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NCLEO DE ANZOTEGUI
ESCUELA DE INGENIERA Y CIENCIAS APLICADAS
DEPARTAMENTO DE INGENIERA QUMICA
ANLISIS INSTRUMENTAL
Febrero, 2017
INTRODUCCIN
La cromatografa lquida (LC) fue definida a principios del siglo XX por el trabajo del
botnico ruso Mikhail S. Tswett. Sus estudios pioneros se enfocaron en la separacin
de compuestos [pigmentos foliares], extrados de plantas usando un disolvente, en una
columna llena de partculas.
Tswett llen una columna de cristal abierta con partculas. Dos materiales especficos
que encontr tiles fueron tiza en polvo [carbonato de calcio] y almina. Verti su
muestra [extracto disolvente de hojas de plantas homogeneizadas] en la columna y le
permiti pasar al lecho de partculas. A esto le sigui un disolvente puro. A medida que
la muestra pasaba a travs de la columna por gravedad, se podan distinguir diferentes
bandas de color porque algunos componentes se movan ms rpido que otros. l
relacion estas bandas separadas, de color diferente a los diferentes compuestos que
originalmente estaban contenidos en la muestra. Haba creado una separacin
analtica de estos compuestos basada en la fuerza diferente de la atraccin qumica
de cada compuesto a las partculas. Los compuestos que se atraen ms fuertemente
a las partculas se ralentizan, mientras que otros compuestos ms fuertemente
atrados al disolvente se mueven ms rpido. Este proceso se puede describir como
sigue: los compuestos contenidos en la muestra se distribuyen, o se dividen de forma
diferente entre el disolvente en movimiento, denominado fase mvil, y las partculas,
denominadas fase estacionaria. Esto hace que cada compuesto se mueva a una
velocidad diferente, creando as una separacin de los compuestos.
Tswett acu la cromatografa conocida (de las palabras griegas chroma, que significa
color y grfico, que significa escritura, literalmente, escritura en color] para describir su
colorido experimento. Hoy en da, la cromatografa lquida, en sus diversas formas, se
ha convertido en una de las herramientas ms poderosas de la qumica analtica.
Especficamente, trataremos en este trabajo la cromatografa lquida de alto
rendimiento (HPLC) que es una forma de cromatografa en columna que bombea una
mezcla de muestras o analito en un disolvente (conocida como fase mvil) a alta
presin a travs de una columna con material de empaque cromatogrfico (fase
estacionaria). La muestra es transportada por una corriente de gas portador mvil de
helio o nitrgeno. La HPLC tiene la capacidad de separar e identificar compuestos que
estn presentes en cualquier muestra que puede disolverse en un lquido en
concentraciones de trazas tan bajas como partes por trilln. Debido a esta versatilidad,
HPLC se utiliza en una variedad de aplicaciones industriales y cientficas, tales como
farmacutica, medioambiental, forense y productos qumicos.
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CONTENIDO
Introduccin
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I Cromatografa Lquida de Alta Presin (HPLC) 1
II Tipos de cromatografa lquida 2
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I CROMATOGRAFA LIQUIDA DE ALTA PRESIN (HPLC)
La Cromatografa Lquida de Alta Presin (HPLC) o Resolucin es una tcnica de
permite separar, aislar e identificar los analitos de una mezcla de compuestos qumicos
(basada en la transferencia de masa entre la fase estacionaria y la fase mvil), por lo
que es utilizada frecuentemente en Bioqumica y Qumica Analtica para la separacin
de componentes de una sustancia determinada, basndose en diferentes tipos de
interacciones qumicas. Recientemente es una de las tcnicas ms utilizada en la
industria Qumica y de alimentos, ya que ofrece la posibilidad de identificar y cuantificar
sus componentes mediante el uso de sustancias patrn. La cromatografa de lquidos
abarca un grupo muy amplio entre los mtodos cromatogrficos, puesto que el sistema
ternario fase estacionaria/fase mvil/analito ofrece muchas y muy distintas
posibilidades para separar compuestos qumicos muy diferentes.
La cromatografa lquida clsica se lleva a cabo en una columna generalmente de
vidrio, la cual est rellena con la fase fija. Luego de sembrar la muestra en la parte
superior, se hace fluir la fase mvil a travs de la columna por efecto de la gravedad.
Con el objeto de aumentar la eficiencia en las separaciones, el tamao de las partculas
de fase fija se fue disminuyendo hasta el tamao delos micrones, lo cual gener la
necesidad de utilizar altas presiones para lograr que fluya la fase mvil. De esta
manera, naci la tcnica de cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC), que
requiere de instrumental especial que permita trabajar con las altas presiones
requeridas. La descripcin de la HPLC no se puede basar solo en la instrumentacin
sino que tambin hay que ofrecer una aproximacin sistemtica para lograr
separaciones adecuadas.
En la actualidad HPLC ha llegado a ser una de las Tcnicas del laboratorio moderno
ms importantes como herramienta analtica para separar y detectar compuestos
qumicos. Como en todas las tcnicas analticas, los pequeos problemas a la larga
pueden llegar a tener un mayor impacto en la exactitud y durabilidad del sistema. Aun
con la evolucin de los cromatgrafos lquidos en la era de la computadora, hay an
problemas que sta no puede resolver.
Hasta los Solventes para HPLC, todos filtrados cuidadosamente en la fbrica, pueden
acumular partculas en suspensin que pueden ser perjudicial a los componentes del
sistema HPLC. Estas partculas en suspensin pueden venir de varias fuentes, incluso
de la exposicin al polvo en el aire durante el trasegado de solvente en el depsito
para solvente, la exposicin a particulares del aire durante el almacenamiento del
solvente en el depsito del solvente, la degradacin lenta del recipiente solvente, o de
condensacin y polimerizacin del solvente. Las partculas pueden ocasionar costosos
daos a la bomba HPLC, al guarda columnas, y en general causar desgaste del
sistema de HPLC. Los fabricantes de los instrumentos tienen en cuenta este problema
y recomiendan que se filtre y desgasifique los solventes HPLC antes de usarlos.
La HPLC utiliza una fase mvil lquida para separar los componentes de la muestra.
Los componentes se disuelven en un disolvente y a continuacin se hacen pasar por
la columna a una gran presin. A continuacin, interactan con la fase estacionaria y
salen en momentos distintos, igual que ocurre con la cromatografa de gases. Si una
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cantidad excesiva de gas permanece disuelta en la fase mvil lquida a la presin de
la columna, el gas puede salir del detector y provocar grandes picos no deseados.
Estos pueden eliminarse mediante el burbujeo de helio de gran pureza a travs del
lquido cuando el sistema HPLC no disponga de un desgasificador integrado. El helio
debe presentar unos niveles bajos de hidrocarburos, ya que estos pueden disolverse
en el disolvente y generar ruido de lnea base.
Cabe destacar que se tienen dos fases cromatografas:
- Fase mvil: que fluye a travs de una fase estacionaria, arrastrando con ella a los
compuestos de la mezcla.
- La fase estacionaria: en la cual estn retenidos los componentes de la muestra, y a
travs de la cual fluye la fase mvil arrastrando a los mismos.
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En relacin con las polaridades relativas de las fases mvil y estacionaria, se
distinguen dos tipos de cromatografa de reparto. Inicialmente, la cromatografa de
lquidos usaba fases estacionarias de elevada polaridad tales como el agua o el
trietilenglicol soportadas sobre partculas de slice o almina; y como fase mvil se
empleaba un disolvente relativamente apolar como el hexano o el iso-propileter. Por
razones histricas, a este tipo de cromatografa se le conoce ahora como
cromatografa en fase normal. En la cromatografa en fase inversa, l fase estacionaria
es no polar, con frecuencia se trata de un hidrocarburo, y la fase mvil es relativamente
polar (como el agua, el metanol o el acetonitrilo).
2.1.1 Cromatografa en fase Normal
La cromatografa de fase normal o "Normal phase HPLC" (NP-HPLC) fue el primer tipo
de sistema HPLC utilizado en el campo de la qumica, y se caracteriza por separar los
compuestos en base a su polaridad. Esta tcnica utiliza una fase estacionaria polar y
una fase mvil apolar, y se utiliza cuando el compuesto de inters es bastante polar.
El compuesto polar se asocia y es retenido por la fase estacionaria. La fuerza de
absorcin aumenta a medida que aumenta la polaridad del compuesto y la interaccin
entre el compuesto polar y la fase estacionaria polar (en comparacin a la fase mvil)
aumenta el tiempo de retencin. La fuerza de interaccin no slo depende de los
grupos funcionales del compuesto de inters, sino tambin en factores estricos de
forma que los ismeros estructurales a menudo se pueden diferenciar el uno del otro.
La utilizacin de disolventes ms polares en la fase mvil disminuye el tiempo de
retencin de los compuestos mientras que los disolventes ms hidrofbicos tienden a
aumentar el tiempo de retencin.
En cromatografa en fase normal el componente menos polar se eluye primero, debido
a que relativamente es el ms soluble en la fase mvil y un aumento de la polaridad
de la fase mvil provoca una disminucin del timo de elucin.
En la Tabla N1 se muestran los compuestos ordenados segn su polaridad y su
elucin:
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Solvente Polaridad
n-Hexano
Menos
Isoctano polar o no
2,2,4- polar
Trimetilpentano
Tetraclorometano
o tetracloruro de
carbono
Triclorometano o
cloroformo
Diclorometano,
Cloruro de metilen
Tetrahidrofurano*
Acetona
cido actico
Metanol
Sulfuro di metlico Polar
Forma mida
agua
El sistema cromatogrfico de fase reversa fue inducido por Howard y Marln en 1950.
Hasta el momento, la cromatografa de lquidos se utilizaba bsicamente para separar
compuestos polares, siendo la fase estacionaria de un carcter altamente polar y la
fase mvil poco polar. Estos cientficos revirtieron la polaridad de las fases con el
objetivo de separar cidos grasos. As fue cmo surgi la fase reversa.
La tcnica de fase reversa, RPC (del ingls Reverse Phase Chromatography), se ha
convertido en el tipo de cromatografa ms ampliamente utilizada en HPLC e incluye
cerca de la mitad de los mtodos de la cromatografa de lquidos descritos en la
literatura. Esta tcnica proporciona retencin y selectividad ptimas cuando las
muestras tienen un carcter predominantemente aliftico o aromtico.
La RPC es un proceso de particin en donde los solutos estn distribuidos entre una
fase estacionaria no polar y una fase mvil polar. Los solutos no polares tienden a
adsorberse en la fase estacionaria y se mueven a travs del sistema ms lentamente
que los solutos polares.
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Una de las fases estacionarias ms comunes de este tipo de cromatografa es la slica
tratada con RMe 2 SiCl, dnde la R es una cadena alquil tal como C18H37OC8H17.
El tiempo de retencin es mayor para las molculas de naturaleza apolar, mientras que
las molculas de carcter polar eluyen ms rpidamente.
Como fase mvil se emplean mezclas de disolventes apolares (hexano, pentano), con
disolventes polares (cloroformo, Diclorometano, T.H.F, Etanol, metanol o acetonitrilo).
Se utiliza para la separacin de compuestos muy polares que quedaran demasiado
retenidos en una cromatografa slido lquido. En este tipo de cromatografa el orden
de elucin est gobernado por interacciones de tipo polar: Los solutos ms polares
quedan ms retenidos, igual que en la cromatografa de adsorcin.
El mecanismo que se ha propuesto para explicar el mecanismo por el cual estas
superficies retienen a los solutos es el siguiente: Cuando un soluto se disuelve en
agua, las fuerzas de atraccin entre las molculas de agua se distorsionan o se
rompen. nicamente los solutos altamente polares o inicos pueden interaccionar con
la estructura del agua. Los solutos no polares casi no interactan con estas estructuras
y como consecuencia abandonan la fase mvil para adsorberse al hidrocarburo de la
fase estacionaria. La fuerza motriz de la retencin no es la interaccin favorable del
soluto con la fase estacionaria, sino el efecto de repulsin del disolvente por el soluto.
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2.1.3 ndice de polaridad
Los disolventes que interaccionan fuertemente con los solutos a menudo se les
denomina disolventes fuertes o disolventes polares. El ndice de polaridad,
desarrollado por Synder, es aquel que describe cuantitativamente la polaridad de los
disolventes. Este se basa en las medidas de solubilidad para la sustancia en cuestin
en tres disolventes: dioxano (un aceptor de protones de dipolo dbil), nitrometano ( un
aceptor de protones de dipolo intenso) y el etanol ( un dador de protones de dipolo
intenso). El ndice de polaridad es una medida numrica de la polaridad relativa de los
disolventes. En la tabla 2 da una relacin de los ndices de polaridad para varios
disolventes que se usan en la cromatografa de reparto.
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2.2 Cromatografa de adsorcin:
Es la propiedad que tienen ciertos solidos de aumentar la concentracin en su
superficie de otras sustancias. La separacin se debe a las diferencias de adsorcin
de los componentes de una mezcla sobre la fase estacionaria. Esta fase estacionaria
ha de ser un slido polar de gran superficie (adsorbente). En este mtodo la fase mvil
puede ser un gas o un lquido dando lugar a la cromatografa gas-solido o liquido-
solido.
El grado de adsorcin va a variar segn la naturaleza y superficie especifica de los
adsorbentes y naturaleza de los solutos.
Para que la separacin de los componentes de la mezcla sea efectiva, su velocidad
de migracin a lo largo de la columna debe ser suficientemente diferente y la longitud
de la columna adecuada.
Algunos adsorbentes comnmente utilizados son: gel de slice, almina, sacarosa y
almidn.
La fase mvil consiste en un disolvente o mezcla de disolventes, seleccionado en
base a su polaridad con el fin de optimizar la separacin de los componentes de la
muestra en la columna. La fase mvil se desplaza a lo largo de la fase estacionaria
debido a la fuerza de la gravedad.
Con respecto a la forma en que sucede el fenmeno; bsicamente se llena la columna
hasta un tercio de su altura con eluyente. A continuacin, se prepara una suspensin
del adsorbente (fase estacionaria) en el eluyente (fase mvil) y se vierte lentamente
(para evitar la formacin de burbujas) en el interior de la columna. Esta operacin se
puede realizar en varias adiciones, aadiendo ms eluyente a la suspensin a medida
que sea necesario. Con el fin de favorecer una distribucin ms uniforme del
adsorbente en la columna, as como eliminar las pequeas burbujas que se puedan
haber formado, se puede golpear suavemente la pared externa de la columna comn
tubo de goma. La columna se llena hasta aproximadamente la mitad de su altura,
reservndose la parte superior para la fase mvil. Se abre la llave de la columna y se
deja fluir el eluyente hasta que la altura de ste en la columna quede aproximadamente
un milmetro por encima del adsorbente. La superficie de la fase estacionaria debe
presentar un aspecto uniforme, liso y perpendicular al eje longitudinal de la columna.
A lo largo del proceso cromatogrfico la columna nunca debe secarse, esto es,la fase
estacionaria debe encontrarse en todo momento cubierta por la fase mvil, yaque de
lo contrario la fase estacionaria se contraera y agrietara.
La muestra se deposita (siembra) en la superficie superior del adsorbente contenido
en la columna con la ayuda de una pipeta. Si la muestra es lquida se puede sembrar
directamente, si es slida se siembra una solucin concentrada de la misma en un
disolvente adecuado (de baja polaridad). Para evitar que se deforme la superficie del
adsorbente durante la adicin, se puede depositar la muestra en la pared interior de la
columna permitiendo que resbale hasta la superficie del adsorbente. Finalizada la
adicin de la muestra se abre la llave de la columna y se eluye hasta que la muestra
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sea adsorbida y el nivel del lquido quede aproximadamente 1 mmpor encima de la
superficie del adsorbente. Se lavan las paredes internas de la columna (por las que se
ha dejado resbalar la muestra) con un poco de eluyente y se eluye de nuevo hasta que
el nivel del lquido vuelva a quedar 1 mm por encima de la superficie del adsorbente.
2.3 Cromatografa inica:
Las muestras pueden entregarse en la Unidad de Cromatografa de los SCI, entre las
8-15h, una vez registrada la solicitud en la Administracin.
Las muestras lquidas deben estar preparadas (filtradas a travs de un filtro de
0,45m), transportadas en viales adecuados, segn los requisitos de la muestra, y
conservadas a 4C.
Las muestras deben estar perfectamente identificadas, tanto en los viales como en la
solicitud de ensayo. Si el nmero de muestras es elevado, para evitar problemas de
almacenamiento, es posible entregar la orden de solicitud y no entregar las muestras
hasta el da en que los tcnicos comuniquen al usuario que van a comenzar el anlisis.
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El volumen mnimo de muestra depender del nmero y tipo de anlisis solicitados.
Consultar al coordinador tcnico antes de la entrega de muestras.
En el caso de muestras que se analizan por primera vez, es conveniente proporcionar
al coordinador de la unidad toda la informacin posible acerca de las mismas para la
optimizacin del mtodo (ej.: conductividad, pH, rango de concentracin aproximado
de analito si se conoce, etc.)
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III COMPONENTES DE UN CROMATGRAFO
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de la bomba. El pequeo impulso hacia delante amortigua el pulso de flujo llevando
disolvente a la presin del sistema.
3.3 Sistema de inyeccin
A menudo, el factor limitante en la precisin de las medidas en cromatografa de
lquidos es la reproducibilidad con que se puede introducir la muestra en la columna.
El problema se agrava por el ensanchamiento de banda que acompaa a la
sobrecarga de las columnas. Por ello, los volmenes que se emplean han de ser muy
pequeos, de unas pocas dcimas de microlitro a tal vez 500 L. Adems, se ha de
poder introducir la muestra sin despresurizar el sistema.
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3.4 Columnas
3.4.2 Precolumnas
3.4.3 Termostatos
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3.4.4 Tipos de rellenos de la columna
3.5 Detectores
Un detector ideal para cromatografa de lquidos debera poseer todas las propiedades
listadas en relacin con la cromatografa de gases, con la excepcin de que un detector
para cromatografa de lquidos no es necesario que sea sensible en un intervalo tan
grande de temperaturas. Adems, un detector de HPLC debe tener un volumen interno
mnimo a fin de reducir el ensanchamiento de banda.
Los detectores en cromatografia de lquidos son de dos tipos bsicos. Los detectores
basados en una propiedad de la disolucin responden a una propiedad de la fase
mvil, tal como el ndice de refraccin, la constante dielctrica, o la densidad, que se
modifica por la presencia de los analitos. Por contraste, los detectores basados en una
propiedad del soluto responden a alguna de las propiedades del soluto, como la
absorbancia UV, fluorescencia, o intensidad de difusin, que no son propias de la fase
mvil.
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menor posible, de modo que los volmenes se limitan por lo comn de 1 a 10 L y las
longitudes de la cubeta de 2 a 10 mm. La utilizacin de cubetas de este tipo est
restringida a presiones no mayores de unos 50 kg/cm2.
Los detectores de absorcin UV ms simples son los fotmetros de filtros con una
lmpara de mercurio como fuente. Lo ms comn en estos casos es aislar la lnea
intensa a 254 nm por medio de filtros; en algunos equipos tambin se pueden utilizar
las lneas a 250, 313, 334 y 365 nm empleando otros filtros. Resulta obvio que este
tipo de detector se utiliza de forma restringida para aquellos solutos que absorben a
alguna de estas longitudes de onda. Algunos grupos funcionales orgnicos y diversas
especies inorgnicas exhiben una banda ancha de absorcin a una o ms de esas
longitudes de onda.
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completos con fines de identificacin, se puede parar el flujo del eluyente durante un
tiempo suficiente que permita el barrido de la regin de longitud de onda que interesa.
Una de las mayores limitaciones al uso de los detectores de infrarrojo se debe a la baja
transparencia de muchos de los disolventes que se utilizan. Por ejemplo, las bandas
anchas de absorcin infrarroja del agua y de los alcoholes impiden prcticamente el
uso de este detector para muchas aplicaciones.
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3.5.6 Detectores de ndice de refraccin
Los detectores de ndice de refraccin tienen la ventaja de que responden a casi todos
los solutos. Es decir, son detectores universales anlogos a los detectores de llama en
cromatografa de gases. Adems, son fiables y no dependen del caudal. Sin embargo,
son muy sensibles a los cambios de temperatura, y se han de mantener a una
temperatura constante en unas pocas milsimas de grado centgrado. Por otra parte,
no son tan sensibles como la mayora de los otros detectores, y por lo general no se
pueden utilizar en la elucin con gradiente.
Una de las mayores ventajas de este tipo de detector es que su respuesta resulta ser
aproximadamente la misma para todos los solutos no voltiles. Adems, es
notablemente ms sensible que el detector de ndice de refraccin.
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IV CONCLUSIN
La cromatografa de lquidos de alta eficacia es la tcnica analtica de separacin ms
ampliamente utilizada, con unas ventas anuales de equipos de HPLC que se
aproximan a la cifra de mil millones de dlares. Las razones de la popularidad de esta
tcnica son su sensibilidad, su fcil adaptacin a las determinaciones cuantitativas
exactas, su idoneidad para la separacin de especies no voltiles o termolbiles y,
sobre todo, su gran aplicabilidad a sustancias que son de primordial inters en la
industria, en muchos campos de la ciencia y para la sociedad en general. Algunos
ejemplos de los materiales incluyen aminocidos, protenas, frmacos, terpenoides,
plaguicidas, antibiticos, esteroides, especies rgano metlicas y una variedad de
sustancias inorgnicas.
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V BIBLIOGRAFA
- Waters, the science oh whats possible. (2014). HPLC - High Performance Liquid
Chromatography. Recuperado de: http://www.waters.com/waters/es_VE/HPLC---
High-Performance-Liquid-Chromatography-
explained/nav.htm?cid=10048919&locale=es_VE.
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