METABOLISMO DE CUMARINA

POR Aspergillus niger ATCC11394

Lic.Aguirre-Pranzoni, Celeste
 Algunos datos de metabolismo de
cumarina en otros organismos….
Mamíferos:
Ratas y humanos

Monooxigenasa
Citocromo
P450

Alcohol
deshidrogenasa

Jeffrey D. Vassallo, Sarah M. Hicks,George P. Daston, and Lois D. Lehman-McKeeman Metabolic Detoxification Determines
Species Differences in Coumarin-Induced Hepatotoxicity TOXICOLOGICAL SCIENCES 80, 249–257 (2004)
 Hongos filamentosos:
Phanerochaete chrysosporium

Monooxigenasa
Citocromo
P450

Fumiko Matsuzaki, Hiroyuki Wariishi- Functional diversity of cytochrome P450s of the white-rot fungus
Phanerochaete chrysosporium Biochemical and Biophysical Research Communications 324 (2004) 387–393
 Bacterias:
Arthrobacter

Levy Carl and Frost Phillip The metabolism of coumarin by a microorganism. J. Biol. Chem. 241, 4, (1966), 997-
1003 and papers cited therein.
1962 el inicial ataque de COU es en el enlace 3-4 para dar DHC (Melillotus)

Bacterias:
Pseudomona putida

XenA: familia de las OYE

Levaduras:

H+

S. cereviciae

Katrin Häser, Hans Henning Wenk, and Wilfried Schwab, Biocatalytic Production of Dihydrocoumarin from
Coumarin by Saccharomyces cerevisiae J. Agric. Food Chem. 2006, 54, 6236-6240.

Diferentes vías de metabolismo de cumarina

Aspergillus niger
Posee un eficiente metabolismo de xenobioticos: multiples Cit-P450
En 1967, Dyson reportaron: Ac. Melilotico como metabolito principal y
trazas de hidroxicumarinas.

Nuestro Objetivo:
Estudiar el metabolismo de A. niger a través biotransformaciones a
célula entera:
Analizar la cinética de bioreacción cada 24hs por medio
de GC-MS y RMN.
CULTIVO EN BATCH
Medio de cultivo

Cultivo II
24 h

Cultivo I

Buffer fosfato

200 rpm

28 ºC

Sustrato
 SCREENING DE BIOCATALIZADORES FÚNGICOS

Hongos levaduriformes

5 4
6 3
No biotransformó
7
O 2 O
8 1 Rhodotorula sp.

5 4
6 3

O O 7 O O
S. cereviciae 8
 SCREENING DE BIOCATALIZADORES FÚNGICOS

Hongos filamentosos del género Aspergillus

Análisis por GC-FID Biocatalizadores seleccionados
para estudios cinéticos
SUSTRATO BIOTRANSFORMADO

A.terreus

A.ochraceus

A.fumigatus

A.flavus

A.niger (ATCC11394)

A.nigerIM7

0% 20% 40% 60% 80% 100%

 ESTUDIO CINÉTICO DE CEPAS SELECCIONADAS
Aspergillus ochraceus

Análisis por GC-FID

CULTIVO EN DESARROLLO CULTIVO EN REPOSO

100%
productos de biotransformación

80%

60%

40%

20%

0%
0h 24 h 48 h 72 h 96 h 144 h

5 4
sustrato metabolito A 3
6

A. ochraceus
O 7 O O
O
8
 ESTUDIO CINÉTICO DE CEPAS SELECCIONADAS
Aspergillus flavus
OH

Análisis por GC-FID

O O A. flavus O O
CULTIVO EN REPOSO
Productos de biotransformación

100%
80%
60%
40%
20%
0% CULTIVO EN DESARROLLO
0h 24 h 48 h 72 h 96 h 144 h

productos de biotransformación
100%
sustrato metabolito A metabolito B
80%
60%
40%
20%
0%
0h 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h 144 h

sustrato metabolito A metabolito B

 Biotransformación de cumarina
1H
A.niger Tiempo 0
RMN
 Biotransformación de cumarina
1H
A.niger Tiempo 24 horas
RMN
 ESTUDIO CINÉTICO DE CEPAS SELECCIONADAS
Aspergillus niger ATCC11394

Análisis por CG-EM

D:\Xcalibur\data\MKS\MKS-Spt-2m 8-12 01/10/2008 08:39:15 a.m .
Cele-T2-C2-SL3
m 8-10 30/09/2008 04:31:14 p.m .
RT: 0,00 - 26,85
14,18
100

0h
13,46 95

90

85
48 h NL:
4,07E5
TIC MS
MKS-Spt-
2m 8-10
80 O O
O O
75
M+ 148
M+ 146
70

65

Relative Abundance
60

55

50

45

40

35 OH OH
30
M+ 152
25 17,21
20

15 15,53

10 15,62
9,59
3,23 20,73
5 3,39 5,05 5,76 7,95 8,99 18,70
10,16 10,89 13,28 19,37 22
18 4,48 5,59 6,28 7,93 8,97 9,54 11,36 13,06 13,71 14,99 16,49 17,96 18,90 19,60 21,59 22,58 24,59
0
4 6 8 10 12 14 0 16 2 18 4 20 6 22 8 24 10 12 14 16 18 20 22
Tim e (m in) Tim e (m in)

30/09/2008 05:31:04 p.m .

D:\Xcalibur\data\MKS\MKS-Spt-2m 8-13 01/10/2008 09:36:03 a.m .
Cele-T4-C2-SL3
RT: 0,00 - 28,67
14,83 NL:
14,13
100 6,19E3

24 h 72 h
TIC MS
95
MKS-Spt-
90 2m 8-
11_080930

O O
85

O O
173104
80

M+ 146 75
M+ 148 OH OH
70

65
M+ 152
Relative Abundance

60

55

50 15,65
45
40

35 O O
+ 148
17,20
30

25
M
20 18,00
20,93
15 9,57

10 3,21
4,13 7,97 9,01 18,12 20,74
7,93 5 4,49 6,94 10,55 12,93 13,79
5,95 8,99 9,09 10,12 19,45 21,00 22,31
11,51 14,03 15,06 16,29 17,25 21,04 22,32
18,66
0 24,82 25,99 27,52
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 Tim e (m in)
Tim e (m in)
 Aspergillus niger : growing cells

Enotao reductasa

Alcohol deshidrogenasa Monooxigenasa Cit-P450

A

[O2] Aspergillus niger

B
[O2] A B

[O2] [O2]
No biotransformó

No biotransformó

No biotransformó

No biotransformó
A. niger : growing cells

M+176
A.niger : Resting cells
24hs

M+178

M+164
M+194
 Ensayo de Inhibición de Enzimas

¿ La enzima Enoato Reductasa es de

tipo OYE?

A. niger: Resting cells

1- sustrato especifico (0,7mM) + inhibidor ( 2- 8 mM)

2- cumarina (0,7mM) + Inhibidor (2-8mM)
3- bcos. Correspondiente
4- inhibidor +catalizador
A.niger : Resting cells
+ Inhibidor 8mM

24hs

72hs

Inhibidor 8mM + biocatalizador  Productos de biotransformación (?)…. 48hs

 Ensayo de Inhibición de Enzimas

¿ Las enzimas que hidroxilan COU son monooxigenasas Cit.P450 o

Peroxidasas extracelulares ?

1- filtrado de un cultivo de 3 o 4 días

2- Incubación del sustrato con el filtrado
3- Toma de muestra a las 24 y 48 hs

Resultado : No hubo biotransformación del sustrato

 Ensayo de Inhibición de Enzimas

¿ Las enzimas que hidroxilan COU son monooxigenasas Cit.P450 o

Peroxidasas extracelulares ?

Ensayo de Inhibición de cit-P450:

-piperonil butoxido

1- sustrato (0,7)+ inhibidor ( 1-2 y 2,5 mM)

2- inhibidor + biocatalizador

A. niger: Resting cells

Resultados:
1- A las 24 hs de incubación se observo DHC
2- A las 48hs y 6 días DHC continuo siendo el único metabolito
Ensayo de Inhibición de cit-P450:
-piperonil butoxido + Inhibidor 2,5mM

24hs

72hs

6 días
 Conclusión :

Enoato reductasa

Enoato reductasa
Cit-p450
ADH

Cit-p450