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La cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) una tecnica analitica

strumentale utilizzata per la separazione, l'identificazione e l'analisi quantitativa delle


sostanze in diverse matrici. E' un' evoluzione rispetto alla cromatografia liquida su
colonna e viene usata principalmente per avere una migliore risoluzione, risposte
riproducibili e velocit di analisi maggiori. Il campione da analizzare iniettato
all'inizio della colonna e spinto lungo la fase stazionaria dalla fase mobile applicando
pressioni dell'ordine delle centinaia di atmosfere.
L'elevata pressione necessaria in quanto le dimensioni delle particelle sono molto
ridotte e quindi indispensabile per avere velocit di separazione accettabili.
L'impaccamento sottile garantisce maggiore efficienza e risoluzione. L'efficienza
indica la capacit di un sistema cromatografico di eluire tutte le particelle di una
stessa specie chimica con la stessa velocit, in modo da ottenere picchi stretti e viene
definita con N (numero di piatti teorici) che dato dalla seguente espressione:

N=16*(t/W)*2

dove:
t= tempo di ritenzione
W=larghezza alla base del picco

Dal numero di piatti teorici possiamo determinare l'altezza del piatto definita con H:

H=L/N

dove L rappresenta la lunghezza della colonna.


Esiste una relazione tra l'altezza del piatto teorico e l'allargamento della banda nota
come equazione di van Deemter:

H=A+B/u+C*u

Dove le costanti A,B,C sono rispettivamente i coefficienti per gli effetti di cammino
multiplo, diffusione longitudinale e il trasferimento di massa. La costante A il
motivo per il quale una banda cromatografica somiglia a una curva gaussiana e sono
dovuti ai movimenti casuali delle diverse molecole che costituiscono una banda nel
suo movimento lungo la colonna. La costante B lo spostamento di un soluto dal
centro di una banda a regioni in cui la concentrazione minore. La costante C infine
un'ulteriore fonte dell'allargamento di banda e pu avvenire sia nella fase
stazionaria che nella fase mobile.
Nella sua forma completa l'equazione si presenta cos:

H=2**d+(2**D/u)+f(k)d*2*u/D
Dove:
un fattore associato alla granulometria e all'impaccamento della colonna;
d il diametro della particella di impaccamento;
il fattore di tortuosit che dipende dall'impaccamento della colonna;
D il coefficiente di diffusione nella fase mobile;
u la velocit lineare della fase mobile;
f(k) il fattore di ritenzione che indica il tempo che un soluto trascorre nella fase
stazionaria rispetto a quello passato nella fase mobile.
Si pu notare dall'Equazione che le dimensioni del materiale di impaccamento hanno
un ruolo significativo nell'abbassare l'altezza del piatto teorico e quindi aumentarne il
numero.
In HPLC la dimensione dell'impaccamento dell'ordine dei 3-5m di diametro e le
pressioni richieste sono espresse in psi e arrivano al massimo a 8000.
L'intervallo di pressione (P) dato da:

P=**L*u/(d*2*p)

dove il fattore di resistenza della colonna e la viscosit della fase mobile. La


velocit lineare inversamente proporzionale al diametro delle particelle. Un altro
fattore da considerare la il gradiente di temperatura longitudinale e radiale che si
viene a verificare tra il centro della colonna e le pareti dovuti ad attrito tra la fase
mobile e le particelle del materiale di impaccamento. Un gradiente di temperatura
radiale pu ridurre l'efficienza della colonna a causa della distribuzione radiale
eterogenea della velocit della fase. Un gradiente di temperatura longitudinale pu
causare una diminuzione dei fattori di ritenzioni degli analiti. Per risolvere questi
inconvenienti bisogna ridurre il diametro della colonna. La massima differenza di
temperatura tra il centro e le pareti della colonna descritto da:

T=q*R^2/(4*)

dove q il flusso termico, R il raggio della colonna e la conduttivit termica


radiale dell'impaccamento della colonna. Da questa relazione si evince che al
diminuire del diametro della colonna, diminuisce il gradiente di temperatura radiale.
In generale le colonne utilizzate in HPLC hanno un diametro compreso tra 2.0-4.6
m.
Per quanto riguarda i rivelatori, un buon rivelatore deve avere le seguenti
caratteristiche:

Sensibilit adeguata, che ovviamente dipende sia dalle particolari esigenze


dell'operatore che dal tipo di campione da analizzare;
Buona stabilit e riproducibilit;
Risposta lineare per pi ordini di grandezza;
Tempo di risposta breve;
Elevata facilit d'uso e affidabilit;
Uniformit di risposta nei confronti di tutti gli analiti o al contrario elevata specificit
per particolari composti;
Rivelazione non distruttiva;
Piccolo volume interno per evitare allargamento delle bande.
Rivelatori pi usati sono ad assorbimento UV, vi sono poi i metodi a fluorescenza,
sull'indice di rifrazione, la costante dielettrica, rivelatori elettrochimici, a
spettrometro di massa ed altri ancora.
I rivelatori a fluorescenza presentano il vantaggio di una maggiore sensibilit rispetto
ai metodi ad assorbanza, di solito superiore a un ordine di grandezza. Hanno per lo
svantaggio di un minore campo di applicabilit, dato che il numero delle specie
assorbenti notevolmente superiore rispetto a quelle fluorescenti. Si possono
comunque usare rivelatori a fluorescenza anche per analiti non fluorescenti se si
riesce a trattarli con reagenti che diano prodotti fluorescenti.
La fluorescenza viene osservata attraverso un detector fotoelettrico posto a 90
rispetto alla sorgente di eccitazione, che di solito una lampada a mercurio. La
radiazione fluorescente viene isolata attraverso dei filtri.
I pi semplici fotometri per HPLC usano una lampada a mercurio, di cui si seleziona
di solito la banda centrata a 254 nm, ma si usano anche le bande a 250, 313, 334, e
365 nm. Diversi gruppi funzionali assorbono a queste lunghezze d'onda sia organici
che inorganici. Vengono anche usate sorgenti a deuterio o a tungsteno, dotati di tutta
una serie di filtri. Di solito la gestione dei filtri affidata a un elaboratore elettronico
che ottimizza la scelta.