PRACTICA N 4

MTODOS DE COLORACIN
Marco terico

1 Coloracin Simple:

Aquella coloracin en la que se utiliza slo un colorante, el cual va a permitir visualizar

la morfologa de los microorganismos.

2 Coloracin Gram:
La diferenciacin de Gram se basa en el color que adquieren las bacterias cuando se
tratan con el colorante cristal violeta seguido por una solucin yodoyodurada de
potasio, para luego someterlas a una decoloracin despus de la cual se usa una
coloracin de contraste, casi siempre safranina. Las bacterias gram-positivas
(coloracin azul o morada) son resistentes a la decoloracin y conservan el complejo
cristal violeta-yodo, los microorganismos gram-negativos, toman la coloracin de
contraste (coloracin rosa o roja).
3 Coloracin cido Resistente (Coloracin de Ziehl Neelsen):
En este mtodo de tincin, el colorante primario, fucsina cida, se formula con fenol
para permitir el paso a travs de las paredes celulares de las micobacterias. El
portaobjeto se calienta para facilitar la penetracin y se utiliza alcohol etlico como
decolorante. Sin embargo, el reactivo se prepara con cido clorhdrico para ayudar a la
decoloracin de las clulas que no son cido resistentes.
4 Coloracin de Esporas:
Para la observacin de esporas, es necesario que el colorante penetre la pared de la
espora, la cual es relativamente impermeable, razn por la que se necesita de
calentamiento.

5 Coloracin Negativa:
La tcnica de la tincin negativa incorpora materiales tales como la nigrosina o la tinta
china, que al estar compuesta de partculas demasiado grandes para penetrar en una
clula, permiten observar algunos microorganismos que permanecen sin teir y que
resaltan sobre un fondo oscuro; se utiliza principalmente para observar la cpsula
bacteriana.

4. 2 Competencias

Capacita y adiestra al estudiante para que (el) (la):

- Realice manualmente mtodos de tincin habituales usados en la preparacin
de lminas de observacin
- Describa minuciosamente sus observaciones, al microscopio
4.3 Materiales y equipos

Cultivos bacterianos:
- Cultivo de Escherichia coli
- Cultivo de Staphylococcus aureus
- Cultivo de Klebsiella
Lmina fijada con frotis de Mycobacterium tuberculosis
1 Coloracin simple:
- Azul de Metileno
2 Coloracin Gram:
- Violeta de genciana (colorante primario)
- Lugol (mordiente)
- alcohol acetona (decolorante)
- Fucsina bsica (colorante de contraste
3. Coloracin cido Resistente:
- Fucsina fenicada al 5% (colorante primario)
- Alcohol cido (decolorante)
- Azul de metileno (colorante de contraste)
4. Coloracin de Esporas:
- Solucin de azul de metileno
- Solucin saturada alcohlica de eosina
5. Coloracin negativa:
- Tinta china

4 Procedimiento

1 Coloracin simple:

- Prepara un frotis a partir del cultivo proporcionado.

- Fija al calor.
- Cubre el frotis con el colorante Azul de Metileno y deja actuar por 3 a 5
minutos.
- Lava con agua y deja secar.
- Observa al microscopio con objetivo de inmersin.
2 Coloracin Gram:
- Prepara frotices de cultivos de E. coli y S. aureus.
- Deja secar al aire y fija con calor.
- Cubre los frotices con reactivo de cristal violeta durante un minuto.
- Lava los portaobjetos con agua corriente durante 5 segundos.
-Cubre el frotis con la solucin de lugol y deja actuar durante 2 minutos.
 -Lava con agua corriente, y aplica lentamente el alcohol acetona y seguir
agregando hasta que la tintura ya no fluya del frotis.
- Lava inmediatamente con agua corriente.
- Cubrir el frotis con la solucin de safranina durante 30 segundos.
- Lava con agua corriente y deja secar la preparacin.
- Observa al microscopio utilizando el lente de inmersin.
3 Coloracin cido Resistente:
- Cubre el frotis proporcionado con fucsina fenicada al 5% (carbolfucsina) y
dejarlo reposar de 30 a 60 segundos antes de calentarlo.
- Calienta la preparacin con suavidad, haciendo pasar el mechero de alcohol
por debajo del portaobjeto. Seguir calentando hasta que se observe el
desprendimiento de vapores. Evitar que el colorante hierva. Repetir 2 veces
ms.
- Enfra y lava con agua corriente.
- Decolora con alcohol cido hasta que no arrastre colorante.
- Lava con agua corriente.
- Cubrir el frotis con azul de metileno, durante 1 minuto.
- Lava con agua corriente.
- Deja secar al aire.
- Observa al microscopio con lente de inmersin. Las bacterias cido
alcohol resistentes se tien de rojo y los dems microorganismos de color
azul
4 Coloracin de Esporas:
- Haga un frotis fino y fije a la llama.
- Cubre con azul de metileno y calienta hasta hervir en forma intermitente por
1 minuto.
- Lava con agua destilada.
-Cubre con una mezcla de solucin saturada alcohlica de Eosina por 30
segundos.
- Lava con agua destilada y deja secar al aire.
- Examina al microscopio con lente de inmersin.
5 Coloracin negativa:

- Coloca varias asadas de cultivo en un portaobjetos limpio, cerca de uno de

los bordes.
- Coloca un volumen igual de tinta china cerca del cultivo.
- Mezcla bien con el asa y luego extiende la mezcla a lo largo del
portaobjetos, utilizando la tcnica del frotis sanguneo.
- Deja secar el frotis.
 - Cubre con safranina durante 10 segundos, luego enjuaga con cuidado y deja
secar al aire.
- Observa al microscopio con lente de inmersin. Al examinar la preparacin,
la cpsula aparecer como una zona transparente que rodea a la pared
celular.
-
Materiales y equipos

Cultivo de Escherichia coli Alcohol- cetona Microscopio

Cultivo de Staphylococcus
Agua destilada Tubos de ensayo
aureus
Placa Petri y soporte de
Cultivo de Klebsiella Lugol
varillas de vidrio
Zafranina Cristal violeta Mechero de bunsen

PROCEDIMIENTO:

Preparar un frontice de cultivos de E.

coli o de S. aureus.. Agregar una gota de
agua cogiendo un microorganismo y
expandirlo por todo el portaobjeto,
flamear en el mechero de bunsen hasta
que se seque.
Luego el portaobjeto se coloc en un
soporte de varillas de vidrio y se
procedi a cubrir los el portaobjeto con
reactivo de cristal violeta durante un
minuto. Y luego se enjuago con el agua
destilada

Una vez realizado esto se cubre el

frontis con la solucin de lugol y deja
actuar durante 2 minutos. Luego se
vuelve a enjuagar con el agua
destilada.
Aplicar lentamente el alcohol acetona
y seguir agregando hasta que la
tintura ya no fluya del frotis. Y lavar
inmediatamente con agua destilada..

Cubrir el frotis con la solucin

de safranina durante 30
segundos. Lava con agua
destilada y deja secar la
preparacin.
 Observa al microscopio
utilizando el lente de
inmersin.

OBSERVACIONES:

Se identificaron bacilos Gram negativos

CUESTIONARIO
1 Qu importancia tiene la pared celular bacteriana en la coloracin de Gram?

La pared celular es responsable de lo que le

sucede al colorante utilizado en la Tincin de Gram.
La propiedad de teirse o no de violeta oscuro
(Gram positivas o Gram negativas) por esta
coloracin es un criterio de clasificacin importante
correlacionable con otras propiedades bacterianas
.Las Gram-positivas como las Gram-negativas
captan la misma cantidad de cristal violeta (CV) e
iodo (I). El complejo CV-I sin embargo es atrapado
dentro de la clula Gram positiva por la
deshidratacin y la reduccin del tamao de los
poros de la pared resultante del proceso de lavado
con solvente. En contraste en las Gram negativas
la fina (y probablemente discontinua) capa de
peptidoglicano no impide la extraccin por el solvente del complejo.

2 Cules son las diferencias qumicas importantes que explican el estado cido-
resistente?

Tincin diferencial: Mtodo cido resistente (ZIEHL-NEELSEN)

Las paredes celulares de ciertos parsitos y bacterias contienen cidos grasos
(cidos miclicos) de cadena larga (50 a 90 tomos de carbono) que les confieren la
propiedad de resistir la decoloracn con alcohol-cido, despus de la tincin con
colorantes bsicos. Por esto se denominan cido-alcohol resistentes. El frotis se tie
durante unos 5 min con Fucsina fenicada aplicando calor suave. Lavar con agua.
Decolorar con alcohol etlico 95% con un 3% de ClH concentrado. Lavar y teir
durante 30-60 seg con Azul de Metileno (color de contraste). Lavar y secar

PROCEDIMIENTO:
M. M. TUBERCULOSIS