Transmisin

Antecedentes:
1924 De Broglie describi el movimiento de los electrones

1926 Busch los campos magnticos con la dimensin y

forma apropiada pueden utilizarse como
lentes para enfocar un haz de electrones

1932 Knoll y Ruska Disean el primer me con dos lentes

Berln electromagnticas de aumento y un haz de
electrones

1935 EL PRIMER ME de alta resolucin

1939 Alemania (SIEMENS y AEG) COMERCIALIZACIN.

TIPOS DE ME:
TEM ME transmsin Transmission electron microscope
CEM (Conventional EM)
CTEM (Conventional TEM)

SEM ME de barrido Scanning electron microscope

OTROS TIPOS
STEM Combinacin de TEM y SEM Scanning transmission
electron microscope

HVEM ME de alto voltaje cortes ms gruesos

EL MICROSCOPIO ELECTRNICO EN ESENCIA
Fundamentos:
Las radiaciones electromagnticas poseen una longitud de onda de propagacin
muy corta.
Los electrones se desvan de su trayectoria recta de propagacin cuando
atraviesan un campo magntico circular.
Al producirse un alto vaco los electrones se desprenden de la fuente luminosa
formada por wolframio incandescente.

Fuente y flujo de electrones

La fuente es un ctodo constituido por un filamento de wolframio incandescente.
Los electrones son trmicamente arrancados a baja velocidad.
Los electrones son acelerados mediante la creacin de un alto potencial (cilindro
de Wehnelt), el cual permite una trayectoria rectilnea de los electrones de muy
baja longitud de onda.
Los electrones se desvan de su trayectoria al atravesar un campo
electromagntico (lente electromagntica).
La desviacin se acenta al colocar varias lentes
Un haz muy desviado, muy abierto, se recoge en una pantalla fluoroscpica para
poder ser visible al ojo humano.
Un MET consta fundamentalmente de:

Una columna

Un Sistema de vaco

Una fuente de alta tensin elctrica

Un sistema de refrigeracin

Un control de mandos
La COLUMNA consta de:

Fuente de iluminacin (can de electrones)

Las lentes

El sistema de visualizacin

El diseo bsico de la columna es comparable al

microscopio de luz
Comparacin entre el diseo de un microscopio de luz y un TEM.
El can de electrones es un sistema que genera un
flujo de electrones con la velocidad y direccin
adecuadas. Est formado por:

Un filamento o ctodo

Un nodo perforado

Un cilindro protector (cilindro de Wehnelt)

Filamento (o ctodo) de wolframio (tungsteno) o hexacarburo de lantano:

1. Est conectado a una fuente de alta tensin

2. La diferencia de potencial nodo-ctodo hace que los electrones

adquieran energa

3. Son acelerados hacia el nodo

4. El cilindro protector tiene la base perforada, garantizando la

orientacin correcta de los electrones.
La columna consta de:

Fuente de iluminacin (can de electrones)

Las lentes
El sistema de visualizacin
Las lentes son bobinas electromagnticas por las que
circula corriente elctrica generando un campo
electromagntico.
Los primeros microscopios incluan tres lentes:

Condensador

Objetivos

Lente proyectora
El inyector de muestra se sita entre el condensador y el
objetivo
Los microscopios modernos poseen ms lentes:

2 ms condensadores

Lentes intermedias

2 ms lentes proyectoras
Las lentes intermedia y proyectoras
Se sitan por debajo
Magnifican la imagen obtenida
Magnifican aumentos en funcin del campo
magntico obtenido
Adems, existen diafragmas o aperturas de las lentes
que son atravesados por el haz de electrones
Microscopio electrnico de transmisin
Microscopa electrnica de transmisin
PORTAOBJETOS
Se utilizan rejillas de cobre, nquel o rodio. El haz
de electrones no atravesara el vidrio.
Los obstculos al paso de los electrones:
La propia muestra
Entramado de la rejilla
Portamuestras (rejilla)
Para visualizar la imagen originada por los electrones es
necesario convertir la imagen visible por el ojo humano.

Esta imagen se puede obtener de dos maneras

Visualizacin directa en una pantalla fluorescente
Mediante la gnesis de una imagen fotogrfica o
digitalizada
 Resolucin del microscopio electrnico

Poder de resolucin: Capacidad de distinguir como dos imgenes distintas dos

puntos muy cercanos. Distancia mnima entre dos puntos para que puedan
distinguirse:

* Ojo humano: 0,23 mm = 230 mm = 23 X 104 nm

* Mic. ptico: 0,23 mm X 1000 = 23 X 107 nm
* Mic. Electrn: 0,23 mm X 1000 X 240 = 23 X 240 X 107 nm
 Resolucin del microscopio electrnico
Ecuacin de Abbe:

AN puede variarse para disminuir el LR.

depende del voltaje aplicado, que segn la
Ecuacin de De Broglie:
Al emitirse un haz de electrones puede ocurrir:
1. Transmisin de electrones a travs de la muestra

2. Retrodispersin de electrones (electrones primarios)

3. Emisin de electrones de la propia muestra (electrones secundarios)

4. Emisin de otras radiacciones

Formacin de la imagen
1. Los electrones no dispersados descienden hasta
impactar con la pantalla.
2. Los electrones dispersados, dependiendo del ngulo,
pueden abandonar el campo de visin
Preparacin de muestras para TEM

Inclusin y corte fino

Desintegracin y obtencin de extensiones
Rplicas de superficie
Inclusin y corte
Fijacin de la muestra

Fijacin fsica (criofijacin)

Inmersin en propano lquido
Impacto metlico

Fijacin qumica
Glutaraldehido 2 %
Paraformaldehido 6 %
Mezclas de fijadores

Post-fijacin
Tetrxido de osmio 1 %
Inclusin en resina

Lavado
Deshidratacin (acetona o metanol)
Aclaramiento (xido de propileno)
Infiltracin
Resinas acrlicas (Lowicryl)
Resinas epoxi (Epon)

Confeccin de los bloques

Preparacin de rejillas Microscopa
Electrnica

Realizacin de cortes con

Ultramicrotomo
Ultracriotomo

Colocacin sobre rejillas

REALIZACIN DE SEMIFINOS: Por ello es frecuente hacer secciones de
0.5 a 1-2 m de grosor con el ultramicrotomo, para orientarnos en la
muestra y seleccionar la zona a partir de la cual haremos las secciones
ultrafinas. Los semifinos suelen tener reas ms grandes que las que
posteriormente vamos a usar para la obtencin de las secciones ultrafinas.
REALIZACIN DE ULTRAFINOS: Secciones de 10 a 100 nm de grosor
con el ultramicrotomo.
Portamuestras (rejilla)
Pelcula de soporte (Formvar)
 Contraste de los cortes
Acetato de uranilo
Lavado
Citrato de plomo
Lavado
Secado
Preparacin de muestras para TEM

Inclusin y corte fino

Desintegracin y obtencin de extensiones

Rplicas de superficie
ESTUDIO DE EXTENSIONES
Deben ser finas para estudiarlas con distintos mtodos de
contraste.

Son ejemplos:

1. Contraste negativo de extensiones (1955)

2. Sombreado metlico (1946)

Contraste negativo de extensiones
Los pasos a seguir son:

1. Fijacin

2. Embeber el material en fase lquida que rodea las

partculas

3. Secar: Se forma una pelcula slida densa a los

electrones
Contraste negativo de extensiones
Las partculas se observan claras y rodeadas de material oscuro
(efecto contrario).
Da un aspecto tridimensional: se resalta el relieve de la muestra
Contraste negativo de extensiones
Los materiales son sales de metales pesados muy solubles en
agua (no precipita) y de pequeo tamao:

1. Sales de fosfotungstato

2. Sales de Uranilo

3. Sales de Cadmio

4. Sales de Molibdeno
Mitocondria tras un choque hipotnico. Contraste negativo con fosfotungstato
 TEM, tincin negativa

Actina F Bacterifago T4
 TEM, tincin negativa

ADN y cpside, bacterifago T4

Sombreado metlico
Se usan metales pesados, pero no sus sales.

El metal se evapora sobre su superficie, slo a un lado de la

muestra y queda la sombra del otro lado
Sombreado metlico

La imagen que se observa es la de un objeto oscuro junto a una

sombra clara.

Se pueden obtener imgenes invertidas.

Puede ser unidireccional (un foco de evaporacin) o rotatorio (la

estructura queda bien delimitada).
Sombreado metlico
Los metales ms usados son:

1. Platino

2. Paladio

3. Iridio

4. Tungsteno

5. Tntalo
Sombreado metlico
Es muy til para estudiar macromolculas como:

1. Filamentos

2. cidos nucleicos
TEM, sombreado

Miosina
 Virus del Mosaico del Tabaco

TEM, sombreado TEM, tincin negativa

Preparacin de muestras para TEM

Inclusin y corte fino

Desintegracin y obtencin de extensiones

Rplicas de superficie
 Rplicas de superficie
Consiste en la copia de la superficie fina y transparente para su
observacin al TEM. Se utilizan materiales plsticos.
 Rplicas de superficie

1.Se utilizan materiales plsticos, carbono y materiales similares. Las ms

resistentes son las plsticas.

2. La separacin se hace por medios qumicos como disolucin, oxidacin

o digestin de la muestra
 Rplicas de superficie
Algunas veces se sombrea antes de recoger la rplica
 Criotcnicas
Su finalidad es reducir los cambios introducidos por protocolos qumicos
convencionales.

Suelen comenzar por una criofijacin

Las ventajas:
1. Se reduce la perdida de componentes solubles (no hay
extraccin)
2. Se conserva mejor la conformacin molecular: FACILIDAD DE
DETECTAR ANTIGENOS.
 Criotcnicas

Desventajas:
1. No suelen ser de rutina
2. Aparataje especial.

Ejemplos:
1. Criofractura
2. Criograbado.
Criofractura
Criofractura y rplica. Criograbado

1. Criofijacin
2. Fractura
3. Sublimacin del hielo en vacio
4. Rplica
5. Eliminar la muestra biolgica
6. Sombreado
Criofractura y sombreado

Clula Vegetal
 TEM
Criofractura y sombreado

Cloroplasto Unin gap, Miocardiocito

Criofractura y criograbado
 TEM, criograbado

Filamentos de actina
 TEM, criograbado

Actina y miosina, clula muscular

TEM, criograbado

cloroplasto
 TEM, criograbado

Citoesqueleto, vesculas revestidas

Microscopio Electrnico
de Alto Voltaje

Mayor poder de penetracin

Muestras ms gruesas
Reconstruccin tridimensional