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RESUMEN
Fondo
La activacin de la nicotinamida adenina dinucletido fosfato oxidasa (NADPH)
se considera un mecanismo patognico determinar fibrosis y enfermedades
la progresin de la esteatohepatitis no alcohlica (EHNA). Los polifenoles ejercen
accin antioxidante e inhiben la NADPH oxidasa en los seres humanos.
Objetivo
Para analizar el efecto de los polifenoles del cacao en la NADPH oxidasa isoforma
2
apoptosis de activacin (NOX2), el estrs oxidativo y los hepatocitos en una
poblacin
afectados por NASH.
mtodos
En un estudio transversal comparando 19 EHNA y 19 controles, oxidativo
el estrs, segn la evaluacin de la actividad srica NOX2 y F2-isoprostanos, y el
hepatocito
apoptosis, segn la evaluacin de los niveles sricos de citoqueratina-18 (CK-18),
se midieron.
Por otra parte, los 19 pacientes con EHNA fueron asignados al azar en una
diseo cruzado a 40 g / da de chocolate negro (> 85% de cacao) o 40 g / da de
chocolate con leche (<35% de cacao), durante 2 semanas. sNOX2-dp,
isoprostanes suero
y CK-18 se evaluaron al inicio del estudio y despus de 2 semanas de ingesta de
chocolate.
resultados
En comparacin con los controles, los pacientes con EHNA tuvieron mayores
sNOX2-dp, isoprostanes suero
y CK-18 niveles. Una diferencia significativa para los tratamientos era
encontrado en los sujetos con respecto al sNOX2-dp, isoprostanes suero y suero
CK-18. Las comparaciones por pares mostraron que, en comparacin con el valor
basal, despus de
14 das de ingesta de chocolate negro, una reduccin significativa en sNOX2-dp
se encontr isoprostanos suero y CK-18 M30. No se observaron cambios
despus de la ingestin de chocolate con leche. Un simple anlisis de regresin
lineal mostr

que de sNOX2-DP se asoci con de isoprostanos en suero.

Conclusin
los polifenoles del cacao ejercen una actividad antioxidante a travs de NOX2 baja
regulacin
en los pacientes con EHNA.
INTRODUCCIN
Sin alcohol enfermedad de hgado graso (EHNA) es el ms
enfermedad heptica comn en todo el mundo, con una prevalencia de
aproximadamente 30% en la poblacin comn y de
70 a 80%, en particular, los subconjuntos de pacientes, tales como la diabetes
u obesidad hgado graso no alcohlico subjects.1 representa un amplio espectro
de condiciones, incluyendo el hgado graso simple, pero tambin no alcohlica
esteatohepatitis (NASH), que se caracteriza
por la inflamacin heptica necro-con un potencial de evolucin
a la fibrosis e incluso a cirrhosis.2-4
El estrs oxidativo se considera de vital importancia
en la progresin de la esteatosis simple de la EHNA, lo que representa
uno de los mecanismos ms plausibles implicados
en la progresin de damage.5-7 hgado
Nicotinamida adenina dinucletido fosfato (NOX)
oxidasa se considera el principal reactivas del oxgeno celular
especies (ROS) en la fuente humans8 y su activacin tiene
ha asociado con damages.9 heptica En un estudio reciente de
nuestro grupo encontramos una correlacin entre NOX2- solubles
pptido derivado (sNOX2-dp), un marcador de la activacin de NOX2, 10
suero de 8-iso-prostaglandina F2 alfa (PGF2 a) actualmente
aceptado como uno de el mejor indicador de oxidativo
estrs in vivo,
11 y citoqueratina-18 (CK-18), una validado
apoptosis12 marcador de hepatocitos en pacientes con hgado graso no
alcohlico.
La modulacin de estrs oxidativo por agentes antioxidantes
podra representar una nueva terapia para la EHNA. La vitamina E
ha sido recomendado para los pacientes no diabticos con
NASH.13, 14 Otras administracin de suplementos nutracuticos tienen
Los resultados que se muestran prometedores, especialmente aquellos con
polypenols.15
El cacao tiene alto contenido de polifenoles y ejerce
properties16-19 antioxidante; en particular, el chocolate, oscuro
es capaz de reducir el estrs oxidativo por medio de la reduccin de la activacin
de NOX isoforma 2,20, 21
Estudios recientes en animales sugieren que el cacao podra ayudar
evitar el desarrollo de la enfermedad de hgado graso alcohlico oxidativo
Los estudios experimentales mostraron que el estrs reduction.22
NOX juega un papel fundamental en el desarrollo de NASH9
y que la suplementacin de cacao reduce el dao del hgado por

NOX inhibition.23 A lo mejor de nuestros conocimientos, estudios

no han analizado (i) la relacin entre NOX2
activacin y NASH, y (ii) el efecto de cacao en
NOX2 derivados de estrs oxidativo y dao heptico en
pacientes con EHNA.
MATERIALES Y MTODOS
En la primera fase, se realiz un estudio transversal
para comparar el estrs oxidativo, segn la evaluacin de los niveles en sangre
de isoprostanos y NOX2 soluble (sNOX2-DP), un marcador
de la activacin de NOX2, y apoptosis de los hepatocitos, como
la evaluacin de los niveles sricos de CK-18, en 19 pacientes NASH
y 19 controles pareados. Controles y los pacientes con EHNA
fueron reclutados de la clnica de pacientes externos de nuestra divisin
en la I Clnica Mdica de la Universidad Sapienza de
Roma. procedimientos que coinciden con frecuencia se aplicaron a
controles de seleccin. controles emparejados fueron seleccionados de tal manera
que
la distribucin de la edad y de las caractersticas relevantes
en este grupo fue similar a la distribucin en los casos.
Diecinueve de los 122 pacientes que se sometieron a una visitados
regular de chequeo de salud en nuestra clnica de pacientes externos para
enfermedades metablicas entre marzo el ao 2015 y enero
Se seleccionaron 2.016.
En la segunda fase, se realiz una intervencin
ensayo en pacientes con EHNA para investigar el efecto de todos los das
la suplementacin con 40 g de chocolate (20 g cada
12 h, oscuras contra el chocolate con leche), durante 14 das, en la sangre
niveles de isoprostanos y sNOX2-DP y los niveles sricos de
CK-18.
pacientes esteatohepatitis no alcohlica fueron al azar
asignado a una secuencia de tratamiento con 40 g / da de oscuridad
el chocolate (85% de cacao) o chocolate con leche (35% de cacao)
durante 2 semanas, en un cruce, diseo simple ciego. Cuarenta
gramos de chocolate negro disponible en el mercado (de cacao
slidos> 85%, masa de cacao, grasa reducida de cacao, manteca de cacao,
azcar, vainilla) y la leche 40 g disponible comercialmente
chocolate (cacao <35% de manteca de cacao, azcar, cacao,
leche en polvo, pasta de cacao, grasa de leche, lactosa, leche desnatada
leche en polvo, lecitina de soja, vainilla, slidos de leche <20%)
se utilizaron como control.
El contenido de polifenoles totales fue de 799 mg / L GAE
de chocolate negro y 296 ml / L GAE para el chocolate con leche.
Hubo al menos un lavado de 1 semana entre el
dos fases del estudio. El estrs oxidativo, los niveles sricos de
CK-18 y los metabolitos del chocolate se evaluaron a
inicio del estudio, despus de un 24 h abstinencia de alimentos ricos en
polifenoles, y en el da 14, 12 h despus de la ltima ingestin

de chocolate. Durante el juicio, se requiere que los participantes

seguir una dieta ajustada en funcin de su antropomtrica
y las caractersticas clnicas y de la cantidad de caloras
procedente de la ingesta de chocolate; adems,
participantes evitarse alimentos con alto contenido en polifenoles (arndanos,
cereza, fresa, mora, frambuesa roja,
castaa, t negro, t verde, jugo de manzana puro, avellana,
vino tinto, jugo de granada) y el chocolate adicional.
Las muestras de sangre (para analizar el estrs oxidativo y la epicatequina
niveles) se recogieron en la maana (entre las
08:00 y 09:00 horas) despus de un perodo de ayuno de 8 horas a
la lnea de base y 14 das despus de los dos perodos de diario
la ingestin de chocolate.
Todos los sujetos fueron sometidos a una historia mdica completa, un examen
fsico
examen y un examen de ultrasonido del hgado
la ingesta de chocolate) / desviacin estndar (S. D.). Lo esperado
el tamao del efecto fue de 0,6.
Hemos calculado el tamao mnimo de la muestra con respecto
a una prueba t de dos colas, de Student de una muestra con Welch
correccin, teniendo en cuenta, sobre la base de los datos procedentes
a partir de un estudio piloto anterior (datos no presentados) que
considerado para:
(I) estudio transversal: (i) una diferencia de s-NOX2dp
variacin en NASH a detectar entre NASH
pacientes y controles D: 10 pg / ml; (Ii) s.d. de la emparejado
Diferencias: 7; (Iii) tipo I probabilidad de error a: 0,05 y
de potencia 1? b: 0,90; esto dio lugar a N = 11 pacientes,
que se aument a n = 19.
(Ii) para estudio de intervencin: (i) una diferencia para
variacin s-NOX2dp en la EHNA a detectar entre
los grupos despus de los tratamientos oscuro y chocolate con leche D:
6 pg / ml; (Ii) s.d. de las diferencias emparejadas: 4; (Iii) de tipo I
una probabilidad de error: 0,05 y 1 de energa? b: 0,90; esta
resultado en n = 12 pacientes, que se aument a n = 19.
mtodos de estadstica
Las variables continuas se presentan como media pm DE a no ser que
indique lo contrario. Las diferencias entre las variables categricas
fueron probados mediante la prueba v2. El estudio cruzado
los datos se analizaron para la evaluacin del tratamiento y
los efectos de periodo, mediante la realizacin de una parcela dividida con un
ANOVA
factor entre-sujetos (secuencia de tratamiento) y dos
factores intra-sujetos (perodo 1 vs 2; pre vs. post-tratamiento).
El modelo completo se consider, teniendo en cuenta la
evaluacin de todos los efectos principales y las interacciones. Por parejas
comparaciones fueron corregidos mediante la prueba t para datos apareados.

anlisis bivariante se realiz con el lineal de Spearman

test de regresin. El anlisis de regresin lineal mltiple
se ha realizado mediante una seleccin hacia adelante. P <0,05 fue
considerado estadsticamente significativo. Todos los anlisis se llevaron
a cabo con SPSS V.18.0 (Armonk, EE.UU.).
RESULTADOS
Caractersticas clnicas de los pacientes y los controles son
reportadas en la Tabla 1. Los dos grupos fueron similares para
caractersticas demogrficas y clnicas, con la excepcin
de sNOX2-dp suero, isoprostanos y CK-18 niveles,
los cuales fueron mayores en los pacientes en comparacin con los controles
(Tabla 1).
No hubo diferencias significativas para AST, ALT, total srico
polifenoles y metabolito epicatequina EC-3-O-metil ter
se encontr en la lnea de base en el grupo asignado a
chocolate con leche (Tabla S1).
El estudio de intervencin mostr que, en comparacin con
la lnea de base, despus de 14 das de la ingestin de chocolate con leche, suero
polifenoles totales y el metabolito epicatequina EC-3-Omethylether
(Tabla 2) niveles no cambiaron. A la inversa,
un aumento significativo en polifenoles totales en suero y epicatequina
se detect metabolito despus de 14 das de oscuridad
la ingestin de chocolate (Tabla 2).
Una diferencia significativa para los tratamientos se encontr en
sujetos con respecto a sNOX2-dp suero (P <0,001;
Figura 1a), isoprostanos (P <0,001; Figura 1b) y
CK-18 (P = 0,04; Figura 1c), a partir del ANOVA realiza
en los datos del estudio cruzado.
Las comparaciones por pares mostraron que, en comparacin con
la lnea de base, despus de 14 das de ingesta de chocolate negro, una
significativa
reduccin de peralte en sNOX2-DP (de 8,0 a 37,3
31,2 6,9 pg / ml, p <0,001) (Figura 1), isoprostanes
(De 273,5 41,0 a 230,2 38,6 pg / ml, p <0,001)
(Figura 2) y CK-18 M30 (de 143,7 a 44,4
116,4 20,2 pg / ml, P = 0,02) (Figura 3) fue encontrado. No
No se observaron cambios despus de la ingestin de chocolate con leche
(Figuras 1-3).
En comparacin con la lnea base, despus del tratamiento con oscuro y
chocolate con leche, no se encontraron diferencias significativas para
glucemia en ayunas, insulina, colesterol total, LDL
colesterol, colesterol HDL, triglicridos, y AST
Mesa
c-GT (Tabla 2); una diferencia dbil pero significativa
se detect disminucin de los niveles de ALT despus de 2 semanas de
la ingestin de chocolate negro (Tabla 2).

Un simple anlisis de regresin lineal mostr que

(Expresada por la diferencia de valores entre antes y
despus de 14 das de ingesta de chocolate) de sNOX2-dp
(R = 0,382;? P = 0,018) se asoci con de
8-iso-PGF2a (R = 0,378; p = 0,019).
DISCUSIN
Este estudio muestra que, en comparacin con los controles, NADPH
oxidasa isoforma NOX-2 est regulada positivamente de manera significativa en
pacientes con EHNA. Por otra parte, se encontr que los oscura
la ingesta de chocolate reduce suero sNOX2-dp, isoprostanes
y CK-18 en pacientes con EHNA.
Los estudios en animales mostraron que en ratones knockout NOX2,
deficiente en p47phox, en condiciones de enfermedades hepticas inducidas por
la ligadura del conducto biliar o por una metionina-colina deficiente
dieta, fibrosis atenuada desarrollado pero no
esteatosis, 29, 30 lo que sugiere que podra ser considerado NOX2
un posible objetivo de contrarrestar la EHNA. Estos hallazgos
han sido confirmados en humanos also.31 Recientemente, hemos
demostr que el estrs oxidativo generado NOX2-es
asociada con la gravedad de la esteatosis heptica en la ecografa
pacientes con NAFLD.31 apoya el presente estudio y
se extiende el presente informe anterior, mostrando que es NOX2
aumentada en los pacientes con EHNA confirmado por biopsia, lo que sugiere
un papel potencial de la NADPH oxidasa generados
estrs oxidativo en la induccin de la fibrosis heptica.
Otra novedad interesante de este estudio es el anlisis
de los niveles de eicosanoides por determinacin isoprostane suero
en la EHNA. El aumento de la peroxidacin de lpidos, generada por
estrs oxidativo, est implicada en la patognesis de la
Hgado graso no alcohlico y la hepatitis crnica C.32 Los pacientes con EHNA
tener mayores isoprostanos en suero en comparacin con los controles.
Nuestros datos estn de acuerdo con un estudio en animales, realizados
en ratones con NASH, que mostraron altos niveles de
isoprostanos en este setting.33 Hasta ahora, ningn estudio en seres humanos
ha analizado los niveles de isoprostanos en la EHNA; previamente, el
papel de isoprostano suero se investig en hgado graso no alcohlico, una
amplio espectro de diseases.31 hgado, 32
Orientacin de NOX2 puede ser, por lo tanto, una nueva herramienta para
retardar la progresin de la enfermedad heptica. Por lo tanto, la modulacin de
estrs oxidativo con antioxidantes ha sido propuesta como
nuevo tratamiento para la NASH.13 En un estudio aleatorizado reciente
ensayo controlado, la terapia con vitamina E, en comparacin con
placebo, se asoci con una tasa significativamente mayor de
mejora histolgica en pacientes no diabticos EHNA
pacientes.13
Los polifenoles son una clase de naturales, sintticas y
sustancias semisintticos que se caracterizan por la presencia de

grandes mltiplos de fenol units.34 de cacao es una polyphenolrich

nutritivo. Polifenoles contenidos en el chocolate negro
(Especialmente catequina y epicatequina), reducir oxidativo
el estrs, mejorar la funcin endotelial, inhibir plaquetas
agregacin y modular los procesos fundamentales de la inflamacin,
neurotransmisin y cytotoxicity.34 Adems,
los polifenoles del cacao ejercen efectos beneficiosos para la salud mejora
sensibilidad a la insulina, pressure35 arterial y el colesterol
los niveles.
la suplementacin de cacao se ha encontrado que tienen un efecto beneficioso
efecto en un modelo de rata de la esteatohepatitis alcohlico
la reduccin de la acumulacin de grasa heptica, inflamacin y
necrosis.22 Un estudio en animales mostr adems que el cacao
suplementacin se asoci con atenuacin de
inflamacin y fibrosis cambios, por reduccin de
actividad de la oxidasa NADPH, en un modelo de rata de NASH.23
Recientemente, hemos demostrado que el chocolate negro reduce
el estrs oxidativo generado por NOX2.20, 21, 36 Por lo tanto, en
la segunda fase del estudio, se evalu el efecto de
polifenoles en los pacientes con EHNA. En particular, se evaluaron
el efecto de los polifenoles contenidos en el chocolate sobre
actividad NOX2, isoprostanes suero y los marcadores de hgado
daos (transaminasas, CK-18). Curiosamente, despus de
2 semanas de suplementacin chocolate negro, que encontraron una
reduccin significativa de isoprostanos en suero y en
niveles sNOX2-DP, lo que sugiere una reduccin de NOX-2 generan
estrs oxidativo. Adems, los hepatocitos apoptosis,
evaluado por 18 los niveles de CK en suero, la mejora en la oscuridad
de chocolate. Una reduccin de las transaminasas (significativamente
peralte para ALT, pero no para AST) tambin fue observada; sin embargo,
los datos merecen estudios posteriores con un ms largo
seguimiento para evaluar el efecto del chocolate oscuro en el hgado
daar. No modificacin significativa de colesterol, el ayuno
de glucosa en sangre y la insulina se encontr despus de 2 semanas de
la ingestin de chocolate. Esto est de acuerdo con otra
Los estudios que evaluaron el efecto de chocolate para
2 weeks.37, 38
Este estudio tiene implicaciones y limitaciones. Nosotros
reconoce que a pesar de que un estudio previo mostr
que la puntuacin Hamaguchi tena 100% de especificidad y sensibilidad del
91,7%, en comparacin con la biopsia heptica de hgado graso no alcohlico
pacientes, 39 es posible que algunos de los sujetos de control
podra haber tenido hgado graso no alcohlico.
Los datos globales apoyan el papel de la administracin de suplementos
nutracuticos
para el tratamiento de NASH, especialmente
los que tienen antioxidantes y polifenoles. En particular,

sugerimos que los polifenoles contenidos en el cacao

podra ser potencialmente til para reducir el estrs oxidativo en
NASH, aunque los resultados no pueden ser transferidos a clnica
la prctica debido al tamao pequeo de la muestra. Promover
estudio, de hecho, deben llevarse a cabo para evaluar si
cambios similares pueden ser detectados con oscuro largo plazo
administracin chocolate. Otra limitacin es la nica ciego
diseo de nuestro ensayo y la falta de un placebo
grupo.
En conclusin, el chocolate negro ejerce un antioxidante
a travs de la actividad NOX2 regulacin a la baja en los pacientes con EHNA.
Los estudios futuros deben abordar el papel de los polifenoles de
contrarrestar la progresin de NASH.
INFORMACIN DE SOPORTE
Informacin de apoyo adicional se puede encontrar en el
versin en lnea de este artculo:
Tabla S1. Los niveles basales de AST, ALT, total srico
y polifenoles y metabolito epicatequina en el grupo
de los pacientes asignados a chocolate con leche.
PATERNIDAD LITERARIA
Garante del artculo: Lorenzo Loffredo.
Contribuciones de los autores: Ludovica Perri, Roberto Carnevale, Cristina
Nocella, Elisa Catasca, Francesco Baratta, Fabricio Ceci, Licia Polimeni,
Paolo Gozzo recogidos y analizados los datos. Lorenzo Loffredo,
Maria Del Ben, Francesco Violi y Francesco Angelico
diseado el estudio de investigacin y escribi el documento. todos los autores
aprobado la versin final del artculo, incluidos los de la
Lista de autora.
EXPRESIONES DE GRATITUD
Declaracin de intereses personales: Ninguno.
Declaracin de intereses de financiacin: Este estudio fue apoyado por una beca
(C26A15CMXT) de la Universidad de Roma "La Sapienza"
(Ricerche Universitarie 2015) a LL