros.
Durante la filtracin, los lquidos pasan a travs del filtro el cual
retiene las bacterias por dos mecanismos diferentes:
a. Mediante la accin mecnica de colador ejercida por
los poros pequeos.
b. Por la adsorcin de los microbios al filtro debido a la
diferencia de carga elctrica entre el filtro y los
microorganismos.
La filtracin es el principal mtodo utilizado en el laboratorio de
bacteriologa para la esterilizacin de sustancias termolbiles
como: enzimas, sueros humanos y de animales, solucin de
aminocidos, vitaminas y algunos antibiticos.
Figura 4. Equipo para filtracin.
IV. AGENTES QUIMICOS EMPLEADOS EN LA
ELIMINACIN DE MICROORGANISMOS
La esterilizacin por accin de un agente qumico es posible
pero no obligada. De todo los agentes qumicos, los que han
demostrado se agentes esterilizantes son el xido de etileno y
el glutaraldehdo. El xido de etileno es usado para esterilizar
material mdico quirrgico desechable debido a su alto poder
de penetracin. Su uso est restringido a la industria por su
carcter txico e inflamable que obliga al uso de equipos
especiales para su aplicacin y eliminacin. El Glutaraldehdo,
en solucin acuosa al 2%, presenta una amplia variedad
5
antimicrobiana. Es efectivo contra virus, clulas vegetativas y
esporas de bacterias y hongos. Se usa en medicina para
esterilizar instrumentos urolgicos y pticos.
Todos los efectos observables de los agentes qumicos sobre
las clulas o microorganismos son el resultado de los cambios
en sus componentes macromoleculares. Algunos de estos
cambios lesionan la membrana celular e inactiva
irreversiblemente las protenas e inducen extensas lesiones en
los cidos nucleicos. La efectividad de un agente qumico
empleado en la desinfeccin depende de un nmero de
factores, cada uno de los cuales puede tener un efecto
significativo en el resultado final. Dentro de estos factores
estn: la naturales (grampositivo o gramnegativo) y nmero de
microorganismos presentes en el material a desinfectar,
concentracin y naturaleza del agente qumico (compuesto
fenlicos, alcoholes, halgenos, colorantes y otros), tiempo de
exposicin, cantidad de materia orgnica presente (tierra,
heces, pus, sangre, entre otros), tipo y condicin del material a
desinfectar, la temperatura y el pH del agente qumico a
emplear.
Los agentes qumicos empleados para el control de
poblaciones se pueden dividir en dos grupos:
A. INORGNICOS:
A.1. Halgenos: Iodo, Cloro y sus Derivados:
Deben su accin microbicida a procesos de oxidacin de
constituyentes celulares. El iodo es uno de los agentes
germicidas ms antiguos y al mismo tiempo ms efectivo; se
emplea como antisptico y desinfectante. Su accin
antimicrobiana es debida a su efecto oxidante. Adicionalmente,
el iodo puede combinarse con el aminocido tirosina
ocasionando la inactivacin de enzimas y otras protenas. En
concentraciones elevadas puede incluso destruir algunas
esporas.
El cloro, bajo la forma de gas o de algunas combinaciones
qumicas, es uno de los desinfectantes ms utilizados. La
muerte del microorganismo se debe en parte a la combinacin
directa del cloro con las protenas de las membranas celulares
y las enzimas. As mismo, en presencia de agua desprende
oxgeno naciente (O) que oxida la materia orgnica:
Cl2 + H2O ----- HCl + HCLO (cido hipocloroso)
HCLO ------ HCL + O (Oxigeno naciente)
A.2. Perxido de hidrgeno (H2O2):
Acta como oxidante de grupos sulfihidrilos libres de las
membranas celulares y enzimas. Se utiliza como antisptico a
una concentracin del 3-6%. Es un desinfectante inocuo para
los tejidos pero muy dbil; su principal uso clnico es la limpieza
de pequeas heridas de la piel o mucosas.
A.3. Compuesto de Amonio Cuaternario:
Actan causando alteraciones en la permeabilidad de la
membrana citoplasmtica y desnaturalizando protenas. Tienen
alto poder bactericida y actan sobre especies grampositivas,
gramnegativas y sobre muchas especies de hongos. Su gran
utilidad se debe, adems de su poder antimicrobiano y de su
accin detergente, a su gran solubilidad, baja toxicidad y a su
baja accin corrosiva.
A.4. Metales:
Actan inactivando las protenas celulares al combinarse con
ellas. Los ms efectivos son el mercurio, plata cobre y zinc.
Entre los compuestos de mercurio que se emplean como
antispticos en heridas superficiales de la piel y mucosas, entre
estos se encuentran el mercuriocromo y el merthiolate. En
relacin a los compuestos de plata utilizados como antispticos
est el nitrato de plata (AgNO3) que en solucin al 1% se ha
utilizado para prevenir infecciones gonoccicas en los ojos de
recin nacidos, aunque actualmente ha sido remplazado por
antibiticos como la penicilina. Entre los compuestos de cobre
se encuentran el sulfato de cobre (CuSO4) que se utiliza como
algicida en recipientes abiertos que contengan agua y
funguicida para controlar infecciones fngicas de plantas. Los
compuestos de zinc tambin son fungicidas por los que se
utilizan para tratar el pie de atleta.
B. ORGNICOS:
B.1. cido Fnico y compuestos fenlicos:
Estos productos actan desnaturalizando las protenas y
alterando las membranas celulares. En combinacin con las
protenas celulares forman proteinatos insolubles que los
hacen fuertes microbicidas an en soluciones pocas
concentradas. El fenol (cido fnico o cido fenlico) fue el
desinfectante con el que se dio inicio al desarrollo de la tcnica
de antisepsia en ciruga.
B.2. Alcoholes:
Actan desnaturalizando las protenas, disolviendo los lpidos
de membrana y como agentes deshidratantes. Son
bactericidas y fungicidas, pero no esporicidas; destruyen
tambin algunos virus que contienen lpidos (virus cubiertos).
Los dos alcoholes germicidas ms comunes son el etanol y el
isopropilico empleados a una concentracin del 70% por tener
mayor poder desinfectante que el alcohol al 100%. El alcohol
isoproplico es ms efectivo y menos voltil que el alcohol
etlico, pero es ms toxico.
B.3. Jabones y detergentes:
Son sales de sodio y potasio de los cidos grasos. Actan ms
por su accin mecnica que por su accin bactericida o
bacteriosttica. Su efecto es a nivel de la membrana
6
citoplasmtica y por esta razn se les denomina agentes U.V. Una vez que retire la placa de las cmaras
tensoactivos. la misma se coloca en incubadora y se deja por
24hrs y se procede a la visualizacin de
V. AGENTES ALQUILANTES
crecimiento bacteriano.
Poseen una alta capacidad para combinarse con las protenas, 1.2. Test de papel de filtro para determinar la
en especial con las nucleoprotenas, a las cuales transforman sensibilidad a antispticos y desinfectantes:
desnaturalizndolas. Los ms usados son el formaldehdo, 1.2.1. Preparacin del inoculo: seleccionar
glutaraldehdo y el xido de etileno. El glutaraldehdo ha ido de dos a tres colonias con crecimiento
remplazando al formaldehdo por ser 10 veces ms activo, de 24 hrs en un medio de cultivo con
tiene mayor poder bactericida y es considerablemente menos nutrientes bsicos. Una vez
txico; es muy usado en los hospitales. El xido de etileno es
seleccionada las colonias, se procede
ampliamente utilizado en la esterilizacin gaseosa. Es activo
contra todo tipo de bacterias incluyendo el bacilo tuberculoso y a removerlas con el asa bacteriolgica
los bacilos esporulados. Su mayor aplicacin es en la y resuspenderlas en solucin
esterilizacin de materiales termolbiles como tubos de fisiolgica 0,85% o agua destilada
polietileno, equipos electromdicos, bombas cardipulmonares y estril y la misma se ajusta a la escala
materiales biolgicos. de Mac Farland 0,5 equivalente a
1,5x108UFC/mL.
OBJETIVO GENERAL

Sealar y diferenciar la accin de los diferentes procesos de

esterilizacin y desinfeccin sobre los microorganismos.

OBJETIVOS ESPECIFICOS

Demostrar mediante la realizacin de una prueba de

laboratorio, el efecto de la luz U.V. sobre el
microorganismo objeto de estudio.
1. Seleccin de colonias 2. Suspensin directa de colonias
Demostrar mediante la realizacin de una prueba de
laboratorio, el efecto de antispticos y desinfectantes
sobre el microorganismo objeto de estudio.

MATERIALES Y METODOS
3. Ajustando turbidez de forma manual en la escala de
1. Comprobacin el mecanismo de accin del agente Mac Farland
Figura 5. Procedimiento para la preparacin del inoculo.
bacteriano objeto de estudio por la exposicin a
rayos u.v rayos U.V.
1.2.2. Siembra: la siembra del inoculo debe
1.1. Preparacin del inoculo: a partir de un cultivo realizarse de forma tal que permita un
fresco suministrado, con el asa bacteriolgica crecimiento uniforme y parejo sobre la
haga un arrastre de masa celular y resuspenda superficie del agar. De este paso
en solucin fisiolgica 0,85% y ajuste a la escala depender la accin de los
de Mac Farland 0,5. Una vez ajustado el antispticos y desinfectantes, ya que
inoculo, proceda a sembrar con un hisopo al tener un crecimiento bacteriano
previamente esterilizado en agar nutriente base denso sin un buen ajuste de turbidez,
de forma homognea y continua, realizando tres el tamao de los halos de inhibicin
inoculaciones con rotacin de 60 entre cada disminuir, sucediendo lo contrario
inoculacin. Finalizado el proceso de cuando el inoculo no est ajustado
inoculacin se procede a colocar la placa de correctamente por debajo del exigido
Petri a exposicin con luz U.V (lmpara de ya que se tendrn halos de inhibicin
365nm) y se deja por un lapso de 24-48hrs de muy grandes. Para este paso usted
exposicin y se determina si la bacteria debe con un hisopo estril tomar
suministrada presenta sensibilidad o no a la luz
7
 muestra del inoculo ajustado y para 1.2.4. Incubacin: Las placas se colocaran
ello lo debe sumergir en el mismo, a incubacin 35 +/- 2C por 24 horas y
antes de su salida se recomienda posterior a ello se har lectura de los
plegar el mismo suavemente por las halos de inhibicin que se forman, los
paredes internas del tubo, a modo que cuales se medirn y se reportaran
se elimine el exceso de inoculo, como sensible en aquellos casos
posterior a ello debe desplazar de donde se form halo de inhibicin y
extremo a extremo (figura 6) sobre la resistente en aquellos casos donde no
superficie del agar y posterior a ello hubo formacin de halos.
debe realizar una ligera rotacin para
volver a desplegar el mismo hisopo
sobre la superficie de agar, este paso
lo vuelve a repetir de la misma forma y
se completan tres inoculaciones
homogneas en toda la superficie del
agar, ya que con esto asegura
homogeneidad y buena distribucin
del mismo en toda la superficie del
agar.
Figura 8. Halos de inhibicin, mtodo cualitativo.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICA:

Ros A. 2013. Evaluacin a nivel de contaminacin

Figura 6. Desplazamiento de extremo a extremo del hisopo
sobre la superficie de agar.
1.2.3. Aplicacin del papel de filtro: Con
una pinza se toma un papel de filtro
reposado en una placa y se sumerge
sobre el antisptico o desinfectante
objeto de estudio, posterior a su
impregnacin se coloca sobre la
superficie del medio agar con
inoculacin previa de la cepa
bacteriana y se realiza una ligera
presin sobre los mismos, as se
garantiza contacto de la cepa, con el
medio y el antisptico o desinfectante
objeto de estudio.
de superficies y la eficacia a nivel de productos
desinfectantes a corto y largo plazo. Nuevos
mtodos. Universidad Autnoma de Barcelona,
Tesis Doctoral. Facultad de Veterinaria. 167pp.
Instituto Nacional de Salud, Organismo Pblico
Descentralizado de sector salud. Serie de Normas
Tcnicas No 30, Ministerio de Salud Del Per. 2002.
Sacsaquispe Contreras Rosa. 67pp.
Martnez M, 2013. Gua de Antispticos y
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Eliopoulos, G.; Hardy, D.; Hindler, J.; Jenkins, S.;
Lewis II,L.; . Miller, L.; Powell, M.; Swenson, J.;
Traczewski , M.; Turnidge, J.; Weinstein, M.; Zimmer,
B. (2014). CLSI, Documento M100-S26., Laboratory
Standards Institute antimicrobial susceptibility testing
standards. 36(1): 256.

Figura 7. Disco previamente humedecido en el antisptico

o desinfectante objeto de estudio y colocado sobre la
superficie del agar con cepa bacteriana inoculada y
debidamente ajusta a la escala de Mac Farland 0,5
8