Departamento de Ciencias Analticas

METODOS DE SEPARACIN EN QUMICA ANALTICA

Pruebas de Evaluacin Continua 2016/2017

PRIMERA PRUEBA DE EVALUACIN

TCNICAS CROMATOGRFICAS: CG Y HPLC

Equipo Docente:
Alejandrina Gallego Pic
Rosa M Garcinuo Martnez

Presentacin

La presente prueba de evaluacin continua (PEC) pretende profundizar y

trabajar los contenidos desarrollados en la asignatura.
Estas actividades son obligatorias para los estudiantes que opten por la
evaluacin continuada.
Aquellos estudiantes que decidan NO REALIZAR las Pruebas de
Evaluacin Continua (PEC), debern comunicarlo al inicio del curso al
Equipo Docente de la Sede Central. En el caso de que no entreguen la
primera PEC en el plazo fijado, el Equipo Docente entender que el
estudiante renuncia a este tipo de evaluacin.
Para la realizacin de las pruebas de evaluacin continua, el estudiante
encontrar dos documentos: el Enunciado de la actividad (en formato pdf),
que recoge objetivos, fundamentos y orientaciones, y el Cuestionario de
respuesta. Este segundo documento debe ser cumplimentado por el
estudiante y enviado a travs de la plataforma virtual aLF antes de la fecha
fijada para su entrega. El cuestionario de respuesta deber ser enviado en
formato pdf.

PEC 1

Tcnicas cromatogrficas: CG y HPLC

TCNICAS CROMATOGRFICAS: CG Y HPLC

OBJETIVOS
- Comprender los fundamentos de los mtodos cromatogrficos de
anlisis.
- Identificar los diferentes mtodos cromatogrficos.
- Conocer los factores que afectan a la seal cromatogrfica y aprender
como optimizar la eficiencia de separacin.
- Conocer e identificar los diferentes componentes de los distintos
instrumentos cromatogrficos.
- Conocer las distintas aplicaciones de las tcnicas cromatogrficas: CG
y HPLC.

ACTIVIDADES
Esta Prueba de Evaluacin Continua se ha estructurado en tres
actividades. En la primera actividad se revisarn los conceptos generales
de la cromatografa aplicados a la cromatografa de columna. En la
segunda actividad se propone una serie de ejercicios y preguntas
relacionadas con la cromatografa de gases (CG). Por ltimo en la tercera
actividad se centrar en la cromatografa de alta resolucin (HPLC).
PROGRAMAS
Para la realizacin de estas actividades, el estudiante tendr que acceder a
algunas aplicaciones de la web y simuladores que les sern indicados en
todos los casos.
BIBLIOGRAFA
ISBN: 9788448127756. Ttulo: PRINCIPIOS DE ANLISIS INSTRUMENTAL (5)
Autor/es: Skoog, Douglas ; Holler, James ; Nieman, Timothi. Editorial: MC GRAW HILL
ISBN: 9788407005033. Ttulo: CROMATOGRAFA Y ELECTROFORESIS EN COLUMNA
Autor/es: Dabrio Bauls, M. V. Editorial: SPRINGER-VERLAG IBRICA
ISBN: 9788420529882 Ttulo: ANLISIS INSTRUMENTAL (1) Autor/es: Rubinson, Kenneth
A. ; Rubinson, Judith. Editorial: PEARSON ALHAMBRA
ISBN: 9781111111113 Ttulo: ELECTROFORESIS CAPILAR: FUNDAMENTOS,
INSTRUMENTACIN Y SUS DIFERENTES TIPOS
Autor/es: Durand, Jess Senn; Fernndez, Pilar; Garcinuo, Rosa M; Paniagua, G.
Editorial: UNED

PEC 1

Tcnicas cromatogrficas: CG y HPLC

INTRODUCCIN A LA CROMATOGRAFA
El trmino cromatografa es el nombre general para un amplio intervalo de
procesos de separacin en el que los componentes a ser separados se
distribuyen entre una fase mvil y una estacionaria.
Fundamento terico
Los componentes a separar se mueven a diferentes velocidades, en su
desplazamiento a lo largo del sistema cromatogrfico, dependiendo de la
afinidad de cada uno por la fase estacionaria, respecto a la fase mvil.
Cada uno de ellos se distribuye entre las dos fases segn un equilibrio
caracterizado por una constante denominada constante de distribucin o
coeficiente de distribucin. Para el componente A,

[AS]
[AM ]
donde [AS] es la concentracin de A en la fase estacionaria y [AM] la
concentracin en la fase mvil.
KA =

Clasificacin
Los mtodos cromatogrficos pueden clasificarse atendiendo a distintos
factores: El soporte donde tiene lugar la separacin (cromatografa plana o
en columna), el estado fsico de las fases mvil y estacionaria (gaslquido, lquido-lquido, etc.), el mecanismo de la separacin (adsorcin,
reparto), e incluso el tipo de soluto (cromatografa inica, cromatografa
de protenas, etc.).
En la Tabla 1 se muestra una clasificacin de los mtodos cromatogrficos.
Tabla
1.
Clasificacin
general
cromatogrficos (Skoog et al., 2001)

de

los

mtodos

PEC 1

Tcnicas cromatogrficas: CG y HPLC

Caractersticas cromatogrficas
La curva de elucin que se obtiene tras una separacin cromatogrfica se
denomina cromatograma y se representa la seal frente al tiempo. En
general tiene el siguiente aspecto:

t0 (tM) Tiempo muerto, tiempo requerido para que una especie no retenida
alcance el detector.
tR Tiempo de retencin, tiempo transcurrido desde la introduccin de la
muestra hasta que el componente alcanza el detector
tR Tiempo neto de retencin tR tM
t Desviacin estndar altura media del pico en el punto de inflexin
w0.5 (w1/2) Anchura de pico a la semialtura 2.354t
wb Anchura base del pico 4t
Los parmetros de tM, tR, y tR se pueden convertir en volumen muerto V0,
volumen de retencin VR y volumen neto de retencin VR usando un
flujo constante.
Factor de capacidad, k
El tiempo de retencin es constante para un componente dado, en unas
condiciones cromatogrficas fijas (columna, fase mvil, temperatura,..).
Para la caracterizacin de una sustancia es ms conveniente usar el factor
de capacidad, k, que a diferencia con el tiempo de retencin no depende ni
del flujo del eluyente ni de la longitud de la columna:

k' =

t ' R t R - t0 t R
=
= -1
t0
t0
t0

PEC 1

Tcnicas cromatogrficas: CG y HPLC

Valores de k entre 1 y 5 son considerados valores ptimos en una

separacin.
Selectividad,
Dos sustancias se separan slo si tienen diferentes valores de k. La
selectividad, , es una forma de medir la eficiencia de la separacin
cromatogrfica:

a=

k'2 t R,2 - t0
=
k'1 t R,1 - t0

(k2>k1)

Numero de platos, N (Numero de platos tericos)

Un plato terico se define como la zona del sistema de separacin en la
que se establece un equilibrio termodinmico entre la concentracin de un
componente en la fase estacionaria y su concentracin en la fase mvil. El
nmero de platos tericos mide la capacidad de la columna para separar
los componentes, no la retencin de los mismos.
Si el pico cromatogrfico tiene forma Gaussiana el nmero de platos, N,
puede ser calculado mediante la siguiente ecuacin:
2
t
tR
R
N = = 5, 54
=16
st
wb
w0,5

tR

Altura equivalente de un plato terico, H

La altura equivalente de un plato terico, H, est relacionado con el
ensanchamiento de los picos Gaussianos, :

s 2 = ZH

Z es la distancia recorrida por el soluto en una zona

L
N=
H

L es la longitud de la columna

Resolucin, R
La resolucin es una forma de medir la calidad de la separacin entre
picos:

R=

2(t R,2 - t R,1 ) 1,177(t R,2 - tR,1 )

=
wb,1 + wb,2
w0,5,1 + w0,5,2

Una resolucin R = 0,5 es la suficiente para separar dos picos. Una R = 1,5
es perfecta para un anlisis cuantitativo, valores superiores de resolucin
alargan innecesariamente el tiempo del anlisis.
La resolucin tambin depende de k, , y N:

PEC 1

Tcnicas cromatogrficas: CG y HPLC

R=

N a -1 k'2

4
a 1+ k'2

Se debe recordar que:

La resolucin se puede mejorar:

ACTIVIDAD 1: Cromatografa de elucin en columna

En esta actividad se muestra como puede separarse un analito mediante
una cromatografa de elucin. La elucin implica el transporte del
compuesto de inters a travs de una columna por adicin de una fase
mvil. Como se indica en la Figura 1, despus de introducir la muestra que
contiene el analito la fase mvil hace que los componentes de la muestra
se repartan entre ambas fases (estacionaria y mvil). Las sucesivas
adiciones de fase mvil hacen avanzar las molculas de la muestra por la
columna segn las caractersticas qumico-fsicas de sus componentes, en
una serie de continuas transferencias entre la fase estacionaria y mvil. La
diferencia de velocidad con la que migran en la columna los diferentes
componentes de la muestra hace que estos se separen.

PEC 1

Tcnicas cromatogrficas: CG y HPLC

Figura 1. Separacin de los componentes de una mezcla (A y B) por

cromatografa de elucin (Skoog et al., 2001)

En esta actividad se simular una elucin en columna en un laboratorio

virtual, incidiendo en los fundamentos de la cromatografa y respondiendo a
las cuestiones que se plantean.

PEC 1

Tcnicas cromatogrficas: CG y HPLC

ACTIVIDAD 2: Cromatografa de gases

La cromatografa de gases es una tcnica de separacin cromatogrfica en
la que la muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna
cromatogrfica. La elucin se produce por el flujo de una fase mvil de un
gas inerte. A diferencia de los otros tipos de cromatografa, la fase mvil no
interacciona con las molculas del analito; su nica funcin es la de
transportar el analito a travs de la columna. Existen dos tipos de
cromatografa de gases (GC):
Cromatografa gas-slido (GSC). La retencin de los analitos tiene lugar
en una fase estacionaria slida mediante el proceso de adsorcin.
Precisamente este proceso de adsorcin, que no es lineal, es el que ha
provocado que este tipo de cromatografa tenga aplicacin limitada, ya que
la retencin del analito sobre la superficie es semipermanente y se
obtienen picos de elucin con colas. Su nica aplicacin es la separacin
de ciertas especies gaseosas de bajo peso molecular.
Cromatografa gas-lquido (GLC). La cromatografa gas-lquido se basa
en la distribucin del analito entre una fase mvil gaseosa y una fase
lquida inmovilizada sobre la superficie de un slido inerte. Este tipo de
cromatografa tiene gran aplicacin en todos los campos de la ciencias y se
puede llamar simplemente cromatografa de gases (GC).
Principios de la cromatografa gas-liquido
Los principios generales de la cromatografa as como las relaciones
matemticas implicadas, son aplicables a la GC, pero con ligeras
modificaciones debido a la compresibilidad de la fase mvil gaseosa.

En esta actividad, en base a los datos obtenidos por cromatografa de

gases, se discutir el tiempo de retencin de varias sustancias respecto a
su peso molecular y sus puntos de ebullicin, as mismo se estudiar la
mejor relacin temperatura-presin para la separacin de compuestos en
determinadas condiciones.

PEC 1

Tcnicas cromatogrficas: CG y HPLC

ACTIVIDAD 3: Cromatografa de lquidos de alta resolucin

(HPLC)
La cromatografa de lquidos es una tcnica ampliamente utilizada que
permite separar fsicamente y cuantificar los distintos componentes de una
solucin. En toda cromatografa existe un contacto entre dos fases, una fija
que suele llamarse fase estacionaria, y una mvil (fase mvil) que fluye
permanente durante el anlisis, y que en este caso es un lquido. Las
sustancias que permanecen ms tiempo, libres en la fase mvil, avanzan
ms rpidamente con el fluir de la misma y las que quedan ms unidas a la
fase estacionaria o retenidas avanzan menos y por tanto tardarn ms en
salir o fluir. ste es el principio fundamental de la cromatografa.
Tipos de cromatografa lquida

Segn las caractersticas del lecho cromatogrfico

abierto: en papel, en capa fina
cerrado: en columna
Segn la presin del eluyente
baja presin
alta presin
Segn la composicin del eluyente
isocrtica
de gradiente
Segn la polaridad de la fase estacionaria
fase normal
fase reversa
Segn el mecanismo de retencin
de reparto
de filtracin en gel o de exclusin molecular
de adsorcin
de intercambio inico
de afinidad
La cromatografa de lquidos de alta eficacia (HPLC) utiliza una presin
elevada para forzar el paso del disolvente por una columna que contiene
partculas muy finas, consiguiendo as separaciones de gran resolucin.
Campos de aplicacin de la HPLC
La cromatografa de lquidos de alta eficacia es la tcnica analtica de
separacin ms ampliamente utilizada, dada su sensibilidad, determinacin
cuantitativa, idoneidad para la separacin de especies no voltiles o
termolbiles y aplicabilidad a sustancias de inters.
Los distintos procedimientos que utilizan la cromatografa de lquidos,
tienden a ser complementarios en cuanto a sus campos de aplicacin se
refiere (Figura 2).

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PEC 1

Tcnicas cromatogrficas: CG y HPLC

Figura 2. Aplicaciones de la cromatografa de lquidos (Skoog et al., 2001)

En esta actividad, utilizando un simulador, se estudiarn los factores

que influencian la separacin y el anlisis de una mezcla por HPLC.

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