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Grupo: T-3B
EQUIPO 4
Introduccion a los medios de cultivo
Un medio de cultivo consta de un gel o una solucin que cuenta con los nutrientes necesarios para permitir, en
condiciones favorables de pH y temperatura, el crecimiento de
virus, microorganismos, clulas, tejidos vegetales o incluso
pequeas plantas. Segn lo que se quiera hacer crecer, el medio
requerir unas u otras condiciones. Generalmente se presentan
desecados en forma de polvo fino o granular antes de ser
preparados; ya preparados pueden encontrarse en estado slido,
semislido o lquido. El objetivo ltimo del cultivo es variado:
antibiograma, identificacin, multiplicacin. Uno de los sistemas
ms importantes para la identificacin de microorganismos es
observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales
preparadas en el laboratorio.
El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el
Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el
Cultivo. Se han preparado ms de 10.000 medios de cultivo diferentes.
Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de
condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presin de oxgeno adecuadas, as como un grado
correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento
necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante.
Los virus, por ejemplo, son obligados parsitos intracelulares, por lo que necesitan un medio que contenga
clulas vivas.
Clasificacin
Segn sus cualidades fsicas, se distinguen:
Segn su origen:
naturales: son los preparados a partir de sustancias naturales de origen animal o vegetal como ser extractos de
tejidos o infusiones y cuya composicin qumica no se conoce exactamente.
sintticos: son los medios que contienen una composicin qumica definida cualitativamente y cuantitativamente.
Se utilizan para obtener resultados reproducibles.
semisintticos: son los sintticos a los que se les aaden factores de crecimiento bajo una forma de un extracto
orgnico complejo, como por ejemplo extracto de levadura.
Segn su formulacin:
qumicamente definidos: se conoce la cantidad exacta de cada uno de los compuestos que hay en el medio.
complejos: se realizan a partir de extractos naturales (extracto de levadura, sangre, etc.); no se conoce
exactamente cul es la composicin del medio; sin embargo, presenta la ventaja de que ya estn presentes
todos o casi todos los elementos que una clula puede requerir.
Segn su uso:
medio general: medio en donde crecen todo tipo de microorganismos, excepto los que necesitan condiciones
especiales (por ejemplo, agar CLED).
medio selectivo: permite seleccionar el crecimiento de una especie o grupo determinado (hongos, bacterias
entricas, protozoos...).
medio diferencial: permite identificar una especie con otra, ambas en el mismo medio. Puede ser por su
crecimiento, su metabolismo,su respiracin, etc. (por ejemplo, medio de McConkey).
medio de enriquecimiento: contiene los nutrientes necesarios para apoyar el crecimiento de una amplia variedad
de microorganismos, se utiliza para la cosecha de diferentes tipos de microorganismos en un mismo medio.
medio mnimo: contiene la mnima cantidad de nutrientes posible que permite el crecimiento de una especie;
medio de transporte: preparado para servir como almacenamiento temporal a especmenes transportados o en
transferencia; mantienen su viabilidad y su concentracin;
simple
Medio selectivo
Un medio selectivo es un medio de cultivo en el que slo puede crecer un tipo de microorganismo (hongos,
bacterias entricas, protozoos...).
Un ejemplo de medio selectivo sera usar un medio rico en un antibitico, como la ampicilina, para permitir
nicamente el crecimiento de las bacterias resistentes a ste.
Agar sulfito Inhibidor: bismuto y el Selectivo y Aislamiento Colonias con bordes claros y
de bismuto colorante verde Diferencial. selectivo de punto central
brillante. Sulfato ferroso Muy Salmonella typhi negro.
y sulfito como agentes inestable, no
diferenciales. se puede usar
al cabo de
una semana
tras su
preparacin.
Agar verde Inhibidor: colorante Selectivo y Aislamiento Colonias de Salmonella
brillante verde brillante (inhibe Diferencial selectivo de rosas, blancas o
gram positivas). Incluye especies de transparentes, dependiendo
lactosa y sacarosa. Rojo Salmonella, salvo de la fermentacin de los
fenol como indicador. S. typhi y S. azcares
paratyphi. No se
recomienda para
Shigella
Agar Agar sangre, con la Ya no es diferencial. Medio selectivo ----
chocolate con sangre lisada (por Los eritrocitos lisados modificado para el
Isovitalex y calentamiento a 80C). liberan la hemoglobina aislamiento de Neisseria
vancomicina Se aade isovitalex y otros nutrientes y Haemophilus
(suplemento vitamnico, como factor X
aminocidos, Fe, (hemina) y factor V
glucosa, etc.) y (NAD). El aadido de
vancomicina para inhibir vitaminas,
gram positivos aminocidos, glucosa,
Fe, etc. permite el
crecimiento de
Neisseria y
Haemophilus
Agar salino Inhibidor: cloruro sdico Selectivo y Aislamiento selectivo Los estafilococos
manitol al 7,5%. Manitol como diferencial de estafilococos y coagulasa positivos
(Chapman) agente diferencial, rojo micrococos (Staphylococcusaureus)
fenol como indicador. fermentan el manitol y dan
colonias amarillas. Los
estafilococos que no
fermentan el manitol (p.e.,
S. epidermidis) dan
colonias blancas o del
color del medio.
Agar Agar base Columbia No es Aislamiento de cocos ----
Columbia con colistina y cido diferencial gram positivos
CNA nalidxico
Agar selectivo Inhibidores: cristal Selectivo y Aislamiento selectivo Permite ver hemlisis
para violeta y antibiticos Diferencial de S. pyogenes (beta).
estreptococos (trimetoprimsulfametoxa (garganta) y S.
zol y colistina). Tambin agalactiae
lleva sangre.
Agar PEA Inhibidor: alcohol fenil- Selectivo. Si Aislamiento selectivo Si lleva sangre se
(alcohol fenil etlico (inhibe gram lleva sangre de cocos gram observan reacciones
etlico) negativas). Tambin se es diferencial positivos hemolticas. Si no, no es
puede aadir 5% (estafilococos y diferencial.
sangre de oveja estreptococos).
Tambin para cocos
gram positivos
anaerobios si se
incuba en
anaerobiosis.
Agar sangre Sangre lacada Selectivo. No Aislamiento selectivo ----
lacada con (congeladadescongelad es diferencial de anaerobios,
kanamicina y a). Agentes inhibidores: fundamentalmente
vancomicina antibiticos gram negativos, de
(KVLB) (kanamicina, inhibe muestras en las que
algunos gram negativos hay microbiota aerobia
aerbios, y y anaerobia
vancomicina, que inhibe mezcladas.
gram positivos em
general).
BHI + dem. a BHI + Selectivo. No Aislamiento selectivo ----
Antibiticos cicloheximida (inhibe es diferencial de hongos patgenos
hongos saprfitos) +
cloranfenicol
(antibacteriano)
El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve afectado por una serie de factores
de gran importancia y que, en algunos casos, son ajenos por completo al propio medio.
Un medio de cultivo adecuado para la investigacin microbiolgica ha de contener, como mnimo, carbono,
nitrgeno, azufre, fsforo y sales inorgnicas. En muchos casos sern necesarias ciertas vitaminas y otras
sustancia inductoras del crecimiento. Siempre han de estar presentes las sustancias adecuadas para ejercer de
donantes o captadores de electrones para las reacciones qumicas que tengan lugar. Todas estas sustancias se
suministraban originalmente en forma de infusiones de carne, extractos de carne o extractos de levadura. Sin
embargo, la 5 preparacin de estas sustancias para su aplicacin a los medios de cultivo provocaban la prdida
de los factores nutritivos lbiles.
Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas especficas por lo que se aade a muchos medios sustancias
como suero, sangre, lquido asctico, etc. Igualmente pueden ser necesarios ciertos carbohidratos y sales
minerales como las de calcio, magnesio, manganeso, sodio o potasio y sustancias promotoras del crecimiento,
generalmente de naturaleza vitamnica. Muy a menudo se aaden al medio de cultivo ciertos colorantes, bien
como indicadores de ciertas actividades metablicas o bien por sus capacidades de ejercer de inhibidores
selectivos de ciertos microorganismos
Partiendo de un medio lquido podemos modificar su consistencia aadiendo productos como albmina, gelatina
o agar, con lo que obtendramos medios en estado semislido o slido. Los medios solidificados con gelatina
tienen el gran inconveniente de que muchos microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas
inferiores al punto de fusin de este solidificante y de que otros tienen la capacidad de licuarla. Actualmente los
medios slidos son de uso universal, por su versatilidad y comodidad, pero hay tambin gran cantidad de medios
lquidos cuyo uso est ampliamente extendido en el laboratorio.
Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmsfera con tensin de oxgeno normal. Algunas pueden
obtener el oxgeno directamente de variados sustratos. Pero los microorganismos anaerobios estrictos slo se
desarrollarn adecuadamente en una atmsfera sin oxgeno ambiental. En un punto intermedio, los
microorganismos microaerfilos crecen mejor en condiciones atmosfricas parcialmente anaerobias (tensin de
oxgeno muy reducida), mientras los anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a
cualquiera de las citadas condiciones.
Un nivel mnimo de humedad, tanto en el medio como en la atmsfera, es imprescindible para un buen desarrollo
de las clulas vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones
mnimas en las estufas de cultivo a 35-37C proporcionando una fuente adecuada de agua que mantenga la
humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar as que se deseque el medio.
5- Luzambiental
La mayora de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en presencia de luz solar. Hay
excepciones evidentes como sera el caso de los microorganismos fotosintticos.
6- pH
La concentracin de iones hidrgeno es muy importante para el crecimiento de los microorganismos. La mayora
de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH neutro, aunque los hay que requieren medios ms o menos
cidos. No se debe olvidar que la presencia de cidos o bases en cantidades que no impiden el crecimiento
bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos metablicos normales.
7- Temperatura
Los microorganismos mesfilos crecen de forma ptima a temperaturas entre 15 y 43C. Otros como los
psicrfilos crecen a 0C y los temfilos a 80C o incluso a temperaturas superiores (hipertemfilos). En lneas
generales, los patgenos humanos crecen en rangos de temperatura mucho ms cortos, alrededor de 37C, y los
saproftos tienen rangos ms amplios
Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estriles para evitar la aparicin de formas de vida que
puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano normal del o de los especimenes
inoculados en dichos medios. El sistema clsico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave (que utiliza
vapor de agua a presin como agente esterilizante)
La evolucin de los medios de cultivo
Podemos decir que la microbiologa empieza su verdadero desarrollo como ciencia en el momento en que se
descubre el microscopio y comienza la observacin de los primeros microorganismos, pero es indudable que la
puesta a punto de los medios de cultivo y la utilizacin del agar como solidificante, marcan dos importantes
puntos de inflexin en su evolucin.
La primera noticia de la utilizacin de medios de cultivo nos llega del miclogo Brefeld, que consigui aislar y
cultivar esporas de hongos en medios slidos realizados a base de gelatina. Sin embargo este sistema no era
adecuado para las bacterias (por su menor tamao) y no fue hasta el ao 1878 cuando Lister populariz un
mtodo enfocado al cultivo puro basado en diluciones seriadas en un medio lquido.
Koch realiz sus investigaciones utilizando en un primer momento rodajas de patata como soporte nutritivo
slido, pero no tard en recurrir al caldo de carnelquido, diseado por Loeffler, al que, en 1881, aadi gelatina,
logrando un medio slido transparente ideal para la observacin de la morfologa macroscpica de las colonias
microbianas.
En el ao 1882 tiene lugar uno de los grandes avances de la microbiologa en relacin con los medios de cultivo:
el mdico alemn Walter Hesse introduce el agar-agar (polisacrido extrado de algas rojas) como solidificante.
En 1887 un ayudante de Koch llamado Petri, comienza a utilizar placas de cristal planas, que se llaman desde
entonces placas de Petri, para sustituir a las clsicas bandejas de vidrio cubiertas con campanas que se usaban
hasta entonces.
Beijerinck y Winogradsky, que desde de 1888 realizaron sus investigaciones sobre las bacterias quimioauttrofas
(utilizacin de nitrgeno y azufre sobre todo) tuvieron gran importancia en el desarrollo de los medios selectivos y
de enriquecimiento. Disearon este tipo de medios de tal forma que su especial composicin qumica favoreca el
crecimiento de ciertos tipos de microorganismos que, en funcin de sus procesos metablicos, eran los nicos
capaces de utilizar para su desarrollo ciertos nutrientes del medio.
En 1892 Wrtz impuls el uso de los medios diferenciales, incorporando indicadores de pH a la composicin de
ciertos medios con lo cual se poda observar la produccin de cidos en la fermentacin en ciertos
microorganismos.
Curva de crecimiento bacteriano
El crecimiento de las bacterias sobre un medio de cultivo liquido es claramente exponencial, y la determinacion
de este crecimiento cuantitativo se puede representar mediante una curva en la que se distinguen las siguient.es
fases 0 periodos.
*Esludiocuanlitativo Debe seguirse obligatoriamente sobre el crecimiento global de una poblacion bacteriana
homogenea, y el cultivo puro de una sola cepa permite obtener la curva de desarrollo bacteriano, relacionando la
tasa de crecimiento en funcion del tiempo.*
Fase de latencia.
Es el tiemponecesario para la adaptacionde las bacteriasal nuevo medio donde se siembran. Durante este
periodo losmicroorganismos en estado latente aumentansu actividad metabolica, se embeben en agua, se
incrementa la tasa de ARN. Principalmente ribosomico (esencial para la sintesis de nuevas proteinas
bacterianas), y se producen posiblemente enzimas inducibles para utilizar lasnuevas sustancias s que se les
ofrecen. En definitiva hay un aumento de volumen,perono de division.dado que no hay recopilacin de ADN
cuyos niveles permanecen constantes durante toda la fase.
Si las bacterias sembradas procediesen de un cultivo similar. Con los mismos sustratos y en fase
Logaritmicapracticamente no habriasolucion de continuidad y la fase de latencia se acortaria extraordinariamente.
Por el contrariosufriria una serie de retrasos indefinidos en el caso de existir oxigeno en un cultivo de
anaerobiosis.Asi como en la aireacion forzada que impidiera la acumulacion de CO2 o la adicion de sustancias
antibacterianas, como sulfamidas, antibiticos, colorantes, etc. Cuando se usa como inoculo celulas en estado
metabolico latente, son factores de importancia critica para iniciar el crecimiento: El pH, la temperatura. la
presencia de concentraciones adecuadas de oxigeno (potencial de oxidacionreduccion) y concentraciones
favorables de CO2, Deben existir tambien ciertas sustancias nutritivas. en especial aquellas que las celulas
producen lentamente o con dificultad por si mismas. Si el nuevo medio contiene nutrientes que no son asimilables
por la mayoria de las bacterias del inoculo. Pero posiblemente sean utilizables por una o dos celulas mutantes.
lascelulas no mutadas moriran y aparecera un crecimiento perceptible despues de un retraso inusitadamente
largo.
Una vez iniciado el desarrollo se meanifiesta pronto por la asecedente inflexin de la curva, Llamada fase de
crecimiento acelerado. Durante este periodo precoz cuando la division es lenta el tamao de las celulas es
grande; casi el maximo alcanzable por las respectivas especies .Este hecho es debido probablemente. a la
imbibicion de agua con la hinchazon consiguiente y al comienzo de la actividad metabolica. Durante la fase de
crecimiento acelerado el tiempo requerido para que cada celula se divida va disminuyendo.
Esta fase de desarrollo logaritmico esta mediatizada por una serie de factores limitantes intrinsecos, como
la velocidad de difusion osmtica y factores extrinsecos diversos, como la concentracion del sustrato presencia
de oxigeno. etc. La temperatura es asimismo un factor importante, ya que para las bacterias patogenas el
optimode crecimiento se consigue a los 37C. Ypara las levaduras y otros hongos, a 25C.Durante esta fase se
alcanza el valor mas alto en el numero de generaciones por hora. Ademas, el recuento de celuIas viables es
prcticamente idntico al de celulas totales. Al tratarse de una poblacion joven, en que el numero de bacterias
muertas es minimo
Por otro lado la actividad metabolica es el mximo, el tamao medio bacteriano se reduce, las estructuras (pared,
membrana. etc.) presentan. ademas, un espesor minimo, la sensibilidad a los agentes fsicos qumicos y
antimicrobianos y fagos es optima en esta fase, y las caractersticas bioqumicas y biofsicas son mas evidentes.
Debido a estos atributos fisiologicos adquiridos por las bacterias en esta fase, si se realiza un subcultivo en caldo
a temperatura adecuada el crecimiento continua a ritmo exponencial sin apenas fase de latencia. Si el
crecimiento exponencial siguiese ininterrumpidamente en poco tiempo se llegaria a constituir una masa solida de
bacterias, lo que no sucede al aparecer numerosos factores que interfieren en dicha multiplicacion. Al cabo de
pocas horas (odias) del inicio de la fase logaritmica, los microorganismos encuentran dificultades para continuar
la multiplicacion. Los nutrientes se agotan , las materias residuales toxicas se acumulan, el pH se modifica, los
aceptores de hidrogeno desaparecen, latranferencia de energia disminuyen y las celulas se obstaculizan
mutuamente. La tasa de division celular comienza a declinar y hay microorganismosque mueren en numero
creciente de tal modo que el progreso numerico de las celulas vivas se retarda considerablemente. Este proceso
se designa como fase de aceleracion negativa del crecimiento
Fase estacionaria
Hay un crecimiento desequilibrado debido a que los componentes bacterianos (ADN, ARN, protenas, etc.) se
sintetizan a tasas diferentes. Se produce una estabilizacin del modo que el numero de celulas que se
reproducen equivalen a las que mueren. Puede ser debido a la disminucin de factores esenciales para la
respiracion o a falta de elementos nutritivos del sustrato. El acumulo de productos finales del metabolismo,
acidosorganicoso alcoholes obtenidos a partir de la degradacion de los carbohidratos, y enzimas autocataliticas
del tipo de las proteasas y de las nucleasas son factores dignos de tenerse en cuenta al actuar como inhibidores.
A veces la causa limitante es la concentracion de glucosa; por ello, su adicion a un mediotamponado para
neutralizar las pequeas cantidades de acido producido puede estimular un nuevo cicIo de desarrollo.
http://asignatura.us.es/mbclinica/docs/recursos/34/medios-de-cultivo.pdf