UNIVERSIDADE DE SO PAULO

INSTITUTO DE QUMICA
DEPARTAMENTO DE BIOQUMICA

I Indivduo
M
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G
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Sondas

QBQ-217
BIOQUMICA E BIOLOGIA MOLECULAR DO GENE
2003

DOCENTES RESPONSVEIS:
Profa. Suely Lopes Gomes (Coordenadora)
Profa. Aline Maria da Silva
 QBQ-217/Bioqumica e Biologia Molecular do Gene 2003

QBQ-217
Bioqumica e Biologia Molecular do Gene
Cincias Farmacuticas, 2003 - Diurno

DOCENTES RESPONSVEIS:
Profa. Suely Lopes Gomes (Coordenadora, sala 1211 - Bloco 12 inferior)
Profa. Aline Maria da Silva (sala 1224 - Bloco 12 inferior)

MONITORES:
Karina F. Ribichich
Daniela Beton

HORRIO E SALAS:
Aulas Expositivas: 4as. e 5as. feiras das 14 s 16hs - Sala 10 - Bloco 6 inferior
Exerccios (Discusso): 4as. e 5as. feiras das 16 s 18 hs - Salas 9 e 10 - Bloco 6 inferior
Aulas Prticas: Bloco 7 superior

ORGANIZAO DO CURSO:
O Curso envolve aulas expositivas, perodos para resoluo e discusso de exerccios e aulas
prticas. Utilizando as informaes das aulas expositivas e a bibliografia recomendada, os alunos
devero resolver os exerccios. Os exerccios sero discutidos nos perodos de discusso em sala de
aula com acompanhamento das professoras e monitores.
Nas aulas prticas sero realizadas experincias que envolvem algumas tcnicas utilizadas na
Biologia Molecular. Os alunos sero divididos em grupos e cada aluno dever apresentar um
RELATRIO INDIVIDUAL contendo os resultados obtidos e a resoluo das questes
correspondentes. S sero aceitos relatrios de alunos que realizaram as aulas prticas. POR RAZES
DE SEGURANA, O USO DO AVENTAL NAS AULAS PRTICAS OBRIGATRIO.

AVALIAO:
A avaliao ser feita atravs da mdia ponderada das notas obtidas nas trs provas (P1, P2 e
P3), nos relatrios (R) e na participao nos perodos de discusso de exerccios (E), de acordo com
a frmula abaixo:

Nota final= [(P1 x 3) + (P2 x 3) + (P3 x 3) + (R + E)]

10

A matria das provas ser CUMULATIVA. No final do curso, ser oferecida uma prova substitutiva
(com toda a matria) para alunos que faltarem a uma das trs provas (apresentar justificativa) ou que
no atingiram mdia 5,0. Os alunos que no atingirem mdia 5,0, porm atingirem mdia 3,0 e
75% de frequncia podero realizar a prova de recuperao no segundo semestre de 2003.

A FREQUNCIA OBRIGATRIA MINMA S AULAS DE 75%.

BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA:
- Biologia Molecular Bsica (2000) A. Zaha (Coordenador) Ed. Mercado Aberto
- Biochemistry (1995) L.Stryer. 3rd & 4th edition. W.H.Freeman and Co. New York.
- Recombinant DNA (1992) J.Watson, M.Gilman, J.Witkowski & M.Zoller. Ed. Scientifc American Books.
- Guia de Rotas na Tecnologia do Gene (1999), M. R. Walker & R. Rapley, Atheneu Editora So Paulo.

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 QBQ-217/Bioqumica e Biologia Molecular do Gene 2003

CRONOGRAMA QBQ-217
19/02. 4a. feira - Estrutura e Funo dos cidos Nucleicos.
20/02. 5a. feira - Fluxo da Informao Gentica. Exerccio I.
26/02. 4a. feira - Estrutura do DNA e Replicao. Exerccio I.
27/02. 5a. feira Reao em cadeia da polimerase (PCR). Exerccio II.
05/03. 4a. feira No haver aula (Cinzas).
06/03. 5a. feira Mutao e Reparo. Exerccio III.
12/03. 4a. feira Experincia 1: Extrao de DNA de E. coli.
13/03. 5a. feira - Plasmdeos e transposons. Exerccio IV.
19/03. 4a. feira Experincia 2: Transformao de bactrias com plasmdeos.
20/03. 5a. feira Explorando os genes: clonagem de DNA. Exerccio IV.
26/03. 4a. feira - Sntese e Processamento de RNA. Exerccio V.
27/03. 5a. feira - Cdigo Gentico. Exerccio VI.
02/04. 4a. feira - PROVA I.
03/04. 5a. feira - Sntese proteica. Exerccio VII.
09/04. 4a. feira - Controle da Expresso Gnica em Procariotos I. Exerccio VII.
10/04. 5a. feira Controle da Expresso Gnica em Procariotos II. Exerccio VIII.
16/04. 4a. feira SEMANA SANTA (No haver aula).
17/04. 5a. feira - SEMANA SANTA (No haver aula).
23/04. 4a. feira - Experincia 3: Induo da -galactosidase por IPTG.
24/04. 5a. feira - Cromossomos de Eucariotos. Exerccio VIII.
30/04. 4a. feira - Controle da Expresso Gnica em Eucariotos. Exerccio IX.
1/05. 5a. feira DIA DO TRABALHO (No haver aula).
07/05. 4a. feira - Mecanismos de Transduo de sinal. Exerccio IX.
08/05. 5a. feira - Oncogenes e cncer. Exerccio X.
14/05. 4a. feira - Exerccio X/Planto de Dvidas.
15/05. 5a. feira - PROVA II
21/05. 4a. feira - Reunio Anual da SBBq (No haver aula).
22/05. 5a. feira - Anlise de Genomas I e II.
28/05. 4a. feira Experincia 4: Preparao de DNA plasmidial.
29/05. 5a. feira - Anlise de Genomas III. Exerccio XI
04/06. 4a. feira - Experincia 5: Digesto de DNA e eletroforese em gel de
agarose.
a .
05/06. 5 feira Protenas Recombinantes/Transgnicos. Exerccio XII.
11/06. 4a. feira - Experincia 6: Expresso de protena recombinante em E. coli.
12/06. 5a. feira Diagnstico clnico atravs do DNA/Terapia Gnica.
18/06. 4a. feira Exerccio XIII.
19/06. 5a. feira CORPUS CHRISTI (No haver aula).
25/06. 4a. feira PROVA III
26/06. 5a. feira Perodo de estudo.
02/07. 4a. feira PROVA SUBSTITUTIVA

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 QBQ-217/Bioqumica e Biologia Molecular do Gene 2003

EXERCCIOS
I. Estrutura e Funo dos cidos Nucleicos

1. Quais as diferenas de composio e estrutura entre RNA e DNA. Como se distingue entre a
uracila e a timina, e entre a ribose e a desoxirribose.

2. Escreva os nomes das bases, ribonucleosdeos, desoxirribonucleosdeos, ribonucleotdeos e

desoxirribonucleotdeos do DNA e RNA.

3. Escreva a sequncia de bases da fita complementar do DNA dupla fita que apresenta uma
fita com a sequncia:
(5') ATGCCGTATGCATTGCATTC (3')
Exprima, em porcentagem, a composio de bases do DNA de fita dupla.

4. Como so chamadas as ligaes covalentes que unem dois nucleotdeos consecutivos nas
molculas de cidos nucleicos? Esquematize estas ligaes.

5. Uma molcula de cido nucleico tem a seguinte composio de bases:

C = 24,1% G = 18,5% T = 24,6% A = 32,8%
O que voc pode afirmar sobre esta molcula?

6. Explique por que cidos nucleicos so desnaturados quando submetidos a alta temperatura
ou pHs extremos ? Uma molcula de DNA desnaturada por aquecimento pode ser renaturada?
Como?

7. O valor de Tm para o DNA pode ser calculado usando-se a frmula :

Tm = 69,3 + 0,41(%GC), onde GC a porcentagem de Guanina + Citosina
a) DNA de E. coli contm 50% GC. Calcular o Tm para o DNA desta bactria.
b) As curvas de fuso da maioria dos DNAs que ocorrem naturalmente revelam que o Tm
normalmente maior do que 65oC. Por que isto importante para a maioria dos organismos?
c) Como varia o Tm com a fora inica da soluo?
d) O que acontece com Tm quando se adiciona etanol soluo de DNA?

8. Descreva os principais experimentos que indicaram que o DNA o material gentico.

9. Descreva o experimento de Meselson-Stahl. Qual seria o resultado deste experimento se a

replicao do DNA fosse conservativa?

10. Quais os diferentes tipos de RNA que podem ser encontrados nas clulas? Quais as suas
funes principais?

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 QBQ-217/Bioqumica e Biologia Molecular do Gene 2003

II. Fluxo da Informao Gentica

1. Aps a infeco de E. coli com o bacteriofago T2, quais dos seguintes eventos ocorrem e
em que ordem ?

(a) novas protenas so sintetizadas

(b) novos RNAS so sintetizados
(c) novos ribossomos so sintetizados
(d) novos RNAS se associam a novos ribossomos
(e) novos RNAS se associam a ribossomos pr-existentes

2. RNA facilmente hidrolizado por lcali, enquanto DNA no o . Por que?

3. Uma fita de um fragmento de DNA isolado de E. coli tem a seguinte sequncia

5'...AGGTTACCTAGTTGC...3'
Suponha que um mRNA seja transcrito a partir deste DNA usando a fita complementar como
molde. Qual ser a seqncia deste mRNA? O que voc pode dizer sobre a capacidade de
formao de um hbrido RNA-DNA?

4. Qual a sequncia do polipeptdeo que seria codificado pelo mRNA sintetizado na

questo 3.
Assuma que o quadro de leitura comea com o primeiro nucleotdeo.

5. Quais os diferentes tipos de RNA que podem ser encontrados nas clulas e como eles se
diferenciam quanto estrutura, tamanho, abundncia e funo?

6.Baseando-se na lista de cdons e amino cidos abaixo, quais das seguintes afirmaes so
corretas?

AGU = serina AGC = serina

AAU = asparagina AAC = asparagina
AUG = metionina AUA = isoleucina

(a) o cdigo gentico degenerado

(b) a alterao de um nico nucleotdeo no DNA que dirige a sntese destes cdons poderia
levar substituio de uma serina por uma asparagina no polipeptdeo.
(c) a alterao de um nico nucleotdeo no DNA que dirige a sntese destes cdons
necessariamente levaria substituio de um aminocido no polipeptdeo codificado.
(d) um tRNA com o anticdon ACU se ligaria a um ribossomo na presena de um destes
cdons.

7.Uma globina de 146 aminocidos sofreu uma mutao no cdon correspondente ao sexto
aminocido da cadeia. A anlise do DNA indicou uma mudana de (5')TTC(3') para (5')TAC(3')
na fita molde. Pergunta-se :
(a) A mutao provocou a troca de um aminocido por outro? Em caso afirmativo, qual este
aminocido?
(b) Quais as implicaes para a estrutura da protena?
(c) Qual seria o resultado se a mesma troca ocorresse na base do lado (5') do DNA?

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 QBQ-217/Bioqumica e Biologia Molecular do Gene 2003

III. Estrutura do DNA e Replicao/ PCR

1. Combine as caractersticas da coluna da direita com o tipo de hlice do DNA da coluna da

esquerda

(a) A-DNA (1) As pirimidinas esto na configurao anti

(b) B DNA (2) Os fosfatos na cadeia esto em ziguezague
(c) Z-DNA (3) A sua formao favorecida por superenovelamento negativo
(4) Apresenta um sulco maior relativamente largo e profundo
(5) Apresenta uma estrutura helicoidal no sentido dextrgiro
(6) Tem 10,4 pares de bases por volta
(7) Tem a estrutura similar quela do RNA de fita dupla
(8) As fitas na hlice tm polaridades opostas

2. Combine as propriedades ou funes na coluna direita com a DNA polimerase na coluna

da esquerda:
(a) DNA polimerase I (1) envolvida na replicao

(b) DNA polimerase II (2) requer um iniciador e um molde

(c) DNA polimerase III (3) envolvida no reparo de DNA

(4) sintetiza a maior parte do DNA durante a
replicao
(5) remove o iniciador e preenche as
lacunas durante a replicao

3. Defina os seguintes termos: primer, ori, RNA primase, fragmento de Okasaki, sntese
descontnua de DNA, DNA ligase, girase, fita lder.

4. O fragmento de DNA no esquema abaixo de fita dupla em ambas as extremidades porm

de fita simples no meio. A polaridade da fita superior est indicada.

5'__________________________3'
__________P HO_________

a) O fosfato (P) indicado na fita inferior est na extremidade 5' ou 3' do fragmento ao qual ele
pertence ? (Indique no esquema).

b) Como voc esperaria que a lacuna fosse preenchida pelos processos de reparo do DNA "in
vivo" ?

c) Quantos fragmentos voc esperaria encontrar na fita inferior se o experimento fosse

realizado "in vitro", na presena de todos os desoxirribonucleotdeos-trifosfato e DNA
polimerase ?

5. Explique porque certas variedades mutantes da DNA polimerase I podem apresentar

atividade de DNA polimerase praticamente ausente, mas podem ter atividade de exonuclease
5' 3' praticamente normal.

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 QBQ-217/Bioqumica e Biologia Molecular do Gene 2003

6. Qual a atividade da DNA polimerase III que responsvel pela editorao durante a
replicao ?

7. Que propriedades do DNA e da DNA polimerase sugerem que a duas fitas no podem ser
replicadas pelo crescimento no mesmo sentido (como mostra a figura abaixo)? Como a clula
supera o problema ? Esquematize a formao da ligao fosfodiester durante a replicao a
partir do nucleotdeo trifosfato livre mostrando o grupo fosfato que incorporado.

8. A tcnica de PCR (polymerase chain reaction) utilizada para obter grandes quantidades de
DNA a partir de amostras contendo quantidades nfimas de DNA.
a) Descreva os passos envolvidos nesta tcnica.
b) Que tipo de DNA polimerase normalmente utilizada?
c)Exemplifique aplicaes desta tcnica.

9. Voc deseja amplificar atravs da tcnica de PCR, o DNA contido entre as sequncias
mostradas na figura abaixo. Escreva a sequncia do par de primers que voc ter que utilizar
na reao. Esquematize as reaes de polimerizao at o terceiro ciclo da amplificao.

5 GACCTGTGGAAGC CATACGGGATTG 3

IV. Mutao e Reparo do DNA. Plasmdeos e Transposons

1. Que propriedade da DNA polimerase I responsvel pela observao de que bactrias

mutantes polA1 so mais sensveis luz ultravioleta ? Explique.

2. Descreva brevemente as 3 etapas de reparo do DNA lesado por luz UV e as enzimas nelas
envolvidas.

3. Como a maquinaria de reparo de E. coli identifica a fita de DNA que tem um nucleotdeo no
complementar incorporado durante a replicao?

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 QBQ-217/Bioqumica e Biologia Molecular do Gene 2003

4. Visto que U pareia com A to bem quanto T pareia com A, por que somente T encontrado
no DNA ?

5. Bromouracila um mutagnico que produz troca de bases, enquanto acridina causa adies
ou delees de uma base no DNA. Mutaes causadas por acridina frequentemente podem ser
compensadas por mutaes secundrias, distantes vrios nucleotdeos da primeira mutao,,
enquanto aquelas causadas por bromouracila, geralmente requerem mudanas dentro do
mesmo codon. Explique.

6. Explique como algumas cepas da bactria Salmonella so usadas para detectar substncias
carcinognicas. Por que extrato de fgado de mamfero est envolvido no teste ?

7. Clulas de mamfero de dois gentipos diferentes podem ser fundidas na presena do virus
Sendai, para formar clulas multinucleadas (heterocarions) contendo ncleos de ambos os
gentipos. Quando fibroblastos de dois pacientes sofrendo de Xeroderma pigmentosum foram
fundidos, os heterocarions resultantes no mostraram deficincia em reparo de DNA. Que
concluses podem ser tiradas desta observao? Explique.

8. Defina o termo "transposon". Explique como os transposons podem: conduzir ativao ou

inativao gnica.

9. Descreva as condies necessrias para que duas bactrias conjuguem com sucesso. O
que uma clula Hfr ? Qual a diferena entre fator F e F'.
S
10. Suponha que uma cepa Hfr de E. coli sensvel estreptomicina (Str ), capaz de sintetizar
os aminocidos Leu e His, misturada em meio de cultura com uma cepa F- que resistente
estreptomicina e incapaz de sintetizar Leu e His. Aps certo tempo a conjugao
interrompida, colocando-se a mistura num liquidificador e transferindo-se amostras da cultura
para placas seletivas para testar se houve ou no conjugao.
(a) Ocorre algum crescimento bacteriano quando as bactrias so transferidas para um
meio contendo estreptomicina e na ausncia de Leu e His? Explique este resultado.
(b) Suponha que voc repetiu o experimento com menor tempo de incubao antes de
colocar a mistura no liquidificador. Explique porque agora as bactrias crescendo na presena
de estreptomicina necessitam do aminocido His, mas no do aminocido Leu.

11. Como voc explica a necessidade do antibiograma antes de prescrever um antibitico?

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V. Explorando os Genes

1. Quando uma molcula de DNA estranha, isto , de um organismo diferente, entra em certas
bactrias o DNA frequentemente hidrolisado. Explique as bases enzimticas deste fenmeno
de restrio. Explique como o DNA estranho pode as vezes escapar desta hidrlise. Por que o
DNA da prpria bactria no sofre hidrlise?

2. Quais das seqncias abaixo so possveis stios de reconhecimento de uma enzima de

restrio ? Por que ?
(a) 5'-AGTC-3' (b) 5'-ATCG-3'
3'-TCAG-5' 3'-TAGC-5'

(c) 5'-ACCT-3' (d) 5'-ACGT-3'

3'-TGGA-5' 3'-TGCA-5'

3. As enzimas de restrio Hind III e Hae III, que reconhecem e clivam respectivamente as
seqncias de DNA:

(5') AAGCTT (3') (5') GGCC (3')
(3') TTCGAA (5') (3') CCGG (5')

foram utilizadas separadamente para clivar a molcula do DNA dupla fita circular abaixo
.... AAGCTTTCAGCAGGCCTA ....
.... TTCGAAAGTCGTCCGGAT ....
Aps a clivagem a soluo foi aquecida para inativar a enzima de restrio e a soluo foi
esfriada lentamente aps a adio ou no de NaOH 0,1M, para tornar a soluo alcalina. Em
que condies o DNA assim tratado apresentou-se circular quando observado ao microscpio
eletrnico ?

4. Voc deseja clonar um gene de levedura no fago lambda. Por que necessrio clivar tanto o
DNA de levedura quanto o DNA de lambda com a mesma enzima? Se as enzimas forem
diferentes, que caractersticas devem ter as extremidades dos fragmentos produzidos pela
digesto enzimtica ?

5. Como voc pode verificar que um fragmento de DNA foi inserido num plasmdeo durante um
experimento do clonagem ? Que enzimas voc teve que utilizar para a fazer a clonagem ?

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 QBQ-217/Bioqumica e Biologia Molecular do Gene 2003

VI. Sntese e Processamento de RNA

1. D a composio de subunidades da holoenzima e do cerne da RNA polimerase de E. coli,

atribuindo funes s subunidades.

2. Quando uma cultura de E. coli em crescimento submetida a um rpido aumento de

temperatura, um novo e caracterstico conjunto de genes altamente expresso. Explique como
ocorre esta alterao na expresso dos genes.

3. As DNA polimerases necessitam de um iniciador, ao qual se liga um novo nucleotdeo para o

crescimento da cadeia polinucleotdica. necessrio um iniciador para a ao da RNA
polimerase?

4. Que subunidades da RNA polimerase bacteriana so necessrias para a iniciao da

transcrio a partir de um promotor? E para a terminao da transcrio? Explique como uma
mutao poderia dar origem a uma E. coli resistente ao antibitico rifamicina.

5. Uma pequena cadeia de RNA sintetizado in vitro tem a seguinte seqncia:

5'- AUGUACCGAAGUGGUUU - 3'

Coloque os grupos fosfato e um asterisco naqueles que sero radiativos quando a transcrio
32
for feita na presena de [ P]-ATP
32
b) Faa o mesmo para [ P]-UTP

6. Defina "promotor", enumere as suas propriedades e diga como podem ser localizados
atravs da tcnica de "footprinting".

7. A sequncia de um segmento de uma molcula. de DNA duplex :

(a) 5'-ATCGCTTGTACGGA-3'
(b) 3'-TAGCGAACATGCCT-5'
Quando este segmento serve de molde para a RNA polimerase de E. coli ele d origem a um
segmento de RNA com a seguinte sequncia:
(c) 5'-UCCGUACAAGCGAU-3'.
Indique: a) a fita codificadora;
b) a fita senso;
c) a fita molde;
d) a fita anti-senso.

8. At que ponto o mRNA, rRNA e tRNA so modificados nos procariotos ? Indique as

modificaes que podem ocorrer.

10. Combine as descries na coluna da direita com a RNA pol DNA-dependente eucaritica
apropriada:
a) RNA pol I (1) localizada no nuclolo
(2) localizada no nucleoplasma
(3) sintetiza hnRNA
b) RNA pol II (4) sintetiza tRNA
(5) sintetiza rRNA

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 QBQ-217/Bioqumica e Biologia Molecular do Gene 2003

(6) sintetiza precursores do rRNA

c) RNA pol III (7) inibida por -amanitina
(8) sintetiza RNA na direo 5'-3'
(9) composta de vrias subunidades

11. Voc usaria num paciente, como agente teraputico anti-bacteriano, qual destes
antibiticos: a) rifamicina ou b) actinomicina D ? Justifique a sua escolha.

12. Quais as principais caractersticas das sequncias de promotores de genes eucariticos

transcritos em mRNAs? Qual a funo dos fatores de transcrio e enhancers?

13. Em que consiste o terminal 5' cap do mRNA e qual o seu papel ? Qual a caracterstica do
terminal 3' encontrado na maioria dos mRNAs de eucariotos e como eles so formados ?

14. Genes de eucariotos so geralmente constitudos de introns e exons. Estas seqncias so

tanto transcritas como traduzidas? A remoo dos ntrons (splicing) tem que ser um processo
extremamente preciso. Por que? D um exemplo de "splicing" aberrante que leva a um tipo de
talassemia em humanos.

15. Suponha que o DNA humano clivado em fragmentos do tamanho aproximado de um

mRNA humano maduro e que ento so preparados hbridos RNA-DNA. O mesmo
procedimento repetido com E. coli. Quando os hbridos RNA-DNA de cada espcie so
examinados ao microscpio eletrnico, qual deles mostra o maior grau de hibridizao?
Explique e faa um esquema.

16. O mRNA monocistrnico de eucariotos geralmente representa o transcrito primrio ? E o

mRNA dos procariotos ? Explique. Faa uma comparao, indicando as principais diferenas
encontradas em eucariotos entre um gene, seu transcrito primrio e o mRNA maduro que deixa
o ncleo para a traduo no citoplasma.

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 QBQ-217/Bioqumica e Biologia Molecular do Gene 2003

VII. Cdigo Gentico e Sntese de Protenas

1. Dada a semelhana entre valina e isoleucina e a maior concentrao de Val em relao a Ile
(5:1) em E. coli, os clculos indicam que a isoleucil-tRNA sintetase deveria incorporar s
protenas, erroneamente, valina em lugar de isoleucina a cada 40 reaes. Entretanto, o erro
acontece apenas 1 vez em cada 3000 reaes. Explique porque.

2. Como algumas aminoacil-tRNA sintetases podem atingir elevado grau de preciso nas
reaes, mesmo sem ter um mecanismo hidroltico de reviso ?

3. Explique porque as molculas de tRNA devem ter, concomitantemente, caractersticas

estruturais particulares e comuns.

4. Complete: Cada aminocido levado aos ribossomos para a sntese de polipeptdeos pelo
pareamento de bases entre o _________________ de uma molcula de aminoacil-tRNA e o
_____________de um mRNA.

5. Escreva os produtos finais das seguintes reaes:

a) valina + ATP + tRNAVal + valil-tRNA sintetase .
b) valina + ATP + tRNAIle + isoleucil-tRNA sintetase .

6. Em um experimento verificou-se que Cys-tRNACys pode ser convertido a Ala-tRNACys e

usado num sistema in vitro de sntese de protenas.
(a) Se o Ala-tRNACys for marcado com 14C no aminocido, a alanina marcada seria
incorporada na protena sintetizada no lugar de outros resduos Ala ? Explique.
(b) O que o experimento indica sobre a importncia da preciso da reao da aminoacil-tRNA
sintetase em relao ao processo global da sntese protica ?

7. Assumindo que cada nucleosdeo na coluna da esquerda est na primeira posio de um

anticdon, com qual(is) nucleotdeo(s) na coluna da direita ele vai parear durante uma
interao cdon-anticdon, se cada um dos nucleotdeos da direita estiver na terceira posio
(3') de um cdon ?
anticdon cdon
(a) Adenosina-P (1) Adenosina-P
(b) Citidina-P (2) Citidina-P
(c) Guanosina-P (3) Guanosina-P
(d) Inosina-P (4) Uridina-P

8. De acordo com o princpio de oscilao no pareamento de bases ("wobble"), qual o nmero

mnimo de tRNAs necessrio para decodificar os seis cdons de leucina - UUA, UUG, CUU,
CUC, CUA e CUG ? Explique.

9. Uma mutao supressora compensa o efeito de outra mutao num gene distinto do
primeiro. Explique como o tRNA poderia estar envolvido neste processo.

10. Em procariotos, a maioria da cadeias polipeptdicas so iniciadas com o aminocido

______, cujo cdon ______.

11. Num sistema de sntese de protenas in vitro, que permita o incio e trmino da sntese em
qualquer sequncia de RNA, que peptdeo seria produzido pelo poli-ribonucleotdeo
5'-UUUGUUUUUGUU-3' ? Indique qual o aminocido N-terminal e o C-terminal do polipeptdeo
obtido.
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 QBQ-217/Bioqumica e Biologia Molecular do Gene 2003

12. Qual o papel da vitamina cido flico no processo de traduo em procariotos?

13. O cdon AUG funciona tanto para iniciar uma cadeia polipeptdica quanto para dirigir a
incorporao de uma metionina em posies internas de uma protena. Quais os mecanismos
de seleo do cdon AUG para a iniciao da traduo em procariotos?

14. Para cada uma das etapas da traduo, descritas abaixo, d o nucleotdeo trifosfato
envolvido como cofator e o nmero de ligaes fosfato de alta energia consumidas.
a) Ativao do amino cido
b) Formao do complexo de iniciao 70S (procariotos) ou 80S (eucariotos)
c) Entrada do aminoacil-tRNA no ribossomo
d) Formao da ligao peptdica
e) Translocao

15. Os trs cdons de terminao so ______, _______ e ______.

16. Muitos antibiticos exercem sua ao por inibio da sntese proteica. Como, ento, alguns
destes antibiticos podem ser usados em humanos para combater infeces microbianas sem
causar efeitos txicos devido inibio da sntese proteica eucaritica?

17. Considere a seguinte sequncia de um fragmento de DNA isolado de bactria:

5' CTGATAAGGGATTTAAATTATGTGTCAATCACGAATGCTAATCGCTTAACACTTC 3'

a) Assumindo que esta sequncia corresponde a sequncia da fita codificadora, qual seria a
sequncia de aminocidos do polipeptdeo produzido quando um mRNA transcrito deste gene
for traduzido? Que caractersticas na sequncia do mRNA determinam qual o cdon
iniciador? Considere a primeira base como o incio da transcrio.

18. Quais so as caractersticas das seqncias sinais que dirigem certos polipeptdeos para o
retculo endoplasmtico nas clulas eucariticas e para secreo em bactrias?

19. Qual o compartimento celular em que so sintetizadas a maioria das glicoprotenas?

20. D exemplos de modificaes ps-traducionais que podem ocorrer nas protenas.

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 QBQ-217/Bioqumica e Biologia Molecular do Gene 2003

VIII. Controle da Expresso Gnica em Procariotos

1. Defina expresso gnica constitutiva. Compare expresso gnica induzida com represso
gnica. Use o esquema proposto por Jacob e Monod para o operon da lactose e defina os
termos operon, gene estrutural, gene regulador, operador, promotor, indutor, repressor e co-
repressor.

2. Numa cultura de E.coli em um meio contendo tanto lactose quanto glicose, qual dos
acares metabolizado preferencialmente? Qual o mecanismo que permite esta
seletividade ? O que acontece quando a glicose se esgota durante o crescimento da bactria ?

3. Para o cultivo de E.coli utilizaram-se meios contendo alm dos sais necessrios, os
componentes:
a) lactose d) glicose + cAMP
b) lactose + glicose e) lactose + glicose + cAMP
c) glicose

Analise a produo de - galactosidase em cada caso, justificando a resposta segundo o

modelo de Jacob e Monod.

4. Qual o efeito da deleo do gene regulador do operon lac? Haveria outro tipo de mutao
resultando no mesmo efeito ?

5. Um mutante incapaz de crescer tanto em galactose quanto em arabinose, alm de diversas

outras fontes de carbono, foi isolado de uma cultura de E. coli do tipo selvagem. Que tipo de
mutao pode ter produzido estes resultados ?

6. Algumas mutaes constitutivas conhecidas no operon da lactose ocorrem no operador(O)

ao invs do gene regulador (I).
(a) Voc esperaria que um mutante O- seria dominante ou recessivo em relao ao alelo
selvagem O+
(b) A mutao constitutiva no stio operador atua em cis ou trans ?
(c) Proponha um experimento envolvendo os genes I+,O-, O+ e Z+ que confirme a sua
resposta no tem (b). Assuma que possvel diferenciar a quantidade de enzima produzida no
diploide (++) daquela produzida no haploide (+).
(d)Mostre de forma anloga se a mutao constitutiva no gene regulador (I-) atua em trans ou
em cis.

7. Por que o triptofano chamado de co-repressor na regulao do operon das enzimas

biossintticas deste aminocido ? Qual o efeito provvel da deleo do gene regulador trp R ?

8. Demonstrou-se que o operon para a biossntese do aminocido fenilalanina de uma certa

bactria regulado por um mecanismo de atenuao. O que pode ser afirmado sobre a
sequncia de aminocidos do peptdeo lder para este operon ? Explique.

9. Uma clula de E. coli que possui um profago imune infeco ltica por outro fago . Por
que ?

10. Qual o efeito da deleo do gene CI de ? Qual o efeito da deleo do gene N de ?

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 QBQ-217/Bioqumica e Biologia Molecular do Gene 2003

IX. Cromossomos de Eucariotos

Controle da Expresso Gnica em Eucariotos
1. Quais os aspectos mais comuns na organizao dos genes dos genomas eucariticos?

2. Combine os organismos listados na coluna da esquerda com a quantidade correta de DNA

do seu genoma haplide na coluna da direita.
E. coli (bactria) (1) 1,7 x 108 pb
S. cerevisiae (levedura) (2) 4 x 106 pb
D. melanogaster (mosca de fruta) (3) 3,9 x 109 pb
H. sapiens (homem) (4) 1,4 x 107 pb

3. Quais das seguintes afirmaes sobre o DNA isolado de um cromossomo eucaritico so

corretas ?
- resistente quebra durante a extrao por seu grande tamanho.
- linear e no ramificado
- uma molcula nica
- Pode ter tamanho superior a 100 Mb

4. O ncleo de uma clula humana tem 6m de dimetro e a extenso total do DNA dos seus
46 cromossomos soma 1,8m. Como resolvida a discrepncia entre estas duas grandezas?

5. Esquematize a estrutura do nucleossomo. O que so histonas e qual o seu papel na

organizao da cromatina?

6. Dois estudantes de bioqumica: Norberto e Lucia, decidem fracionar uma amostra de

cromatina para isolar cada uma das histonas. Norberto adiciona sal amostra e aplica a
soluo resultante numa coluna de gel-filtrao. Lucia toma a amostra original e a adiciona a
uma coluna de cromatografia de troca inica. Comente sobre as perspectivas de sucesso para
cada um destes experimentos, explicando o seu raciocnio. Se necessrio, sugira um
procedimento alternativo.

7. Cromossomos artificiais de levedura (YACS) podem ser construdos a partir de trs espcies
de elementos de DNA. Quais so les ?

8. Compare a expresso gnica em procariotos e eucariotos quanto a:

a) grau de acoplamento da transcrio e da traduo.
b) nmero de produtos gnicos em um transcrito primrio.
c) nmero de protenas resultantes da traduo de um transcrito primrio.
d) proporo de seqncias codificadoras no DNA.
e) organizao de genes em operons.

9. Cromatina que ativa transcricionalmente (eucromatina) tem estrutura dispersa, enquanto

cromatina que inativa (heterocromatina) compacta. Quando ncleos de clulas de galinha
produzindo globina foram tratados brevemente com DNase pancretica, os genes de globina
de adultos foram seletivamente destrudos, mas os genes para globina embrionica e
ovalbumina permaneceram intactos. Quando os ncleos de clulas de oviduto foram tratadas
com DNase, os genes de ovalbumina foram destrudos. Explique estes resultados.

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 QBQ-217/Bioqumica e Biologia Molecular do Gene 2003

10. Conceituar: a) fatores de transcrio; b) "enhancers" (ativadores) indicando suas funes.

Exemplifique caractersticas estruturais exibidas por fatores de transcrio.

11. O fator de transcrio IIIA (TF IIIA) liga-se ao 5SRNA to bem quanto regio de controle
interna do gene que o codifica. Por que ? Como esta ligao ao produto gnico pode ser usada
para regular a expresso do gene 5S ?

12. A RNA polimerase II, responsvel pela sntese dos mRNAs em eucariotos, incapaz de se
ligar aos seus promotores no DNA, a menos que fatores de transcrio estejam ligados na
vizinhana destes promotores. O que voc espera que acontea durante o choque trmico em
clulas eucariticas, quando os genes para as protenas de choque trmico so fortemente
induzidos? Explique.

13. Casena a protena mais abundante do leite. produzida em clulas epiteliais do tecido
mamrio em resposta a hormnios, incluindo o hormnio polipeptdico prolactina. Tecido
mamrio em cultura incubado na ausncia de prolactina contm cerca de 300 molculas de
mRNA de casena por clula, enquanto clulas incubadas na presena de prolactina contm
cerca de 30.000 molculas de mRNA de casena. No entanto o ncleo de clulas de tecido
mamrio em cultura sintetiza somente cerca de 3 vezes mais mRNA de casena na presena
de prolactina. Proponha uma explicao para estes resultados?

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X. Transduo de Sinal/Oncogenes e Cncer

1. Exemplifique como uma cascata de sinalizao intracelular pode ser ativada, citando alguns
tipos de sinais extracelulares.

2. Qual o tipo de modificao covalente reversvel em protenas mais frequente nas cascatas
de sinalizao intracelular ? Quais so as enzimas que catalisam esta modificao ?

3. O cAMP (AMP cclico) um importante mensageiro secundrio para muitos hormnios.

Como pode ocorrer a ativao da enzima adenilato ciclase aps ativao de um receptor
hormonal ?

4. Como ocorre a transmisso do sinal mitognico em resposta ao estmulo pelo fator de

crescimento de epiderme (EGF) ?

5. Como a transcrio de certos genes pode ser influenciada em resposta a um sinal

extracelular ?

6. Qual foi a importncia da descoberta que um extrato celular de uma galinha com um
sarcoma causava um sarcoma quando era injetado em outra galinha ?

7. O que so protooncogenes e oncogenes? Que tipos de protenas estes genes podem

codificar ?

8. A protena c-src homloga protena viral oncognica conhecida com v-src e atua como
tirosina quinase citosslica, cuja atividade regulada por fosforilao. Qual a caracterstica de
v-src que a torna uma protena oncognica.

9. A predisposio ao cncer pode ser hereditria. Explique este fato lembrando-se que
existem protenas que agem como supressores do crescimento celular.

10. Retinoblastoma, um cncer de retina que aflige crianas, est asssociado a uma deleo
no cromossomo 13. Proponha uma possvel funo para o gene selvagem (Rb), que codifica
uma protena de 105 kD localizada no ncleo capaz de se ligar ao DNA.

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XI. Anlise de Genomas

1. Descreva a tcnica de Southern. O que a diferencia da tcnica de Northern?

2. Qual a tcnica para o estudo simultneo do nvel de expresso de milhares de genes em

uma determinada condio fisiolgica ?

3. Qual a diferena entre uma biblioteca genmica e uma biblioteca de cDNA. Explique como a
presena de ntrons em genes eucariticos complica a produo de produtos proticos que
eles codificam quando a expresso feita em bactria. Como se pode resolver este problema?

4. Descreva o sequenciamento de DNA pelo mtodo de interrupo controlada da replicao

(mtodo de Sanger) incluindo o mtodo de separao e anlise das molculas de DNA
produzidas na reao.

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 QBQ-217/Bioqumica e Biologia Molecular do Gene 2003

5. A figura abaixo mostra o autorradiograma de um gel de sequenciamento de DNA pelo

mtodo de Sanger. Escreva a sequncia deste fragmento de DNA lendo o gel de baixo para
cima. A sequncia obtida codifica para um domnio de uma protena. Encontre a fase de leitura
desta sequncia. O que aconteceria se durante a leitura do gel voc tivesse omitido uma base?
Como voc faria para ter segurana absoluta da sequncia deste fragmento de DNA ?

G AT C

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6. No exerccio anterior utilizou-se nucleotdeos radioativamente marcados na reao de

sequenciamento. Que derivados de nucleotdeos so utilizados no sequenciamento
automatizado ?

XII. Obteno de Protenas Recombinantes/Animais transgnicos

1. A partir de uma biblioteca de cDNA voc isolou um cDNA completo que codifica para uma
protena que um potente estimulador do sistema imunolgico. Voc agora deseja clonar este
cDNA em um vetor de expresso para produzir grande quantidade desta protena em E. coli. O
cDNA possui nas suas extremidades stios para enzima BamHI e voc planeja clon-lo no stio
de BamHI do vetor de expresso. Esta sua primeira vez com experimentos de clonagem e
voc decide seguir cuidadosamente as instrues do manual de clonagem, que recomenda
que o vetor digerido deve ser tratado com fosfatase alcalina para remover o fosfato da
extremidade 5.

a) Por que deve ser feito o tratamento com fosfatase alcalina?

b) Como voc analisaria se a clonagem foi bem sucedida?
c) A protena de seu interesse afeta o crescimento das bactrias. Como voc faria para obter
grande quantidade desta protena recombinante?

2. O antgeno que utilizado na vacina recombinante contra a Hepatite B uma glicoprotena.

Como voc faria para obter esta protena recombinante ?

3. Suspeita-se que o aminocido Lisina da posio 272 essencial para a ao cataltica de

uma certa enzima, que pode ser facilmente purificada com atividade a partir de extratos de
E.coli expressando a protena recombinante. Como voc investigaria se este aminocido de
fato essencial para atividade cataltica desta enzima? Que metodologias teria que utilizar?

4. O gene completo (contendo todos os exons e ntrons) do hormnio de crescimento de ratos

pode ser expresso em camundongos sob o controle de um promotor indutvel por Cd2+. Como
podem ser obtidos tais camundongos transgnicos? Quais as suas caractersticas? Como
voc explica o fato da expresso do gene do rato ser expresso perfeitamente em
camundongos?

5. Planeje a obteno de cabras transgnicas que possam produzir o hormnio de crescimento

humano em seu leite.

6. H poucos anos atrs, cientistas europeus realizaram a clonagem de uma ovelha (Dolly), a
partir de clulas de uma ovelha adulta. Compare este tipo de experincia com a obteno de
um animal transgnico.

XIII. Diagnstico Clnico atravs do DNA/Terapia Gnica

1. Dois recm-nascidos desenvolveram infeco com o vrus herpes simplex na maternidade.

Um deles se recuperou e o outro morreu. A autopsia mostrou infeco generalizada por
herpes. Epidemiologistas precisavam saber se os recm-nascidos haviam sido infectados pela
mesma cepa viral. Amostras de ambas as crianas foram usadas para cultivar o vrus. DNA
marcado radioativamente das culturas do vrus foi analisado com enzimas de restrio e os
resultados indicaram que as duas crianas foram infectadas pela mesma cepa. Como
endonucleases de restrio podem ser usadas para distinguir cepas do vrus herpes simplex?

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 QBQ-217/Bioqumica e Biologia Molecular do Gene 2003

2. A anemia falciforme est associada a existncia de uma mutao pontual de AT, no gene
da -globina que provoca a troca do aminocido Glu por Val na protena. Esta mutao elimina
um stio reconhecido pela enzima de restrio MstII. O desenho abaixo representa um
esquema dos genes selvagem e mutante. Planeje um teste utilizando a tcnica de "Southern
blot" para o diagnstico pr-natal desta doena. Faa o esquema do resultado esperado
considerando um feto normal e de um portador da doena cujos pais so heterozigticos.

Stio que est ausente

na -globina mutante

MstII MstII MstII

1,1 kpb

1,3 kpb

3. A distrofia muscular de Duchenne (DMD) uma das doenas genticas mais comuns. O
gene da DMD localiza-se no cromossomo X, possui mais de 2 x 106 pares de base e contem
pelo menos 70 exons. 60% dos casos so devidos ocorrncia de delees grandes
concentradas em duas regies do gene. 1/3 dos novos casos so devidos a novas mutaes
no gene. A tcnica de PCR- multiplex um mtodo rpido e eficiente no diagnstico da DMD e
pode detectar aproximadamente 80% de todas as delees j conhecidas. Nesta tcnica so
utilizados mltiplos pares de primers que podem amplificar, em uma reao, 9 segmentos (de
tamanhos diferentes) do gene nas regies onde as delees ocorrem mais frequentemente.
Um exemplo de anlise por PCR-multiplex apresentado abaixo. Descreva as delees, se
houverem, em cada um dos seis pacientes de DMD analisados. Que controle adicional voc
sugere para confirmar o diagnstico do paciente F? As setas apontam os nove stios
amplificados pela PCR. Normal equivale a um indivduo do sexo masculino no portador da
DMD e O um controle negativo onde no foi adicionado DNA mistura de reao.

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 QBQ-217/Bioqumica e Biologia Molecular do Gene 2003

4. O mtodo de identificao de indivduos mais frequentemente utilizado est baseado na

comparao do nmero de certas repeties variveis em srie que esto localizadas em
regies conhecidas do genoma humano. Explique como pode ser realizado um teste para
identificao de indivduos, levando em conta este fato.

5. Quais so as alternativas possveis para realizao de terapia gnica (tipos de vetores) ?

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 QBQ-217/Bioqumica e Biologia Molecular do Gene 2003

ROTEIRO PARA AS
AULAS PRTICAS

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 QBQ-217/Bioqumica e Biologia Molecular do Gene 2003

ROTEIRO PARA AS AULAS PRTICAS

RECOMENDAES:

1. Por razes de segurana no ser permitido ao aluno frequentar as aulas sem avental.
PROIBIDO COMER, BEBER E FUMAR NO LABORATRIO.

2. Leia com detalhe o protocolo e preste ateno as instrues fornecidas antes de iniciar a
experincia.

3. Procure utilizar reagentes, vidraria e equipamentos disponveis com cuidado, para evitar
desperdcio e quebra.

4. Mantenha sua rea de trabalho organizada. Ao terminar a experincia passe gua na

vidraria utilizada e coloque no local indicado.

5. O relatrio individual dever ser entregue no final de cada uma das aulas prticas. O
relatrio dever ser feito de acordo com modelo ao final de cada protocolo experimental. Aps
preenchidas, as respectivas folhas devem ser destacadas e entregues.

6. Qualquer dvida ou acidente pea auxlio aos monitores ou aos professores.

USO DO AVENTAL NAS AULAS PRTICAS

OBRIGATRIO.

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 QBQ-217/Bioqumica e Biologia Molecular do Gene 2003

EXPERINCIA No.1: EXTRAO DE DNA (E RNA) DE Escherichia coli.

Protocolo:

Ser utilizada uma cultura de bactrias E.coli HB101 que foi inoculada ontem no final da tarde
em meio de cultura lquido esterilizado (meio LB: triptona 1%, extrato de levedura 0,5%, NaCl
1%, pH final ajustado para 7,5 com NaOH) e mantida sob agitao vigorosa a 37C at hoje
pela manh, quando a cultura foi transferida para geladeira.

Coletar as bactrias pela centrifugao de 20mL da cultura a 5000rpm por 5 min. Descartar o
meio de cultura em um frasco contendo Lisoform a 10 %. Secar bem o tubo, invertendo-o
sobre papel absorvente. Balancear os tubos!

Adicionar 6mL da soluo I (citrato de sdio 0,015M, NaCl 0,15M, pH final ajustado para 7,0
com HCl). Tampar o tubo e ressuspender o precipitado de bactrias por inverso.

Remover a tampa e adicionar 0,7mL da soluo II [Dodecil Sulfato de Sdio (SDS) 10%
(P/V)]. Fechar o tubo e incub-lo em banho-maria a 60C por 10 min, com agitao manual
suave.

Retirar o tubo do banho, abrir e deix-lo a temperatura ambiente por 5min. Adicionar igual
volume (6,7mL) da soluo III (Clorofrmio:alcool isoamlico 24:1 V/V). No pipetar com a
boca! Fechar muito bem o tubo. Agitar suavemente por 10 min a temperatura ambiente. Esta
etapa deve ser realizada na capela de exausto.

Centrifugar 5 min a 5000 rpm.

Remover delicadamente a fase aquosa (fase superior) com pipeta Pasteur de ponta grossa
para uma proveta. Estimar o volume e transferir para um clice graduado.

Medir, na mesma proveta, 2 volumes de etanol resfriado a -20C e adicion-lo lentamente

com pipeta Pasteur, pela parede do clice.

"Enrolar" o DNA com uma pipeta Pasteur de ponta curva. Transfer-lo para um tubo de
ensaio contendo 10mL de Soluo IV (NaCl 1%). Aquecer a 50oC, por 10-20min, at completa
dissoluo.

Identificar o tubo com o nmero do grupo. Tomar uma alquota e diluir em 1 ml de gua.
Medir a D.O.260nm e D.O.280nm e calcular a relao D.O.260nm /D.O.280nm. Estimar a quantidade de
DNA obtida assumindo que D.O.260nm (Densidade ptica a 260nm) = 1 equivale a 50g
DNA/mL.

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 QBQ-217/Bioqumica e Biologia Molecular do Gene 2003

RELATRIO - EXPERINCIA No.1

Nome:
Grupo No. Data

OBJETIVO DA EXPERINCIA:___________________________________________
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RESULTADOS OBTIDOS :_______________________________________________

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 QBQ-217/Bioqumica e Biologia Molecular do Gene 2003

Nome:

QUESTES:

1. Qual a funo do SDS, Clorofrmio: Isoamlico e Etanol nas etapas da purificao?

Consultar tabela (no fim da apostila).

2. Por que possvel "enrolar" o DNA no basto de vidro?

3. Cite dois cuidados importantes para o sucesso da experincia realizada.

4. Se compararmos as medidas de absoro a 260 nm e a 280 nm da amostra de DNA obtida

e de uma soluo de DNA puro obtido a partir do mesmo volume inicial de cultura de bactrias,
o que observaramos? Por que?

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 QBQ-217/Bioqumica e Biologia Molecular do Gene 2003

5. Qual o espectro de absoro do DNA na luz ultravioleta. Como se compara com o espectro
de absoro de albumina?

6. Como voc faria para obter DNA puro a partir dessa preparao que contm DNA e RNA?

7. Por que ocorre o efeito hipercrmico na desnaturao do DNA?

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 QBQ-217/Bioqumica e Biologia Molecular do Gene 2003

EXPERINCIA No.2:INDUO DA -GALAGTOSIDASE POR IPTG.

A -galactosidase de E.coli uma enzima indutvel que hidrolisa -D-galactosdeos. A atividade

desta enzima pode ser medida com substratos cromognicos que quando hidrolisados do
origem a produtos coloridos. Um exemplo o orto-nitrofenil--D-galactosdeo (ONPG) que
incolor mas na presena de -galactosidase convertido a galactose e orto-nitrofenol. O orto-
nitrofenol amarelo e sua absoro pode ser medida a 420nm. Altos nveis de -galactosidase
s so medidos em culturas crescendo na presena de lactose ou de um indutor no
metabolizvel, o IPTG (isopropil-tiogalactosdeo).

Protocolo:

Ser utilizada uma pr-cultura de bactrias E.coli CSH23 que foi semeada ontem no final da
tarde em meio de cultura lquido esterilizado e mantida at hoje pela manh, quando a cultura
foi transferida para geladeira.

Tome uma alquota da pr-cultura de bactrias e dilua em meio lquido na presena e

ausncia de IPTG (1mM) sob agitao vigorosa a 37C at a cultura atingir D.O.600nm
(Densidade ptica a 600nm) = 0,7. Esfrie as culturas no gelo por 20 min.

Retire 0L, 50L e 100L de cada cultura, transferindo separadamente para 3 tubos
Eppendorf previamente identificados. Complete com gua para um volume final de 100L.
Adicione 0,7mL de tampo de ensaio (tampo fosfato de sdio 0,1M pH 7,0 contendo KCl
10mM, MgSO4 1mM e -mercaptoetanol 50mM).
No descarte o restante das culturas mantendo-as no gelo.

Adicione 50 L de cloroformio. Agite bem. Incube os tubos em banho de gua a 30oC por 5
min.

Inicie a reao pela adio de 200 L de ONPG (4mg/mL) e incube a mistura de reao em
banho de gua a 30oC por 10 min.

Interrompa a reao adicionando 0,4mL de Na2CO3 1M.

Centrifugue os tubos por 5 min na minicentrfuga.

Remova delicadamente o sobrenadante de cada tubo para a cubeta sem retirar o

clorofrmio, e faa a leitura da D.O.420nm (Densidade ptica a 420nm). Enxague as cubetas
com gua entre a cada leitura.

Faa uma diluio 1:10 das culturas de E.coli e faa a leitura da D.O.600nm (Densidade ptica
a 600nm).
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 QBQ-217/Bioqumica e Biologia Molecular do Gene 2003

Calcule a atividade de -galactosidase das duas culturas:

Atividade de -galactosidase = 1000 x D.O.420nm __________________ UNIDADES

tempo (min) x volume x D.O600nm
de cultura (mL)

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 QBQ-217/Bioqumica e Biologia Molecular do Gene 2003

RELATRIO - EXPERINCIA No.2

Nome:
Grupo No. Data

OBJETIVO DA EXPERINCIA:___________________________________________
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RESULTADOS OBTIDOS :_______________________________________________

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Nome:

QUESTES:

1. O que voc pode concluir sobre o gentipo da cepa CSH23?

O que voc esperaria encontrar em um experimento semelhante utilizando uma cepa cujo
gentipo I-O+Z+? E no caso de uma cepa I+O-Z+? Proponha um experimento para distinguir
entre estas cepas.

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 QBQ-217/Bioqumica e Biologia Molecular do Gene 2003

EXPERINCIA No. 3: TRANSFORMAO DE BACTRIAS COM PLASMDIOS

CONTENDO GENES DE RESISTNCIA A ANTIBITICOS.

A tcnica de transformao permite a introduo de plasmdeo em uma bactria e sua

manuteno como um elemento autnomo auto-replicativo. Este plasmdeo pode conferir
bactria hospedeira certas propriedades (por exemplo resistncia a drogas) que podem ter
valor seletivo no meio. Vrias tcnicas so disponveis para transformar uma bactria. Na aula
prtica usaremos o mtodo do CaCl2. Neste mtodo as bactrias so submetidas a um
tratamento num meio hipotnico contendo clcio que as torna competentes para a
transformao pelo DNA do plasmdeo. Usaremos o plasmdeo pBR322 (ver mapa abaixo).
O plasmdio pBR322 comumente usado para clonagem de genes inteiros ou de
fragmentos de genes. Alm da origem de replicao que permite sua propagao em bactrias
(E. coli) o pBR322 apresenta duas marcas genticas, ou seja, genes que codificam para
protenas que conferem resistncia a ampicilina (ampr) e tetraciclina (tetr). Portanto a
introduo de pBR322 em E. coli que normalmente sensvel tanto ampicilina como
tetraciclina, leva ao aparecimento de bactrias capazes de crescer em meio (lquido ou slido)
contendo estes antibiticos.
Note que a introduo de genes exgenos no stio da enzima de restrio Pst I leva
perda da resistncia ampicilina, uma vez que este stio est localizado na regio ampr. Da
mesma forma, clonagem no stio da enzima Bam HI leva perda da resistncia a tetraciclina.
Transformao de bactrias que so sensveis a um antibitico, em resistentes, ser
revelada atravs de plaqueamento (inoculao) de bactrias em placas de agar contendo meio
LB (meio rico de Luria Bertani) na ausncia e na presena de antibiticos: placas LB-A ou LB-
tet. contendo 50 mg/ml ampicilina ou 12,5 mg/ml tetracicilina.

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 QBQ-217/Bioqumica e Biologia Molecular do Gene 2003

Protocolo:
O ideal seria fazermos a experincia em condies estreis, para evitar contaminao. Como
isto no ser possvel, manipule convenientemente o material estril fornecido. NO ABRA AS
PLACAS DE GAR AT O MOMENTO DE USO.
As bactrias competentes para transformao foram preparadas a partir de uma cultura em
fase exponencial do crescimento e atravs de sucessivas lavagens do precipitado de bactrias
com uma soluo de CaCl2 e mantidas congelads a -80oC.

Inocular 5 ml de meio LB lquido com uma colnia de bactrias HB101 (E. coli) e incubar
37C at o dia seguinte sob forte agitao (200-250 rpm).
Diluir a pr-cultura 1/10 em 10 ml de meio LB, incubar 37C sob agitao at OD600nm =0,3
(fase logartmica de crescimento).
Transferir a cultura para o gelo, coletar as bactrias por centrifugao (4000 rpm, 5min).
Ressuspender o sedimento de bactrias em 10 ml de tampo acetato de sdio (frio) 20 mM pH
6,5 contendo CaCl2 0,1M. Incubar no gelo por 20 minutos.
Coletar as bactrias (4000 rpm, 5 min) e ressuspender em 1 ml do mesmo tampo (frio).
Aps pelo menos 30 min. no gelo estas BACTRIAS COMPETENTES podem ser
transformadas.
Para transformar, distribui 0,1 ml/tubo da suspenso de bactrias competentes para cada um
de 2 tubos. Adicionar o DNA transformante (0,5 g DNA de pBR322 em 10 l de tampo
10 mM Tris pH 7,5 contendo 1 mM EDTA) a um dos tubos. O outro tubo ser usado como
controle (bactria apenas).
Incubar em gelo por 15 min. antes de dar o choque trmico (42C por exatamente 90
segundos). Transferir os tubos para o gelo por 2 min.
Adicionar 0,9 ml/tubo de meio LB e incubar a 37C sem agitao, em banho-maria, por uma
hora.
Tranferir 25l ou 250l da suspenso para placas de gar LB e LB-A (LB contendo
ampicilina) previamente identificadas conforme a tabela abaixo. Espalhar as bactrias com o
auxlio de uma ala de vidro, previamente flambada e em seguida resfriada na prpria tampa
da placa de Petri.

Nmero de colnias/ placa

Placa LB Placa LB-A
#1 Bactrias controle 25L
#2 Bactrias controle 250L

#3 Bactrias transformadas 25L

#4 Bactrias transformadas 250L

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 QBQ-217/Bioqumica e Biologia Molecular do Gene 2003

RELATRIO - EXPERINCIA No.3

Nome:
Grupo No. Data

OBJETIVO DA EXPERINCIA:___________________________________________
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RESULTADOS OBTIDOS:
1. Preencher a tabela com o nmero de colnias obtido em cada caso.

Nmero de colnias/ placa

Placa LB Placa LB-A
#1 Bactrias controle 25L
#2 Bactrias controle 250L

#3 Bactrias transformadas 25L

#4 Bactrias transformadas 250L

2. Qual a eficincia de transformao obtida, em termos de n de colnias/ug de DNA?

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 QBQ-217/Bioqumica e Biologia Molecular do Gene 2003

Nome:

QUESTES:

1. Por que se usa cultura em fase exponencial de crescimento para obter bactrias
competentes?

2. Qual o papel do choque trmico?

3. Por que as bactrias devem ser incubadas por 60 min a 37C antes de espalh-las em
placas de gar?

4. Que utilidade teria esta tcnica do ponto de vista biotecnolgico ? D um exemplo.

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 QBQ-217/Bioqumica e Biologia Molecular do Gene 2003

EXPERINCIA No. 4: PREPARAO DE DNA PLASMIDIAL

A partir das bactrias transformadas obtidas na experincia anterior, extrair e purificar o DNA
plasmidial, separando-o do DNA cromossomal bacteriano.

Protocolo:
Utilizaremos cultura de E. coli em meio LB-A (50g/ml ampicilina).

1. Tomar 1 ml da cultura e colocar em um tubo Eppendorf.

2. Centrifugar a 12000xg por 5 min temperatura ambiente.

3. Descartar o sobrenadante e secar o sedimento invertendo o tubo sobre papel absorvente

por 1 min.

4. Adicionar 100l de tampo GET/RNase e ressuspender as bactria por agitao no vortex.

5. Adicionar 200l de soluo de lise e inverter 10 vezes o tubo lenta e delicadamente.

6. Incubar a mistura por 5 min temperatura ambiente.

7. Adicionar 200l de soluo neutralizadora e inverter 10 vezes o tubo bem lenta e

delicadamente

8. Incubar o tubo em gelo por 20 min.

9. Centrifugar a 12000xg por 15 min temperatura ambiente.

10. Transferir 440l do sobrenadante resultante da centrifugao do passo 9 para outro

eppendorf contendo 300l de isopropanol.

11. Centrifugar a 12000xg por 10 min temperatura ambiente,

12. Desprezar o sobrenadante e levar o sedimento com 500l de 70% etanol.

13. Centrifugar a 12000xg por 5 min temperatura ambiente.

14. Secar o sedimento sob vcuo em speed vac e ressuspend-lo em 25l de T.E.

15. Incubar por 5 min a 65oC.

16. Tomar um volume apropriado da soluo de plasmdeos e adicionar tampo de amostra na

proporo 1:10.

17. Aplicar a amostra em gel 0.7% agarose em TBE, contendo 0,5g/ml brometo de etido e
submeter a eletroforese a 100V em tampo TBE.
18. Observar o DNA obtido na preparao por iluminao do gel com luz ultravioleta.

GET/Rnase dextrose 50mM, EDTA 10mM, Ribonuclease A 150g/ml em Tris-HCl 25mM pH 8.0
Soluo de lise SDS 1% em NaOH 0,2N
Soluo neutralizadora Acetato de potssio 3M pH 4,8

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 QBQ-217/Bioqumica e Biologia Molecular do Gene 2003

RELATRIO - EXPERINCIA No.4

Nome:
Grupo No. Data

OBJETIVO DA EXPERINCIA:___________________________________________
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RESULTADOS OBTIDOS :_______________________________________________

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 QBQ-217/Bioqumica e Biologia Molecular do Gene 2003

Nome:

QUESTES:

1. Que papel desempenha cada componente do tampo GET (glicose, EDTA e Tris)?

2. O que lisozima e para que usada na preparao de plasmdeos?

3. Qual a funo do NaOH e do SDS presentes na soluo de lise?

4. Se o DNA cromosomal tiver sido muito quebrado durante as manipulaes, onde espera
encontr-lo aps precipitao com KAc? Quais as consequncias para a preparao de DNA
plasmidial?

5. Como age o isopropanol? Este lcool poderia ser substitudo por etanol, por exemplo?

6. Por que se dissolve a preparao de DNA em tampo Tris-EDTA?

7. Quantas bandas do DNA plasmidial so vizualizadas no gel corado com EtBr? Quantas
bandas voce esperaria caso o pBR322 purificado fosse digerido com a enzima EcoRI?

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 QBQ-217/Bioqumica e Biologia Molecular do Gene 2003

EXPERINCIA No. 5: DIGESTO DE DNA COM ENZIMAS DE RESTRIO e

ELETROFORESE DE DNA EM GEL DE AGAROSE

Preparaes de DNA plasmidial ou cromossomal purificadas podem ser submetidas a digesto

com enzimas de restrio para identificao e caracterizao do DNA. A escolha das enzimas
de restrio deve ser baseada no mapa de restrio (quando disponvel) ou opta-se pelo
emprego de um conjunto de enzimas de forma a permitir a caracterizao do DNA em questo,
ou seja, obter seu mapa fsico. As enzimas de restrio classificam-se em 3 gupos quanto a
fora inica para a atividade (alta, mdia e baixa). As enzimas de restrio comercialmente
disponveis costumam vir acompanhadas do tampo correspondente e instrues para realizar
a reao.
Na experincia a ser realizada o DNA do plasmdeo ser digerido com 4 enzimas de restrio
diferentes.

- Cada grupo (ver tabela abaixo) receber um tubo Eppendorf contendo os componentes da
reao com exceo do DNA plasmidial. Manter o tubo em banho de gelo.

Acrescentar 10L da soluo de plasmdeo (DBQ1, 150ng/10L) no tubo.

GRUPOS 1,7,13,19 2,8,14,20 3,9,15,21 4,10,16,22 5,11,17,23 6,12,18,24

EcoRI BglII EcoRI e EcoRI e BglII e sem
BglII XbaI XbaI enzima
H2O 7 L 7 L 6 L 6 L 6 L 10L
Tampo da 2 L 2 L 2 L 2 L 2 L -
enzima (10X)
Enzima (1 U) 1L 1L 1L / 1L 1L / 1L 1L / 1L -
Plasmdeo 10L 10L 10L 10L 10L 10L
Volume total 20L 20L 20L 20L 20L 20L

Misturar o contedo dos tubos por agitao e centrifugao rpida.

Incubar a reao em banho maria a 37C durante 60min.

Interromper a reao pela adio de 1L EDTA 0,1 M (Opcional). Transferir o tubo para um
banho a 65C, durante 15min. Retirar o tubo do banho e rapidamente coloc-lo em gelo.

Adicionar a cada um dos tubos 5L de tampo da amostra. Misturar e centrifugar. A amostra

est pronta para ser analizada em eletroforese em gel de agarose.

Tampo de digesto 10X Tampo da amostra

Tris-HCl 100mM - 500mM* Tris 10mM pH 8,
NaCl 500mM-1M* EDTA 1mM pH 8,
MgCl2 100mM azul de bromofenol 0,25% p/v
DTT 10mM xileno cianol 0,25% p/v
*(depende da enzima) sacarose 40% p/v

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 QBQ-217/Bioqumica e Biologia Molecular do Gene 2003

FRACIONAMENTO DO DNA EM GEL DE AGAROSE

Preparo do gel de agarose 1,0%

OBS: Sero montados dois gis com espao para aplicao de at 14 amostras

Pesar 1,0 g de agarose. Adicionar 100mL de tampo TBE (Tris-borato 89mM, EDTA 2mM
pH8).

Aquecer em banho fervente e misturar at completa dissoluo da agarose. Enquanto

espera-se a dissoluo da agarose, preparar a forma para o gel. Resfriar at 40C (at
conseguir segurar com as mos) e acrescentar 5L de uma soluo de brometo de etdio
10mg/mL. CUIDADO BROMETO DE ETDIO CARCINOGNICO!
Despejar sobre a forma para o gel previamente preparada, incluindo a colocao do pente.
Deixar solidificar por pelo menos 30min.

Retirar o pente e transferir o gel para a cuba. Adicionar tampo TBE cuba de modo a cobrir
o gel com menor volume possvel.

Aplicar as amostras preparadas na experincia anterior. Ligar a fonte de eletroforese e

aplicar aproximadamente 100V. Cuidado para no tocar o tampo.

Interromper a eletroforese quando o corante azul estiver a 0,5cm do fim do gel.

Tranferir o gel para o transiluminador e, em seguida observar o gel sob luz UV, utilizando
culos protetores. Fotografar o padro de bandas observado com uma rgua posicionada na
lateral do gel.

OBS: Ordem de aplicao das amostras nos gis

GEL 1 1 - 2 - 3 - 4 -5 6 - Padro de tamanho - 7 - 8 - 9 10 11- 12

GEL 2 13 - 14 -15 16 17 18 - Padro de tamanho - 19 20 21 22 23 24

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 QBQ-217/Bioqumica e Biologia Molecular do Gene 2003

RELATRIO - EXPERINCIA No.5

Nome:
Grupo No. Data

OBJETIVO DA EXPERINCIA:___________________________________________
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RESULTADOS OBTIDOS: :______________________________________________

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 QBQ-217/Bioqumica e Biologia Molecular do Gene 2003

Nome:
QUESTES:

1. Por que se observam duas bandas no plasmdeo que no foi incubado com a enzima?

2. Por que se utiliza EtBr (Brometo de Etdio) no gel e no tampo da eletroforese?

3. Gis de agarose podem ser usados para anlise de fragmentos de DNA que tenham entre
70 a 800.000 pares de base. Assim, possvel estimar o tamanho e a quantidade dos
fragmentos de DNA. O tamanho pode ser estimado tomando-se por base a sua mobilidade em
relao a de outros de tamanho conhecido. Se o gel foi fotografado com uma rgua ao lado, a
mobilidade relativa pode ser lida diretamente da foto. O grfico da mobilidade em cm (M) contra
o tamanho em pb (L) dar uma curva que pode ser usada para leitura do tamanho com relao
a uma determinada mobilidade. Entretanto, a interpolao muito mais precisa se a funo
puder ser encontrada em uma linha reta: grfico de log L versus M. Desenhe a reta utilizando
papel monolog (eixo x, mobilidade em cm, eixo y, tamanho em pb). Usando-se a mistura de
padres de tamanho em pb conhecida calcule o tamanho dos fragmentos obtidos da digesto
do pQBQ com as enzimas utilizadas. Faa um desenho do pQBQ indicando a posio dos
stios de clivagem para estas enzimas.

5000 bp
4000 bp
3000 bp
2000 bp
1600 bp

1000 bp
500 bp

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 QBQ-217/Bioqumica e Biologia Molecular do Gene 2003

EXPERINCIA No. 6: EXPRESSO DE PROTENA RECOMBINANTE EM E.

COLI.

A produo de protenas exgenas em E. coli uma das muitas aplicaes da

tecnologia do DNA recombinante. Para que a expresso da protena de interesse seja obtida,
um fragmento de DNA contendo a regio codificadora do gene correspondente deve ser
clonado num valor de expresso de E. coli, sob o controle de um promotor geralmente
induzvel.
Na experincia a ser realizada, a expresso da protena est sob o controle do promotor
lac e a induo feita com IPTG.
Aps a induo, as amostras sero analisadas por eletroforese em gel de poliacrilamida.
O gel de eletroforese constitudo de um polmero de acrilamida. A polimerizao ocorre
na presena de radicais livres, os quais so gerados por persulfato de amnio e estabilizados
por TEMED (N,N,N,N-tetramethilethilenediamina). A polimerizao tambm depende da
presena de um agente bifuncional N,N'-methilenebisacrilamida tornando as cadeias ligadas
entre si formando um gel cuja porosidade determinada pelo comprimento das cadeias e pelo
grau de interligao entre estas.
O sistema de eletroforese que ser utilizado ser um sistema denominado descontnuo.
So utilizados dois tipos de gel, um denominado gel de empilhamento e outro denominado gel
de corrida. A funo do gel de empilhamento de concentrar amostras com grande volume,
resultando em uma melhor definio e resoluo dos resultados. As molculas so, ento,
completamente separadas no gel de corrida

I Pr-Inculo: 10 mL de meio LB, antibitico a uma concentrao final 100g/mL (100L de

carbenicilina 50mg/mL) e bactria (1 colnia). Crescer a 37C por uma noite com agitao de
200 rpm.

II Induo
1 Num erlenmeyer colocar 10mL de meio LB fresco contendo carbenicilina 100g/mL e diluir
o pr-inculo (DO600nm deve estar entre 0,1 e 0,15). Incubar a 37C e 200 rpm.
2 Quando a cultura atingir DO600nm entre 0,4 e 0,5 coletar uma alquota de 1mL (cultura no
induzida) e adicionar IPTG cultura para concentrao final 1mM. Colocar a 37C, 200 rpm por
1 hora.
3 Depois de 1 hora coletar uma alquota de cultura induzida (1 mL).

III Tratamento das amostras induzida e no induzida

1 Centrifugar 16000 x g por 5 minutos a temperatura ambiente.

2 Desprezar o sobrenadante.
3 Ressuspender o sedimento em 100L de tampo amostra para eletroforese 1X (Tris 50 mM
pH 6,8; DTT 25 mM; glicerol 10%; SDS 1% e azul de bromofenol 0,025%).
4 Ferver a 95C por 5 minutos.
5 Aplicar as amostras no gel de poliacrilamida (SDS-PAGE).

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 QBQ-217/Bioqumica e Biologia Molecular do Gene 2003

RELATRIO - EXPERINCIA No.6

Nome:
Grupo No. Data

OBJETIVO DA EXPERINCIA:___________________________________________
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RESULTADOS OBTIDOS: :______________________________________________

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 QBQ-217/Bioqumica e Biologia Molecular do Gene 2003

Nome:
QUESTES:

1. Qual o papel da carbenicilina?

2. Por que se usa IPTG para a induo da sntese da protena recombinante?

3. Pode ser produzida uma glicoprotena utilizando-se o procedimento aqui descrito?

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 QBQ-217/Bioqumica e Biologia Molecular do Gene 2003

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 QBQ-217/Bioqumica e Biologia Molecular do Gene 2003

PROPRIEDADES FSICO-QUMICAS DOS CIDOS NUCLEICOS

DNA RNA

Fora inica
baixa ("Salting in") Solubiliza Solubiliza
alta ("salting out) Precipita Precipita

Meio cido 0,5N Precipita Precipita

(brando) frio Depurina Depurina

Meio alcalino brando ss: estvel Hidrolisa

(0,3N KOH; 37C; 18h) ds: desnatura 2' e 3'nucleosdeos

Solvente orgnico
(cte dieletr. < que da H2O) Precipita Precipita
ex.: etanol, isopropanol

Agentes desnaturantes ss: estvel 1ria: estvel

quebram pontes de H ds: desnatura 2ria: destruda
ex.: formamida, uria

Luz UV (260 nm) ss: absorve mais Absorve

ds: absorve menos

Calor ss: estvel 1ria: estvel

ds: desnatura (Tm) 2ria: destruda
Exonucleases + +
Nucleases
Endonucleases + +

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 QBQ-217/Bioqumica e Biologia Molecular do Gene 2003

INIBIDORES DE TRANSCRIO OU DE TRADUO

ANTIBITICOS

Rifamicina (Streptomyces) Rifampicina (sinttica)

Inibe iniciao da transcrio (impede a formao da la. ligao fosfdieser) mas no
inibe elongao da cadeia de mRNA. Liga-se subunidade de RNAP.

Actinomicina D: Estrutura: 2 peptdeos + 3 anis benzeno fenoxazona (ver p 715 Stryer).

Extrada de Streptomyces. Inibe transcrio. Liga-se a dsDNA impedindo que seja usado como
template. Anis fenoxazona intercalam-se entre as bases nitrogenadas do RNA. Usado em
tratamento de cncer.

-Amanitina (octapeptdeo cclico) de um cogumelo (Amanita)

Inibe RNAPII (muito) e III (um pouco, em maior concentrao).
Liga-se a RNAPII bloqueando a formao de mRNA ou de precursores de mRNA. Inibe
elongao.

Puromicina: Inibe traduo. Anlogo de aminoacil-tRNA. Liga-se ao stio A do ribossomo,

impedindo a entrada de aminoacil-tRNAS.
Foma ligao peptdica com a cadeia polipeptdica nascente (peptidil transferase).
Peptidil-puromicina: peptdeo liberado do ribossomo contendo puromicina ligada
covalentemente ao C-terminal.

Tetraciclina: Liga-se ao stio A do ribossomo, impede ligao de aminoacil-tRNA neste stio.

Cloranfenicol: S inibe a sntese de protenas de procariotos e mitocndira (no inibe a sntese

protica extramitocondrial de eucariotos).

Cicloheximida: Inibe a formao dos ribossomos de eucariotos (80S) mas no de procariotos

(70S).

Estreptomicina: Causa leitura incorreta do cdigo gentico.

TOXINAS

Diftrica: Inibe sntese protica. Alvo EF2 que cataliza a translocao do peptdeo.
O fragmento A da toxina cataliza a transferncia de ADP para EF2 (ADP-ribosilao)
inativando este fator de elongao da cadeia polipeptdica.

Ricina: Inativa a subunidade 60S dos ribossomos eucariticos.

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 QBQ-217/Bioqumica e Biologia Molecular do Gene 2003

CDIGO GENTICO
UUU Phe UCU Ser UAU Tyr UGU Cys
UUC Phe UCC Ser UAC Tyr UGC Cys
UUA Leu UCA Ser UAA STOP UGA STOP
UUG Leu UCG Ser UAG STOP UGG Trp
CUU Leu CCU Pro CAU His CGU Arg
CUC Leu CCC Pro CAC His CGC Arg
CUA Leu CCA Pro CAA Gln CGA Arg
CUG Leu CCG Pro CAG Gln CGG Arg
AUU Ile ACU Thr AAU Asn AGU Ser
AUC Ile ACC Thr AAC Asn AGC Ser
AUA Ile ACA Thr AAA Lys AGA Arg
AUG Met ACG Thr AAG Lys AGG Arg
GUU Val GCU Ala GAU Asp GGU Gly
GUC Val GCC Ala GAC Asp GGC Gly
GUA Val GCA Ala GAA Glu GGA Gly
GUG Val GCG Ala GAG Glu GGG Gly

AUG parte do sinal de iniciao e tambm o cdon para as metioninas

internas cadeia.

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