Free-thiol estimation within the sequence of a protein; use of Ellmans reagent.

Alfonso Pearroya, Rosala Snchez, Mara Pedrosa & Luca Prez.

Biotechnological experimentation II, non guided practices, Biochemistry area, University of Oviedo, Asturias,
Espaa.
Free-thiol functional group can be found in protein cysteine aminoacids that are not participating in covalent
disulfide bonds. The interest of its quantification is based on their chemical properties. For instance, they are
dynamically present in many enzyme active centers, playing an important role on the catalyzed reaction
mechanism, and thus, determining the process rate. In this case we used a colorimetric estimation based on the
former thiols reaction with the Ellmans reagent (5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) or DTNB), which leads to an
absorbing yellowish product: the TNB. Its concentration can be measured by using VIS-spectrophotometry,
presenting an absorbance maximum at 412nm. Extinction molar coefficients have been trusted to be as reported in
the commercial Pierce protocol (Instructions (2004) Ellmans reagent. 22582. Pierce, USA). Being both the
stoichiometry of the reaction (1:1, Free-thiol:TNB) and the stock protein concentration known, we could estimate
the number of thiols per protein molecule by comparing the produced amount of TNB with that of the initial
protein. In this experiment we used three different proteins: the rabbit muscle aldolase, the bovine serum albumin
(BSA) and the ovalbumin. In order to achieve a truthful estimation, we needed that all the free-thiols of the
protein reacted efficiently with the DTNB. As we did not know the free-thiol location in the 3D structure of any
of these proteins, we hypothesized that they could allegedly be found within the hydrophobic internal
environment, leading to reaction difficulties given the aqueous nature of the DTNB solution. For that reason, we
decided to use sodium laurilsulphate (SDS) and urea as denaturing agents, breaking down the non-covalent bonds,
unfolding the protein, and therefore, getting the whole lot of thiols exposed to the reaction medium. We ran the
experiment with different concentrations of the denaturing reagents so that we could evaluate both the power of
the SDS against urea and the minimal amount of denaturing agent that leads to the complete unfolding of the
spatial structure. Reaction pH must be 8 or more alkaline since the TNB needs to be deprotonated in order to
absorb. For that, we use potassium phosphate EDTA buffer in the case of the urea experiences and trisHCl EDTA
for the SDS ones. We found that we could not use SDS with the former phosphate buffer as it led to the
precipitation of potassium sulphate, inactivating SDS activity. EDTA was used as a chelant that trapped the
metallic cations that could coordinate with the protein thiolate and thus diminish the reaction efficiency. By
running the reaction using a non-containing denaturing agent buffer we could estimate the number of thiols
present in the hydrophilic domain; it means, the already exposed thiol present in the native protein structure. After
the obtained data we could elaborate denaturing curves that informed about the detergent power. For the protein
stock preparation we used commercial lyophilized BSA and ovoalbumin, and a solution 27mg/mL of the aldolase
that we centrifuged and resuspended in the proper buffer. With the purpose of verifying those stocks
concentrations, we submitted the samples to a Bradford assay after the commercial Bio Rad protocol. This test
quantifies the total amount of protein sample using a colorimetric reaction with the Coomassie Blue, which
absorbs at 595nm. We prepared standards of BSA within the linear range (0.2-0.9 mg/mL) for both the buffer
containing urea and the one that presented SDS. We diluted our protein stocks so they fitted in the former linear
range of the assay. We found higher concentrations of BSA than expected in the case of BSA but lower for the
other two proteins. We adopted the found concentrations as the real ones for the following calculus. We
eventually run the Ellmans reaction. We measured the absorbance every 30 seconds. We analyzed the data with
the software Matlab R2015a . Consulting the protein database UniprotKB we found the expected number of
free-thiols present in these proteins. We expected BSA to show 1 free-thiol, but with both urea and SDS we
misestimated that value, getting a number of 0.27 and 0.41 respectively. Nevertheless, after some
bibliographic research we found that the cysteine that the BSA contains is found within an anionic
environment that given the negative charge of the DTNB at pH 8- prevents the reaction from taking
place. This fact is coherent with the found results. In the case of the ovalbumin we expected a number
of 4 free-thiols. In the urea experience, none of the denaturing agent concentrations were strong enough
to unfold the protein, not even after 40 minutes of reaction, showing at that point a value of 1.44 free-
thiols. However, even the lowest concentration used of SDS (0.5%) was sufficient to its denaturation,
showing a really accurate value of 3.8 thiols in only 10 mins. Both urea (more concentrated than 4M)
and SDS (all the concentrations) were strong enough to unfold the aldolase and give respectively a
number of 7.9 and 7.5 thiols as compared to the expected 8 thiols. The proportion between internal and
external thiols showed coherence in each protein comparing the data obtained using urea and SDS. In
general terms, the SDS appeared to be a stronger denaturing agent than urea. The Ellmans assay was
confirmed to be a truthful test to determine the number of free-thiols of a given protein.
Protein free-sulfhydryl groups

Alfonso Pearroya Rodrguez

Aim of the experiment
To estimate the number of free thiol present in
the sequence of certain proteins.
Free sulfhydryl groups are located in cysteine
residues that do not participate in disulfide
bonds.

Example sulfhydryl funcitional group,

also known as thiol.

Cysteine aminoacid
 Determination Method =
412

Easily measured

Sulfhydryl groups react with Ellmans reagent

generating an absorbing yellowish product: TNB2-.

Reduction of the DTNB (Ellmans reagent) to TNB (yellowish product)

Being the protein stock concentration and the
stoichiometry of the above-shown reaction well known,
we can determine the number of sulfhydryl groups.
Provided they were all exposed and that they reacted
effectively with the reagent:
[]
. = B .
[]
 Free cysteine residues
Ellmans reagent
Denaturation TNB

Every thiol needs to react; it means, it needs to be

exposed to the aqueous environment. SDS % / Urea M

SDS 0% / Urea 0M
SDS / Urea

NON accessible thiols Every thiol is exposed

Reaction only takes place with Thus, reaction does take place
the external thiols with all of them
FAIL Estimated number of thiols: 1 CORRECT Estimated number of thiols: 3
 []
. =
[]
Followed procedure
Protein stock preparation (expected concentration).
Rabit Muscle Aldolase (4 mg/mL)
Bovine Serum Albumin (BSA) (10 mg/mL)
Ovalbumin (6 mg/mL)
Bradford Test (Coomassie Blue, A595).

x
 Protein stocks needed to be
diluted in order to fit in the linear
Bradford test chart and results range of the Bradford test
Reactants Results

Tubes BSA Standard Phosp/Tris Bradford A595nm [Protein

buffer Reactant Standard]
(2 )

Blank 0L 100L 5mL - 0.0


1 10L 90L 5mL 0.2


2 15L 85L 5mL 0.3


3 20L 80L 5mL

DATA
0.4

4 25L 75L 5mL 0.5


5 30L 70L 5mL 0.6


6 40L 60L 5mL 0.8


Samples [Protein Stock]
Aldolase 10L 90L 5mL 2.4510/ 2.8443
BSA 5L 95L 5mL 11.624/13.3151

DATA
Ovalbumin 10L 90L 5mL 4.1040/ 3.9265
 []
. =
[] Bradford test

Once we are certain about the [Protein]

concentration

We run Ellmans reaction to determinate the

produced amount of TNB Spectrophotometer

Any sulfhydryl group

Ellmans reagent 1 : 1 412nm

125mM (in excess, non limiting the [TNB])

[TNB] Lambert-Beer Data and analysis Software Photomultiplier

 Ellmans reaction Requirements
pH 8.
Buffer KH2PO4 / K2HPO4 (0.1M) / EDTA4Na4H2O (1mM)
Compatible with urea.
Non compatible with SDS 2%: K2SO4 precipitates.
Buffer TrisHCl (0.1M) / EDTA4Na4H2O (1mM)
Compatible with SDS 2%.

Other data obtained from SigmaAldrich and

Pierce protocols and the UniprotKB database
Molar extinction coefficients of Ellmans Reagent in various solvents Protein Expected Number of Free Thiols

Solvent at 412nm Aldolase 8 (in each of its 4identical protomers)

2%SDS 12 500
BSA 1
0.1M phosphate 1mM EDTA, pH 14 150 Ovalbumin 6
8.00
Limit of thiols that can be present in the 1.0
8M urea 14 290 sample when running the assay mM
Ellmans assay chart (Urea example)
TUBES ELLMAN UREA BUFFER NON UREA BUFFER PROTEIN A595 ONCE REACTION IS COMPLETED [TNB] [PROT] THIOL
STOCK NUMBER
Blank 8M 50L 2.75mL 0 mL 0L

Blank 6M 50L 2.1mL 0.65mL 0L

Blank 4M 50L 1.4 mL 1.35 mL 0L

Blank 2M 50L 0.7mL 2.05mL 0L

Blank 0M 50L 0mL 2.75mL 0L

ThiolsAld 8M 50L 2.5mL 0mL 250L

ThiolsBSA 8M 50L 2.5mL 0mL 250L
ThiolsOvb 8M 50L 2.5mL 0mL 250L
ThiolsAld 6M 50L 2.1mL 0.4mL 250L
ThiolsBSA 6M 50L 2.1mL 0.4mL 250L
ThiolsOvb 6M 50L 2.1mL 0.4mL 250L
ThiolsAld 4M 50L 1.4 mL 1.1mL 250L

ThiolsBSA 4M 50L 1.4 mL 1.1 mL 250L

ThiolsOvb 4M 50L 1.4mL 1.1 mL 250L

ThiolsAld 2M 50L 0.7mL 1.8mL 250L

ThiolsBSA 2M 50L 0.7mL 1.8mL 250L
ThiolsOvb 2M 50L 0.7mL 1.8mL 250L
ThiolsAld 0M 50L 0mL 2.75mL 250L

ThiolsBSA 0M 50L 0mL 2.75mL 250L

ThiolsOvb 0M 50L 0mL 2.75mL 250L

Reaction Progress and Information
We follow the reaction progress by measuring the
increase of the absorbance on time. The graphs also
informs about the denaturing process.
We stopped the reaction when A412/t was estimated
to be 0.
We used different concentrations of the denaturing
agents to check the minimal amount that carries out
the protein unfolding.
Using a control with no denaturing agent we can
estimate the number of exposed cysteine residues.
Data analysis
Matlab personalizad software
 0M / 0% 2M / 0.5% 4M / 1% 6M / 1.5% 8M / 2% UREA / SDS

Denaturing curves and agent power

Urea SDS Tough protein

Denaturation Required time: Denaturation Required time:

~Still denaturing at 40 min. ~10-12 min.
N. Thiols: N. Thiols:
Underestimated (1.44/4) Quite accurately estimated (3.8/4)
 0M / 0% 2M / 0.5% 4M / 1% 6M / 1.5% 8M / 2% UREA / SDS

Denaturing curves and agent power

Really tough protein
Urea SDS

Denaturation Required time: Denaturation Required time:

At ~3-4 min it reaches the maximum denaturation. At~3-4 min
N. Thiols: Non accurately estimated (0.27/1) N. Thiols: Rightful estimation (0.41/1)

Underestimation reason: BSA cysteine is found within an anionic environment that prevents the DTNB2- from reacting effectively with it.
 0M / 0% 2M / 0.5% 4M / 1% 6M / 1.5% 8M / 2% UREA / SDS

Denaturing curves and agent power

Urea SDS

Denaturation Required time: Denaturation Required time:

~0.5min using higher than 4M urea concentration. ~2 min, but in this case we added the protein in the
N. Thiols: spectrophotometer cubette so time started running earlier
Accurate (7.9/8) than in the urea measurement.
N. Thiols: Accurately estimated (7.5/8)
 Results
8

6
Number of thiols

5
Urea
4 SDS
Expected
3

0
BSA Aldolase Ovalbumin
Coherence of the internal and external thiol
distribution in the aldolase

Thiol position in the 3D Thiol position in the 3D

structure of the protein structure of the protein
(Urea) (SDS)

18% 21%
Internal Internal
Exposed Exposed
82% 79%
Conclusions
The number of free-thiols present in a protein can be
successfully measured by carrying out the Ellmans
determination.
The concentration of the denaturing agent plays a
fundamental role in the correct estimation of the
number of thiols.
The sensibility of this method is accurate enough to
determine successfully a number of cysteines within
1 and 8.
SDS 2% appears to be a more powerful denaturing
reagent than urea 8M.
 Experimentacin en Biotecnologa II

PROTOCOLO

DETERMINACIN DE TIOLES LIBRES

EN UNA PROTENA
Objetivos y mtodo.
Se trata de evaluar el nmero de grupos tiol presentes en 3 protenas: la albmina de suero bobino (BSA), la
aldolasa de msculo de conejo y la ovoalbmina. Para ello se utilizar el reactivo de Ellman, un compuesto cuya reaccin
con estos grupos funcionales genera un producto coloreado de concentracin cuantificable a travs de su absorbancia, lo
que indirectamente nos informa acerca de la cantidad de grupos tiol por protena. Para extraer esta informacin es
importante conocer la concentracin de la protena a evaluar al inicio de la reaccin, y por ello, tras la preparacin de los
stocks de las 3 molculas de inters, la confirmaremos a travs del mtodo de cuantificacin proteica de Bradford ,
basado en la tincin de stas sustancias por el colorante Azul brillante de Coomassie, compuesto que tiene un mximo de
absorbancia a 595nm y cuyo coeficiente de extincin molar es conocido. Adems, las protenas presentan una estructura
tridimensional compacta, ocultando una gran proporcin de sus residuos aminoacdicos en el interior, en la regin
hidrofbica. Para que los grupos tiol libres por protena (en residuos de cistena, Cys) sean cuantificados correctamente,
deben reaccionar con el reactivo de Ellman, y por ello, deben estar expuestos al medio acuoso; de otra manera, no seran
accesibles estricamente y la reaccin de cuantificacin no sucedera. Para asegurar una exposicin total de estos grupos
la protena ha de perder su conformacin nativa; es decir, debe ser desnaturalizada. Para ello, utilizaremos paralelamente
dos mtodos: adicin de SDS (dodedilsulfato sdico) al 2% o adicin de urea 8M. La estequiometra que refleje la
concentracin obtenida del producto coloreado nos informar del nmero de residuos de Cys libres en cada una de las 3
protenas.

Introduccin
En 1959 Ellman1 introdujo el uso del compuesto 5,5-ditio-bis-
(cido 2-nitrobenzico), tambin conocido como DTNB2 (figura 1), un
compuesto soluble en agua usado para la cuantificacin del nmero de tioles
libres para cualquier tipo de compuesto. En el caso particular de inters, el de
una protena, entendemos tioles libres como aquellos grupos sulfhidrilo (-
SH) de los residuos de cistenas que no forman puentes disulfuro. La
reaccin rdox del DTNB con un grupo funcional tiol3 supone la aparicin Figura 1. Estructura qumica del DTNB o reactivo
del cido 5-mercapto-2-nitrobenzico (TNB), cuya forma desprotonada, de Ellman (C14H8N2O8S2 ). Masa molecular: 396.35
.

predominante a pH bsico prximo a 8, absorbe en el visible mostrando

coloracin amarilla. Conociendo la estequiometra de la reaccin (1:1 tiol:TNB, figura 2), es posible estimar la
concentracin de tioles libres a travs de la medida de la absorbancia del TNB en definitiva, de la concentracin de
TNB producido, pues [TNB2-]Abs412nm -. El coeficiente de extincin molar estimado inicialmente para el TNB fue de 13
600M-1cm-1 a 412nm y pH 8.0; no obstante, estudios ms exhaustivos realizados en los ltimos aos han mostrado que un
valor ms correcto para este parmetro es 14 150M-1cm-1, constante para el rango de pH 7.6-8.6. Adems, en la
actualidad son conocidos los coeficientes particulares para esta sustancia en distintos medios a esa misma longitud de
onda4. Es destacable la especificidad de este reactivo por los tioles a pH prximo al neutro, pues esto reduce posibles
errores debidos a reacciones colaterales. Adems, su alto valor del coeficiente de extincin molar aporta sensibilidad- y
su relativamente alta velocidad de reaccin, hacen de l un reactivo apropiado para este procedimiento analtico.

Figura 2. Reaccin de
reduccin del DTNB2-.
Los productos de
reaccin son el TNB2- y
un disulfuro mixto.

1
Ellman, G.L. (1959) Tissue sulfhydryl groups. Arch. Biochem. Biophys. 82, 70-7.
2
Del ingls 5,5'-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid)
3
En realidad, la reaccin se produce a travs de la forma desprotonada: el tiolato (S:), cuya presencia se ve favorecida a pH bsico. La reaccin de
estos tiolatos con el DTNB es irreversible, con lo que pese a ser la forma minoritaria del grupo sulfhidrilo, la reaccin termina por completarse en su
prctica totalidad.
4
Instructions(2004) Ellmans reagent. 22582. Pierce, USA.

1
 Experimentacin en Biotecnologa II

Los factores que intervienen en la velocidad de esta reaccin son varios: el pH de reaccin, el pKa del grupo
funcional tiol a determinar y los efectos electrostticos e impedimentos estricos asociados al grupo funcional. La
cuantificacin ulterior de los grupos tiol se puede efectuar tanto por interpolacin de las medidas de absorbancia para la
muestra a evaluar en una recta que relacione absorbancia nativa con concentracin de tioles construida a partir de
patrones con este grupo funcional (cistena, -mercaptoetanol etc) preparados a concentraciones conocidas, como a
travs del coeficiente de extincin molar por estimacin directa. En este caso seguiremos el segundo mtodo citado.

Material y reactivos
Tubos de ensayo KH2PO4 / K2HPO4 Reactivo de Bradford
Tubos Eppendorf Tris Urea
Tubos Falcon 50mL Na2HPO4 Laurilsulfato sdico
Micropipetas y puntas EDTA Reactivo de Ellman
Pipeta de vidrio y aspiradora Aldolasa de msculo de Agua ultrapura
mg
Vrtex y pH-metro conejo 27
mL NaOH
Espectrofotmetro VIS-UV Liofilizado de BSA Matraz de 100mL
Liofilizado de ovoalbmina
Preparacin del material

1. Preparacin del tampn pH 8
En primer lugar se preparan 100mL de una solucin 1M de KH2PO 4 y otros 100mL de una 1M de
K2HPO4. Para ello se toman 13.61g y 17.42g respectivamente llevndolas a100mL con agua ultrapura. En un
3.4mL. Enrasamos a 500mL con
nuevo matraz aadimos de la disolucin dibsica 46.6mL y de la monobsica,
agua ultrapura.
A continuacin pesamos 10.405g de EDTA4Na2H2O (cido etilendiaminotetractico
tetrasdicodihidratado) al 99% y lo llevamos a 50mL con agua ultrapura, obteniendo un stock de 500mM.
Agitamos vigorosamente con el vrtex. Comprobamos el pH de disolucin y ajustamos con HCl al 37% hasta
pH 8. Aadimos de esta disolucin 1mL sobre los 500mL de la de fosfatos. Se obtiene as un tampn K3PO4
0.1M y EDTA 1mM (pH 8). Puede comprobarse el pH con un pH-metro. El tampn alternativo TrisHCl que se
recomienda utilizar para las experiencias en SDS se preparara pesando 6.06g de Tris-base que se disuelven en
400mL de agua destilada. Se ajusta el pH con HCl hasta 8 y se enrasa a 500mL con agua. La desventaja del
tampn fosfato de potasio es la insolubilidad del sulfato de este metal alcalino, que inactiva a parte del SDS por
precipitacin.
2. Preparacin de las disoluciones de protena
mg
Aldolasa de msculo de conejo. Se preparar una disolucin 4mL a partir de una suspensin comercial
de protena en sulfato amnico 27mL. Para ello tomamos 745L de la disolucin comercial y lo llevamos en un
mg

tubo Eppendorf a la microcentrfuga 10 minutos a 14 000g. A continuacin, retiramos el sobrenadante5. El pellet

proteico se resuspende en 5mL de Na3PO4 0.1M y EDTA 1mM (pH 8).
mg
Albmina de suero bovino (BSA). Se preparar una disolucin 10mL . Para ello, tomamos 500mg del
liofilizado de esta protena y lo suspendemos en 50mL del tampn de pH 8 preparado.
mg
Ovoalbmina. Se preparar una disolucin 6mL . Tomamos 300mg y lo suspendemos en 50 ml del
tampn de pH 8 preparado.

Protena Masa Molecular Concentracin

mg
Albmina de suero bovino 66kDa 10
mL
mg
Aldolasa de msculo de conejo 160kDa 4
mL
mg
Ovoalbmina 45kDa 6
mL

5
Se puede realizar el mismo procedimiento sobre el sobrenadante extrado agregando 15mg de sulfato de amonio si se quiere comprobar que no
quedaba protena disuelta en ste.

2
 Experimentacin en Biotecnologa II

3. Cuantificacin Bradford de los stocks preparados.

La concentracin de protena utilizada para la evaluacin con el reactivo de Ellman debe ser conocida
con la mayor precisin posible, pues en su conocimiento se basarn los clculos estequiomtricos que nos
permitirn cuantificar el nmero de residuos de cistena no participantes en puentes disulfuro. Con el fin de
cerciorarnos de que las concentraciones son realmente las que se trat de preparar, acudimos al mtodo de
Bradford de cuantificacin de la protena total. Este mtodo puede confirmar de manera aproximada la
concentracin; este carcter estimativo permite que, con 2 medidas para cada protena, variaciones de hasta
mg
0.4 no sean estadsticamente significativas, siendo posible que la concentracin real del stock sea en efecto
mL
la esperada. Para este anlisis debemos preparar una recta de calibrado que nos informe de la cantidad de
protena total (concentracin) frente a la absorbancia. Se preparar un blanco que contenga el tampn de
reaccin y el preparado Bradford. Se recomienda realizar varias veces cada patrn para mejorar la robustez de la
mg
recta de calibrado. Se tomarn volmenes de una disolucin comercial de BSA 2mL segn se indica en el
siguiente cuadro con el fin de preparar patrones a distintas concentraciones en tubos de ensayo. Si no se dispone
del producto, se puede preparar disolviendo 20mg del liofilizado de BSA en 10mL de agua ultrapura. Ntese
que en cualquier caso, cada patrn llevar la parte correspondiente de tampn fosfato hasta un volumen de
100L. A cada tubo, incluyendo al blanco, le agregamos 5mL del reactivo de Bradford (que contiene el Azul
brillante de Coomassie). Dejamos incubar a temperatura ambiente unos 10 minutos y medimos la absorbancia
de cada patrn. Anotamos la absorbancia en la tabla y si se quiere, la concentracin de cada patrn. Hay varias
posibilidades en cuanto a la variable de abscisas representada en la recta de ajuste: se propone representar
Abs/LdeEstndar o Abs/[protena].

Reactivos Resultados
6
Tubos Estndar (2 ) Tampn R. Bradford A595nm [Protena]

fosfato

Blanco 0L 100L 5mL 0.0


1 10L 90L 5mL 0.2


2 15L 85L 5mL 0.3


3 20L 80L 5mL 0.4


4 25L 75L 5mL 0.5


5 30L 70L 5mL 0.6


6 40L 60L 5mL 0.8

Muestras [Protena Stock]
Aldolasa 10L 90L 5mL
Seroalbmina 5L 95L 5mL
Ovoalbmina7 10 L 90L 5mL

4. Determinacin de tioles libres.

Inicialmente, se pesan 48.044g de urea slida y se disuelven en 100mL del tampn pH 8. As se

obtiene una disolucin 8M de urea. A partir de esta disolucin, por dilucin en el tampn fosfato, se tendrn
soluciones 6M, 4M y 2M, que utilizaremos para evaluar la eficacia de desnaturalizacin de este agente.
Asimismo, prepararemos para una segunda experiencia prctica tampones con concentraciones variables de
SDS, otro agente desnaturalizante. La preparacin de partida ser una disolucin del tampn al 2% en SDS. Para
su elaboracin, agregamos 2g de este detergente a 100mL del tampn fosfato. Para conseguir las
concentraciones 1.5% y 1%, se diluir esta solucin original segn se muestra en una tabla posterior.

6
La casa comercial Bio Rad comercializa el reactivo de Bradford concentrado 5 veces. Por ello, se toma 20mL del preparado comercial y se lleva a
100mL con agua destilada. A esta disolucin es la que se refiere la tabla bajo el nombre R. Bradford.
7
Las diluciones de los stocks de protena se hicieron para que las concentraciones en las disoluciones a evaluar estn contenidas en el rango lineal de
mg mg mg
este mtodo analtico (0.2-0.9 ). Segn la tabla, la aldolasa quedara supuestamente a una concentracin de 0.4 , la seroalbmina, 0.5 y la
mL mL mL
mg
ovoalbmina a 0.6 . La medida debe hacerse a 595nm.
mL

3
 Experimentacin en Biotecnologa II

Una vez confirmadas las concentraciones de los stocks de protenas a travs de Bradford procedemos a
la reaccin con el reactivo de Ellman (DTNB). En primer lugar se disuelven 40mg de esta sustancia en 10mL
del tampn pH 8 sin urea- preparado con anterioridad8. De esta disolucin se toman 50L y se vierten en cada
tubo de ensayo. Se rotulan los tubos segn se muestra en la tabla. El nmero de tioles libres por protena se
puede obtener dividiendo la concentracin de TNB entre la molar de protena en el medio de reaccin al inicio
de sta; ntese que tal concentracin no es la del stock, pues se han tomado 250L de cada disolucin de
protena y se han llevado a 2.8mL. Es interesante seguir el avance de la reaccin midiendo la absorbancia del
compuesto en distintos puntos. De esos datos puede extraerse una idea del tiempo de desnaturalizacin,
accesibilidad general de los grupos tiol y se puede confirmar el fin de la reaccin cuando la absorbancia del
TNB se haya estabilizado. Se propone esperar unos 20 minutos como tiempo de reaccin estimado con el fin de
asegurar que el proceso ha concluido. El coeficiente de extincin molar utilizado para el caso de la
desnaturalizacin en urea 8M es 14290M-1cm-1. Se realizar una grfica que represente la concentracin de TNB
alternativamente, su absorbancia- una vez iniciada la reaccin frente al tiempo. Las medidas de absorbancia se
tomarn a distintos tiempos.

Reactivos Resultados
Tubos Ellman Tampn Tampn Protena A595nm al [TNB] [Prot] NTioles
(125mM) 8M de sin Urea fin de la
Urea reaccin
Blanco 8M 50L 2.75mL 0 mL 0L
Blanco 6M 50L 2.1mL 0.65mL 0L
Blanco 4M 50L 1.4 mL 1.35 mL 0L
Blanco 2M 50L 0.7mL 2.05mL 0L
Blanco 0M 50L 0mL 2.75mL 0L
TiolesAld 8M 50L 2.5mL 0mL 250L
TiolesBSA 8M 50L 2.5mL 0mL 250L
TiolesOvb 8M 50L 2.5mL 0mL 250L
TiolesAld 6M 50L 2.1mL 0.4mL 250L
TiolesBSA 6M 50L 2.1mL 0.4mL 250L
TiolesOvb 6M 50L 2.1mL 0.4mL 250L
TiolesAld 4M 50L 1.4 mL 1.1mL 250L
TiolesBSA 4M 50L 1.4 mL 1.1 mL 250L
TiolesOvb 4M 50L 1.4mL 1.1 mL 250L
TiolesAld 2M 50L 0.7mL 1.8mL 250L
TiolesBSA 2M 50L 0.7mL 1.8mL 250L
TiolesOvb 2M 50L 0.7mL 1.8mL 250L
TiolesAld 0M 50L 0mL 2.75mL 250L
TiolesBSA 0M 50L 0mL 2.75mL 250L
TiolesOvb 0M 50L 0mL 2.75mL 250L

PROT UR9 0 30 1 2 3 5 7.5 10

BSA 8M
BSA 6M
BSA 4M
BSA 2M

50 1 1 1000
8
De esta manera, se tiene un stock del reactivo de Ellman =126.16mM125mM
1 1000 0.39635 1
9
Se recomienda seguir los valores de absorbancia cada 30

4
 Experimentacin en Biotecnologa II

PROT UR10 0 30 1 2 3 5 7.5 10

BSA 0M
ALD 8M
ALD 6M
ALD4M
ALD 2M
ALD 0M
OVB 8M
OVB6M
OVB 4M
OVB 2M
OVB 0M

De manera totalmente anloga, como se indic al inicio, podemos realizar el procedimiento de

determinacin del nmero de tioles libres por protena, pero en este caso usando el laurilsulfato potsico (SDS),
detergente desnaturalizante. Es de esperar que la naturaleza del agente desnaturalizante no altere al resultado,
pero siempre es interesante probar distintas alternativas, al menos, para confirmar los resultados. Se muestra de
la misma manera la cantidad reactivo en la siguiente tabla. El tampn de fosfato potsico utilizado
rutinariamente en todo el experimento puede dar problemas al reaccionar con el SDS formando un precipitado
de sulfato de potasio. En tal caso, se sustituye por una disolucin de naturaleza equivalente, como el TrisHCl. El
coeficiente de extincin molar del TNB en 2%SDS estimado es de 12500.

Reactivos Resultados
Tubos Ellman Tampn Tampn Protena A595nm al [TNB] [Prot] NTioles
2%SDS sin SDS fin de la
reaccin
Blanco 2% 50L 2.75mL 0mL 0L
Blanco 1.5% 50L 2.10mL 0.65mL 0L
Blanco 1% 50L 1.40mL 1.35mL 0L
Blanco 0% 50L 0mL 2.8mL 0L
TiolesAld 2% 50L 2.5mL 0mL 250L
TiolesBSA 2% 50L 2.5mL 0mL 250L
TiolesOvb 2% 50L 2.5mL 0mL 250L
TiolesAld 1.5% 50L 2.10mL 0.4mL 250L
TiolesBSA 1.5% 50L 2.10mL 0.4mL 250L
TiolesOvb 1.5% 50L 2.1mL 0.4mL 250L
TiolesAld 1% 50L 1.4mL 1.1mL 250L
TiolesBSA 1% 50L 1.4mL 1.1mL 250L
TiolesOvb 1% 50L 1.4mL 1.1mL 250L
TiolesAld 0% 50L 0mL 2.8mL 250L
TiolesBSA 0% 50L 0mL 2.8mL 250L
TiolesOvb 0% 50L 0mL 2.8mL 250L

10
Se recomienda seguir los valores de absorbancia cada 30

5
 Experimentacin en Biotecnologa II

PROT SDS 0 30 1 2 3 5 7.5 10

BSA 2%
BSA 1.5%
BSA 1%
BSA 0%
ALD 2%
ALD 1.5%
ALD 1%
ALD 0%
OVB 2%
OVB 1.5%
OVB 1%
OVB 0%

Pearroya Rodrguez, Alfonso

Pedrosa Laza, Mara
Prez Fuentes, Luca
Snchez Fernndez, Rosala