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TCNICAS CITOPATOLGICAS

Tracy L. Raber & Leigh Buckner, III


INTRODUO
Desde as ltimas dcadas a citologia vem se tornado amplamente aceita, sendo hoje um
componente integral da Patologia. rotineiramente praticada, mesmo nos pequenos laboratrios, onde
o citotecnologista e, ou citopatologista podem contar com o auxlio do laboratrio de histologia. Este
captulo pretende ser um guia introdutrio de tcnicas em citopatologia para histotecnologistas, e
outros tcnicos, que atuam como auxiliares num laboratrio de citologia. Assim, apresentamos uma
verso abreviada dos mtodos em citologia, no voltada diretamente para os citotecnologistas.
A citologia compreende o estudo da estrutura, funo, multiplicao, histria da vida, e
alteraes patolgicas das clulas. A citopatologia estuda as alteraes celulares na doena, sendo as
amostras citolgicas examinadas quanto aos detalhes nucleares e citoplasmticos celulares. As
alteraes nos padres celulares auxiliam na separao entre as clulas normais e anormais. Os
preparados citolgicos podem, contudo, ser diagnsticos finais ou auxiliar no diagnstico das doenas.
As amostras celulares podem ser coletadas de vrias maneiras. A pessoa que manipula os
espcimens citolgicos deve estar ciente de que o espcimen citolgico varia, dependendo do tipo do
mesmo e do mtodo de coleta. O material ginecolgico (esfregaos de Papanicolaou) e as aspiraes
por agulha fina so distendidos em lminas e fixados antes de chegarem no laboratrio de citologia.
So fixados com fixador de base alcolica, em spray, ou com etanol a 95%. Os espcimens aquosos,
ou com clulas esparsamente distribuidas, tais como a urina, o fluido crebroespinhal, e os lquidos das
cavidades corporais, devem ser colocados em filtros ou concentrados para se ter uma tima
amostragem celular. A citocentrifugao concentra as clulas em um sedimento (pellet) a partir do
qual esfregaos ou blocos celulares podem ser feitos. A citocentrifugao tambm pode concentrar as
clulas numa pequena rea da lmina de vidro na preparaes cytospin.
A rpida fixao e a tima preservao das clulas so de grande importncia para a
interpretao diagnstica do material. O fixador lquido mais comum, para os espcimens citolgicos,
o etanol a 95%. Os materiais fixados em etanol a 95% so corados pela tcnica de Papanicolaou
modificada. Os espcimens podem tambm ser fixados a seco (ao ar) e corados pelos mtodos DiffQuik ou de Romanovsky. Se fluidos forem coletados aps as horas de funcionamento do laboratrio,
eles devem ser colocados no refrigerador. Para auxiliar na preservao destes espcimens, etanol a
50% pode ser adicionado. Para evitar-se a formao de cogulo, a heparina deve ser acrescentada nos
espcimens hemorrgicos.

ROPHET, E. B.; MILLS, B.; ARRINGTON, J.B. & SOBIN, L.H., eds.- Armed Forces Institute of Pathology. Laboratory Methods
in Histotechnology. Washington, D.C., American Registry of Pathology, 1994.
1

FIXAO DOS ESFREGAOS


Os principais propsitos de um fixador citolgico so penetrar rapidamente nas clulas e a
manuteno da integridade morfolgica das mesmas. Hoje, o fixador usado mais comum o etanol a
95%, o qual pode ser substituido por outros lcoois que do resultados equivalentes, como o metanol a
100%, lcool desnaturado a 95%, isopropanol a 80%, e vrios fixadores em spray disponveis
comercialmente. A fixao imediata, enquanto o espcimen ainda est mido, essencial para uma
tima preservao, pois mesmo uma mnima dessecao ao ar, de uma amostra, ir alterar os aspectos
celulares. O tempo de fixao mnimo de 15 minutos, porm uma fixao prolongada, de vrios dias,
no alterar a aparncia do esfregao.
Os fixadores em spray consistem de uma base alcolica e de uma substncia cercea que cobre
a lmina. Uma pequena quantidade de cra, tal como Carbowax (polietilenoglicol) acrescentada ao
fixador alcolico para prover uma cobertura protetora e evitar artefato por dessecao ao ar. Este deve
ser removido antes da colorao. Dois banhos em etanol a 95%, de 10 a 15 minutos cada, so,
usualmente, o suficiente para remover a substncia cercea. O carbowax acrescentado ao fixador de
Saccomanno, de modo que as preparaes de Saccomanno tambm devem passar pelo etanol a 95%,
por 10 a 20 minutos, antes do processamento atravs das coloraes.
Os espcimens no-fixados, para serem processados mais tarde, podem ter etanol a 50%
adicionado amostra, como preservativo, ou este pode ser usado como um fluido de coleta. Os
espcimens deixados para o processamento no dia seguinte devem ser coletados em etanol a 50% e
mantidos no refrigerador durante a noite. Concentraes maiores que 50% da soluo prfixadoraendurecem a amostra e dificultam a realizao de esfregaos. A heparina deve ser adicionada
s amostras sanguinolentas para prevenir a formao de cogulo.
As amostras citolgicas fixadas, como de regra, so coradas pelo mtodo de Papanicolaou.
Os blocos celulares so fixados em formalina, e as seces coradas pelo mtodo da hematoxilina e
eosina, ou outras coloraes especiais, que possam auxiliar no diagnstico. Algumas preparaes
citolgicas so, por escolha, deixadas secar ao ar e no fixadas. Tais preparaes so, a seguir, coradas
pelo mtodo de Romanovsky, que contm metanol. A colorao, em si, age como um fixador.

MIKEL, U.V., ed. - Armed Forces Institute of Pathology. Advanced Laboratory Methods in Histology and Pathology.

Washington, D.C., American Registry of Pathology, 1994.

PREPARO DE LMINAS COM AMOSTRAS CITOLGICAS


As amostras ginecolgicas (esfregaos de Papanicolaou), e as obtidas por aspirao com
agulha fina, chegam ao laboratrio j fixadas e prontas para serem coradas. Outras amostras, algumas
das quais coletadas em fluido preservativo, usualmente o etanol a 50%, so preparadas no laboratrio.
O mtodo de preparao depende do tipo e da quantidade da amostra. As amostras esparsamente
celulares podem ser processadas em filtros ou colocadas na lmina com uma citocentrfuga, a qual
concentra as clulas numa rea muito pequena (cytospins). O mtodo de preparao celular preferido,
entretanto, o esfregao direto da amostra sobre uma lmina de vidro. As amostras escassas podem ser
concentradas por centrifugao e, a seguir, serem feitos os esfregaos nas lminas. O material de sobra
pode fornecer blocos celulares. As seces dos blocos celulares podem ser coradas por tcnicas
especiais, importantes auxiliares no diagnstico.

BIOSSEGURANA:

importante ter cincia de que os espcimens frescos, no-fixados,


podem ser infecciosos. Sempre use um jaleco e luvas, e manipule as amostras com cuidado,
preferencialmente em uma capela com fluxo laminar. Esfregue, no lado de fora do frasco do
espcimen, soluo de isopropanol a 70% ou de Clorox a 10% [soluo aquosa de hipoclorito de
sdio a 10%]. Descontamine todos os equipamentos usados no preparo das amostras, tais como
microscpio, centrfuga, misturadores Vortex, esfregando neles lcool ou soluo de Clorox.

MIKEL, U.V., ed. - Armed Forces Institute of Pathology. Advanced Laboratory Methods in Histology and Pathology.

Washington, D.C., American Registry of Pathology, 1994.

FILTROS DE MEMBRANA
PRINCPIOS
As preparaes com filtro so usadas no processamento de espcimens esparsamente celulares,
e servem como substitutos da citocentrifugao (cytospin). Os fluidos crebroespinhais, a urina, os
lavados brnquicos e os transudatos so espcimens que se encaixam bem neste tipo de
processamento. Para se determinar a celularidade de uma amostra executa-se o teste com o azul de
toluidina. Para os espcimens esparsamente celulares ou de pequeno volume, os filtros oferecem a
potencialidade de se recuperar todas as clulas. O processamento com filtros o mesmo para todos os
espcimens, devendo as suas diretrizes serem seguidas fielmente, ou as preparaes resultantes sero
insatisfatrias. Trs tipos de filtros (discutidos abaixo) podem ser usados nas preparaes citolgicas.
MATERIAIS E SOLUES
Filtro
Suporte do filtro
Grampos para filtro
Pinas para filtro
Seringas descartveis de 10 mililitros
Lminas de vidro
Etanol a 95%
Mtodo de colorao de Papanicolaou
PROCEDIMENTO
Figuras 1 e 2, no final do captulo de tcnicas citopatolgicas.
1. Remova o filtro da caixa usando uma pina e coloque-o no suporte.
2. Expanda o filtro injetando no suporte vrias gotas de etanol a 95%.
3. Injete o espcimen dentro do suporte usando uma seringa de 10 mililitros.
4. Adicione 1 mililitro de etanol a 95% usando a seringa de 10 mililitros.
5. Remova o filtro do suporte, utilizando uma pina, e corte-o para caber na lmina. (Se
utilizar um filtro grande corte-o em duas metades e use duas lminas).
6. Prenda, com um grampo, cada metade do filtro em uma lmina, e mergulhe as lminas
em uma jarra de colorao contendo etanol a 95%.
7. Core pelo mtodo de Papanicolaou (veja adiante).
8. Monte em lminas de vidro, com meio resinoso, mantendo as clulas voltadas para cima,
e tomando o cuidado de no deixar bolhas entre a lmina, o filtro e a lamnula.
OBSERVAES:
H trs tipos de filtro que podem ser usados na preparao de espcimens citolgicos, a saber,
Millipore, Gelman, e Nucleopore. A principal diferena entre eles o tipo de material de que so feitos
e o tamanho dos seus poros. Todos os trs requerem um mtodo de colorao de Papanicolaou
modificado.
Os filtros Millipore so filtros plsticos, contendo steres mistos de celulose, e poros grandes. Tais
filtros devem ser expandidos com etanol a 95%, para que no se retraiam, quando expostos aos
espcimens citolgicos. Durante a colorao, os tempos suficientes nas solues corantes, associados
com os enxgues em etanol, permitem que os corantes sejam absorvidos pelas clulas e no pelo filtro
em si. Precaues especiais devem ser tomadas durante a montagem da lmina com os filtros
Millipore. Eles se tornam transparentes somente quando montados em um meio com ndice de
refrao semelhante ao dos filtros. Um meio de montagem usual o Permount (Fisher Scientific).
Uma quantidade apropriada de meio de montagem deve ser usada, pois o xileno no se mantm nos
poros do filtro e, ao evaporar-se aps alguns dias, levar dessecao do filtro, apesar deste estar

MIKEL, U.V., ed. - Armed Forces Institute of Pathology. Advanced Laboratory Methods in Histology and Pathology.

Washington, D.C., American Registry of Pathology, 1994.

coberto com a lamnula. Entretanto, muito meio de montagem pode dificultar o exame microscpico
em grande aumento, a seco.
Os filtros Gelman tm propriedades fsicas e pticas semelhantes s dos filtros Millipore, e so
feitos de triacetato de celulose, um polmero mais resistente ao etanol. Em comparao com os filtros
Millipore, expandem-se menos quando expostos ao etanol. A captura de corante por este filtro
marcantemente reduzida, o que permite as clulas coradas sobressarem-se em relao com o fundo da
lmina. Os filtros Gelman tm um ndice de refrao de 1,47 a 1,48 e, para uma boa imagem
microscpica, eles precisam ser montados em um meio com ndice de refrao igual ou semelhante ao
deles. O meio Permount (Fisher Scientific) pode ser usado.
Os filtros Nucleopore so feitos de policarbonato, o qual no afetado pela maioria dos solventes.
Por isso, no necessrio pr-expandi-los com etanol a 95%. Eles no se coram e, desse modo, do
um fundo claro lmina; entretanto, eles tm dois ndices de refrao e so birrefringentes, tornando
impossvel eliminar a imagem dos poros com o meio de montagem. Deve-se tambm chamar a ateno
que se eles forem expostos ao xileno por mais de 15 minutos, eles ficaro ondulados. Isto tornar
difcil a montagem com lamnula e o exame ao microscpio. Os filtros Nucleopore, entretanto, podem
ser dissolvidos em clorofrmio ou em cloreto de etileno, o que elimina a ondulao e a imagem
distorcida dos poros. Contudo, a eliminao do filtro quimicamente pode produzir vrios artefatos, que
podem causar problemas na avaliao do espcimen.

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Washington, D.C., American Registry of Pathology, 1994.

TESTE COM O AZUL DE TOLUIDINA


PRINCPIOS
Os espcimens celulares, no-ginecolgicos, (i.., fluidos de cavidades corporais) tm um alto
potencial de contaminao cruzada e devem ser corados separadamente (regulao CLIA - 88). Para
determinar a celularidade de uma amostra o teste do azul de toluidina deve ser feito. As amostras
celulares coradas pelo azul de toluidina mostram claramente se o espcimen contm grande nmero de
clulas e de grupamentos celulares. Os grupamentos celulares indicam que o fluido anormal e que
deve ser processado separadamente.
MATERIAIS E SOLUES
Azul de toluidina (C.I. 52040).....................................0,5 grama.
Etanol a 95% ............................................................20 mililitros.
gua destilada .........................................................80 mililitros.
Dissolva o azul de toluidina no etanol. Acrescente gua destilada at o volume final de
100 mililitros. Filtre antes de usar.
PROCEDIMENTO
1. Coloque uma gota de azul de toluidina sobre uma lmina limpa.
2. Coloque uma gota do fluido da amostra prximo ao corante, e deixe o contato se fazer.
3. Coloque uma pequena lamnula sobre o espcimen.
4. Avalie a celularidade da amostra sob o microscpio.
5. Processe, separadamente, as amostras com elevada celularidade e muitos grupamentos de
clulas. A figura 3, ao final do captulo de tcnicas citopatolgicas, ilustra uma amostra
com grupamentos de clulas.

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Washington, D.C., American Registry of Pathology, 1994.

ESFREGAOS DIRETOS
PRINCPIOS
O esfregao direto da amostra de clulas sobre a lmina o mtodo preferido no
processamento citolgico. Os espcimens ricos em clulas so usados diretamente e os espcimens
menos celulares so concentrados atravs de centrifugao. Os escarros, preparados de acordo com o
mtodo de Saccomanno, so pr-fixados, misturados por meio de um misturador, e concentrados por
centrifugao, antes de serem feitos os esfregaos sobre as lminas. Os esfregaos diretos so
preparados usando-se o mtodo da trao de duas lminas. Duas gotas da amostra so colocados
sobre uma lmina e, sobre esta, colocada uma segunda lmina, sendo as duas gentilmente
tracionadas em sentido opostos de modo que, ao final, haver dois esfregaos.
MATERIAIS E SOLUES
Centrfuga
Tubos de 50 mililitros para centrfuga
Misturador Vortex
Pipetas de vidro
Etanol a 50%
Lminas de vidro cobertas com poli-L-lisina.
PROCEDIMENTO
Figuras 4 e 5, ao final do captulo de tcnicas citopatolgicas.
1. Concentre o espcime atravs de centrifugao, se necessrio.
2. Decante a maior parte do sobrenadante e redissolva o sedimento misturando-o com o
Vortex, por poucos segundos.
3. Transfira, com uma pipeta de vidro, uma pequena quantidade do sedimento para o
centro de uma lmina de vidro, coberta previamente com poli-L-lisina. Coloque uma
outra lmina sobre o sedimento e, gentilmente, movimente as lminas para frente e para
trs, de modo a dispersar as clulas em uma fina camada. A seguir, separe as lminas,
uma da outra, rapidamente.
4. Imerja as lminas em etanol a 95% para a colorao pelo mtodo de Papanicolaou, ou
deixe-as secar ao ar para serem coradas pelo mtodo Diff-Quik.
OBSERVAES:
Os escarros, os fluidos cavitrios corporais, e os aspirados por agulha fina so os tipos de
espcimens, a partir dos quais, podem ser feitos esfregaos diretos.
Faa uma soluo de 50 microgramas/mililitro de poli-L-lisina em gua desionizada,
autoclavada (esta soluo pode ser utilizada por at 1 ms, se mantida a 4oC). Sobre cada lmina
coloque, aproximadamente, 1 mililitro de soluo de poli-L-lisina, e distribua uniformemente em
cada uma das superfcies. Deixe as lminas em repouso, temperatura ambiente, por 30 minutos.
Escorra o excesso da soluo de poli-L-lisina e enxgue as lminas, 3 vezes, em gua desionizada.
Deixe as lminas secarem (as lminas secas podem ser armazenadas por 1 semana temperatura
ambiente).

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Washington, D.C., American Registry of Pathology, 1994.

MTODO DE SACCOMANNO PARA O PREPARO DE ESCARRO


PRINCPIOS
A tcnica de Saccomanno um mtodo alternativo para o processamento de escarro. Esta
tcnica remove os restos celulares (debris) e o material mucide, que podem esconder as clulas
diagnsticas.
MATERIAIS E SOLUES
Misturador pequeno
Centrfuga
Tubos de 50 mililitros para centrfuga
Misturador Vortex
Pipetas
Lminas de vidro cobertas com poli-L-lisina (veja acima).
Fixador de Saccomanno
Etanol a 95% ..............................................1.900 mililitros.
gua destilada ............................................2.100 mililitros.
Carbowax (1540) (DuPont)...............................92 gramas.
[N. do T.: Carbowax = poli(glicol etilnico) ou polietilenoglicol]

Misture a gua destilada e o etanol em um recipiente de 4 litros. Derreta o Carbowax


em banho-maria a 37oC. Adicione o Carbowax derretido soluo no recipiente e agite
por 30 segundos.
PROCEDIMENTO
1. Adicione o fixador de Saccomanno ao escarro, e despeje num recipiente de 250
mililitros de um misturador semi-micro. O volume total do fixador com o
espcimen deve ser em torno de 100 mililitros. (Se o espcimen for escasso
acrescente fixador at o volume de 30 mililitros).
2. Misture tudo em baixa velocidade por 2 segundos e em alta velocidade por 5 a 30
segundos. Macroscopicamente os filamentos finos do material no devem ser
visveis. Se forem visveis, misture novamente por mais 15 a 20 segundos ou at
que os filamentos desapaream.
3. Divida a suspenso entre dois tubos de centrfuga, de modo equilibrado.
4. Centrifugue o espcimen, por 5 minutos, a 1.500 rotaes por minuto (rpm).
5. Decante o sobrenadante at que 2 a 3 mililitros cubram o concentrado celular.
6. Redissolva o concentrado de clulas por agitao em um misturador Vortex.
7. Aspire com uma pipeta cerca de 1 mililitro da suspenso. Adicione duas gotas sobre
uma lmina previamente coberta com poli-L-lisina. Para os espcimens pouco
celulares adicione 3 a 4 gotas ou mais, se necessrio.
8. Faa os esfregaos segundo o mtodo de esfregaos diretos.
9. Deixe as lminas, com a superfcie com o material voltada para cima, secar ao ar.
10. Imerja as lminas, secas ao ar, em etanol a 95%, e deixe por 10 minutos para
remover o Carbowax precipitado.
NOTA:
O esfregao direto de escarro feito com o espcimen fresco, enquanto o mtodo de Saccomanno
permite que a amostra fique no refrigerador para ser processada no dia seguinte. O fixador de
Saccomanno contm Carbowax, o qual deve ser removido antes da colorao.

MIKEL, U.V., ed. - Armed Forces Institute of Pathology. Advanced Laboratory Methods in Histology and Pathology.

Washington, D.C., American Registry of Pathology, 1994.

REFERNCIA
GILL, G. & PLOWDEN, K.- Laboratory Cytopathology: Techniques for Specimen Preparation.
Baltimore, Md, Johns Hopkins University Press, 1984.

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PREPARO DE BLOCO CELULAR


PRINCPIOS
O bloco celular um procedimento auxiliar na avaliao diagnstica citolgica. Pode ser
preparado a partir de fluidos, lavados, escovados, ou aspirados por agulha. A vantagem do bloco
celular a captura de qualquer tecido que possa estar presente no espcimen, permitindo, assim, a
observao de alguma arquitetura tecidual. O bloco celular permite tambm a realizao de cortes
adicionais, para estudo com coloraes especiais, teis no auxlio diagnstico de um caso.
MATERIAIS E SOLUES
Centrfuga
Tubos de 10 mililitros para centrfuga
Soluo aquosa de gelatina a 2% derretida, dentro de um tubo de ensaio de vidro, mantido em
gua fervendo.
Pipeta de vidro aquecida para transferncia da gelatina.
Formalina a 10%, neutra, tamponada.
Etanol
Xileno
Parafina
PROCEDIMENTO
1. Centrifugue o espcimen at formar o sedimento.
2. Decante o sobrenadante.
3. Acrescente cerca de 0,25 mililitros de soluo aquosa de gelatina a 2%, quente,
cuidadosamente, e com o auxlio de um basto ou esptula levante o sedimento de modo
que a gelatina flua sob o mesmo.
4. Coloque o tubo de ensaio no gelo para solidificar rapidamente a gelatina.
5. Remova o boto de gelatina com o basto ou a esptula e coloque-o na formalina.
6. Deixe fixar por pelo menos 1 hora.
7. Processe como um tecido, emblocando em parafina.
OBSERVAES:
Alguns espcimens celulares, e.g., fluidos de cavidades corporais, contm sangue e podero
coagular na ausncia de heparina. Assim, o material diagnstico ficar entremeado na rede de fibrina e
no disponvel para a avaliao. Entretanto, tais cogulos podem ser envolvidos em papel de filtro,
fixados em formalina, e processados como tecido. Nestes casos, no necessrio concentrar a amostra,
por meio de centrifugao, e embloc-la em gelatina.

REFERNCIA
GILL, G. & PLOWDEN, K.- Laboratory Cytopathology: Techniques for Specimen Preparation.
Baltimore, Md, Johns Hopkins University Press, 1984.

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PREPARAO DE CITOCENTRIFUGADO (CYTOSPIN)


PRINCPIOS
Para os espcimens paucicelulares ou em pequeno volume, tais como o lquido cfalorraquidiano ou os transudatos, a centrifugao das amostras para uma lmina de vidro (cytospins),
atravs de uma citocentrfuga, permite a captura de uma concentrao maior de clulas para uma
pequena rea circular da lmina. O cytospin elimina a maior parte dos restos proteinceos (debris),
deixando um fundo limpo na lmina. Os fabricantes deste tipo de equipamento fornecem as
informaes, quanto aos materiais e as solues necessrias, e de como operar o equipamento.
MATERIAIS E SOLUES
Hemacitmetro
Centrfuga Cytospin (Shandon Cytospin 2, Shandon Inc., Pittsburgh, PA)
Cmaras Cytospin (citofunis para a colocao das amostras)
Citoclipes Cytospin (prendedores de ao para lminas)
Filtros-almofadas Cytospin (cartes de filtro)
Lminas de vidro cobertas com poli-L-lisina (veja anteriormente), ou lmina comuns se a poliL-lisina no estiver disponvel.
Fixador Cytospin ou fixador de Saccomanno
Etanol a 95%
Pipetas
PROCEDIMENTO
1. Conte as clulas do espcimen com o hemacitmetro, no microscpio, ou use uma
quantidade aproximada (veja as observaes abaixo).
2. Dilua as amostras, ricas em clulas, at 2 x 106 clulas/mililitro, e concentre as amostras
paucicelulares, por meio de centrifugao, at o nmero de clulas citado, se possvel.
3. Coloque um filtro-almofada (carto de filtro) entre uma das lminas (cobertas com poliL-lisina) e cada uma das cmaras Cytospin (citofunis), mantendo o lado espesso do filtro
no-justaposto lmina, e o conjunto preso com um citoclipe. O orifcio no filtroalmofada (carto de filtro) deve ficar na poro mais baixa da cmara (citofunil).
4. Coloque as cmaras (citofunis) dentro da centrfuga Cytospin.
5. Coloque algumas gotas de etanol a 95%, no poo da cmara (citofunil), para expandir o
filtro.
6. Coloque 3 gotas da amostra (ou mais se a amostra for paucicelular) na poro horizontal
do reservatrio (citofunil) e, a seguir, vrias gotas do fixador Cytospin.
7. Cubra o reservatrio (citofunil) de modo que nenhum espcimen se perca.
8. Coloque a tampa sobre o cytospin (cabeote com 12 posies) e feche a centrfuga.
9. Programe a velocidade (1.500 rpm) e o tempo (2 minutos).
10. Centrifugue.
11. Deixe a centrfuga parar antes de abri-la.
OBSERVAES:
Este procedimento o recomendado para a Shandon Cytospin 2, Shandon Inc., Pittsburgh, PA,
e pode ter que ser modificado no uso de outras citocentrfugas.
O nmero de gotas de clulas, a ser usado, pode tambm ser determinado colocando-se uma
gota da suspenso celular sobre uma lmina de vidro e coberta com uma lamnula. A lmina , ento,
observada ao microscpio, de modo a se ter uma avaliao aproximada do nmero de clulas por
campo, com a objetiva de 40x. O nmero aproximado de clulas contadas , ento, dividido por 60,
cujo resultado inteiro ser o nmero de gotas a ser usado em cada lmina. Por exemplo, se a contagem
celular for 20, o nmero de gotas ser 3. Quando a observao com a objetiva de 10x revelar quase
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nenhuma clula, use 20 gotas. Poucas gotas de saponina podem ser adicionadas, antes de se colocar o
fixador Cytospin, se o espcimen for sanguinolento. A saponina lisa as hemcias, pois as mesmas so
como um artefato que dificulta a observao das clulas diagnsticas.
Deve-se lembrar que j existem equipamentos disponveis para o preparo citolgico, em
monocamadas finas, sobre lminas de vidro. Tais equipamentos variam desde simples e baratos at os
mais complexos e caros.

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PROCEDIMENTOS DE COLORAO
O mtodo de colorao mais comumente usado nos preparados citolgicos o de
Papanicolaou. Modificaes desta tcnica variam de um laboratrio para outro. aconselhvel a
padronizao deste mtodo, de modo que sejam obtidos resultados satisfatrios. As preparaes secas
ao ar so coradas pelo mtodo de Romanovsky e, usualmente, pelos mtodos Diff-Quick ou de Giemsa.
O uso de outros mtodos de colorao, na rotina do diagnstico citolgico, tem sido limitado. As
coloraes especiais, rotineiramente utilizadas na maioria dos laboratrios histolgicos, so algumas
vezes aplicadas. Ns utilizamos como referncia, para tais tcnicas, o AFIP`s Laboratory Methods in
Histotechnology.

COLORAO DE PAPANICOLAOU
PRINCPIOS
O procedimento de colorao de Papanicolaou foi desenvolvido para uma tima visualizao
das clulas cancerosas esfoliadas das superfcies epiteliais do corpo. uma reao de colorao
policromtica, consistindo de um corante nuclear de base aquosa e de dois contracorantes
citoplasmticos de base alcolica, cujo objetivo mostrar as muitas variaes na morfologia celular e
os graus de maturidade e de atividade metablica celular. Este mtodo no especfico para qualquer
substncia encontrada no cncer.

SOLUES
Hematoxilina
gua destilada .............................................................730 mililitros.
Etileno glicol ...............................................................250 mililitros.
Hematoxilina de Gill II (Lerner, Pittsburgh, PA) ............2 gramas.
Iodato de sdio .................................................................0,2 grama.
Sulfato de alumnio .......................................................17,6 gramas.
cido actico glacial .....................................................20 mililitros.

[N. do T.: A hematoxilina de Gill II pode ser substituida pela hematoxilina, cristais (C.I.: 75290)]
Misture os ingredientes, na sequncia, utilizando uma barra magntica, por 1 hora
temperatura ambiente. O corante pode ser usado imediatamente, porm filtre antes de
cada uso. A hematoxilina empregada nesta frmula a anidra. Se for utilizada a forma
da hematoxilina em cristais, use 2,36 gramas. Um grama de cido ctrico pode ser
substituido por 20 mililitros de cido actico glacial.
Banho de cido clordrico (usado somente para os filtros)
gua destilada........................................................1.000 mililitros.
cido clordrico, concentrado ......................................2 mililitros.
(Prepare fresco em cada dia)

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Washington, D.C., American Registry of Pathology, 1994.

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Hidrxido de amnio (banho azulador)


gua destilada..........................................................1.000 mililitros.
NH4OH, concentrado .......................................................1 mililitro.
(Prepare fresco em cada dia)
Corante Orange G
Soluo-estoque: Orange G a 10%
Orange G (Lerner) (C.I.16230).......................................10 gramas.
gua destilada.....................................at completar 100 mililitros.
(Quando estiver preparando a soluo-estoque leve em considerao a pureza do
corante. Exemplo: Se a pureza for de 80%, use 12,5 gramas).
Soluo de trabalho:
Soluo estoque ..........................................................20 mililitros.
cido fosfotngstico ....................................................0,15 grama.
Etanol a 95% ............................................................980 mililitros.
Corante Eosina-65
Solues-estoque:
Eosina Y a 20%
Eosina Y, aquosa (Lerner) (C.I. 45380)........................20 gramas.
gua destilada, 70o a 80oC................at completar 100 mililitros.

Verde Claro (Light-Green SF) a 3%


Light-Green SF (Lerner) (C.I. 42095)............................3 gramas.
gua destilada, 70o a 80oC...............at completar 100 mililitros.
As solues podem ser usadas imediatamente, porm filtre-as antes de cada uso.
Leve em considerao a concentrao (pureza) do corante, quando for preparar as
solues-estoques.
Soluo de trabalho: EA-65
Soluo-estoque de eosina Y..................................20 mililitros.
Soluo-estoque de Light-Green SF......................10 mililitros.
cido fosfotngstico...................................................2 gramas.
Etanol a 95%.......................................................700 mililitros.
Metanol absoluto................................................250 mililitros.
cido actico glacial............................................20 mililitros.

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Etanol: 95%, 100%


Xileno (xilol)
Meio de montagem

PROCEDIMENTO
1.

Etanol a 95%...........................................10 gotas (veja as notas abaixo).

2.

Etanol a 95%..............................................................................10 gotas.

3.

gua destilada/desionizada....................10 gotas (veja as notas abaixo).

4.

gua destilada/desionizada........................................................10 gotas.

5.

Hematoxilina...........................................................................3 minutos.

6.

gua destilada/desionizada .......................................................20 gotas.

7.

Banho azulador ..........................................................................20 gotas.

8.

gua destilada/desionizada........................................................20 gotas.

9.

Etanol a 95%..............................................................................10 gotas.

10.

Etanol a 95%..............................................................................10 gotas.

11.

Orange G, soluo de trabalho..................................................1 minuto.

12.

Etanol a 95%..............................................................................10 gotas.

13.

Etanol a 95%..............................................................................10 gotas.

14.

Etanol a 95%..............................................................................10 gotas.

15.

Eosina-EA65, soluo de trabalho..........................................5 minutos.

16.

Etanol a 95%.............................................................................10 gotas.

17.

Etanol a 95%.............................................................................10 gotas.

18.

Etanol a 95%.............................................................................10 gotas.

19.

Etanol a 100%...........................................................................10 gotas.

20.

Etanol a 100%...........................................................................10 gotas.

21.

Etanol a 100%...........................................................................10 gotas.

22.

Xileno.......................................................................................10 gotas.

23.

Xileno.......................................................................................10 gotas.

24.

Monte em meio resinoso.

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MTODO DE COLORAO DE PAPANICOLAOU PARA FILTROS


1.

Etanol a 95%.............................................................................10 gotas.

2.

gua destilada/desionizada.......................................................10 gotas.

3.

gua destilada/desionizada.......................................................10 gotas.

4.

Hematoxilina..........................................................................2 minutos.

5.

gua corrente de torneira..........................................................20 gotas.

6.

Banho cido, 1 gota/segundo por ............................................1 minuto.


(ou at que os filtros fiquem amarelo-plidos)

7.

gua destilada/desionizada......................................................20 gotas.

8.

Banho azulador......................................................................2 minutos.

9.

Etanol a 95%............................................................................10 gotas.

10.

Etanol a 95%............................................................................10 gotas.

11.

Orange G, soluo de trabalho..........................................10 segundos.


(no goteje nos filtros a partir deste ponto, deixe-os nas solues)

12.

Etanol a 95%..........................................................................1 minuto.

13.

Etanol a 95%..........................................................................1 minuto.

14.

Etanol a 95%..........................................................................1 minuto.

15.

Eosina-EA 65, soluo de trabalho......................................8 minutos.

16.

Etanol a 95%........................................................................4 minutos.

17.

Etanol a 95%........................................................................2 minutos.

18.

Etanol a 95%.........................................................................1 minuto.

19.

Etanol a 100%.......................................................................1 minuto.

20.

Etanol a 100%.......................................................................1 minuto.

21.

Etanol a 100%.......................................................................1 minuto.

22.

Xileno....................................................................................1 minuto.

23.

Xileno....................................................................................1 minuto.

24.

Monte em lmina de vidro com meio resinoso.

RESULTADOS
Veja as figuras 7 a 10, ao final do captulo de tcnicas citopatolgicas.
NOTAS:
Quando estiver seguindo o procedimento de Papanicolaou, observe que todos os esfregaos
que tenham sido fixados com spray e todas as preparaes de Saccomanno devem permanecer no

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etanol a 95%, por pelo menos 10 minutos, antes de se proceder a colorao. Pode-se usar gua
destilada ou desionizada.
Durante a colorao, um nmero substancial de clulas se solta das lminas ou dos filtros. No
incomum que tais clulas flutuantes se fixem em outro espcimen. Para evitar a ocorrncia de
contaminao cruzada, certas regras devem ser seguidas: Todas as solues devem ser filtradas
diariamente. Os casos menos propensos a soltar clulas devem ser corados primeiro, e aqueles que
mais facilmente soltam clulas devem ser corados por ltimo. A ordem de colorao das amostras noginecolgicas deve ser a seguinte: (1o) fluidos espinhais; (2o) esfregaos e citocentrifugados
(cytospins); e (3o) todos os filtros. Deve-se ter em mente, entretanto, que o problema do
desprendimento de clulas no pode ser totalmente eliminado.
Algumas ocorrncias que precedem a aplicao do meio de montagem na lmina podem
influenciar os resultados. Tais ocorrncias incluem a espessura do esfregao celular e a presena de
gua no etanol absoluto e no xileno. Para os esfregaos celulares espessos, ou para os filtros, uma
quantidade maior de meio de montagem deve ser utilizada. reas densas, como borres, das
preparaes, cobertas pelo meio de montagem, favorecem a produo de bolhas de ar e o aparecimento
de focos secos pelo ar, causando o artefato conhecido com flocos de milho (Figura 11). Se isto
ocorrer, retire a lamnula imergindo a lmina no xileno, e, a seguir, recoloque a lamnula. Outro
problema a transferncia de gua para o etanol absoluto e deste para o xileno, tornando-os
enevoados, esbranquiados. O resultado ser a m-desidratao e imagens pouco ntidas (Figura 12).
Se gua for notada no xileno, IMEDIATAMENTE, troque o xileno, assim como o etanol absoluto.
Acima de tudo, um preparado citolgico satisfatrio depende no somente da colorao, mas
tambm da coleta do espcimen, da sua preparao, e da sua fixao. Uma colorao perfeita no
melhorar as amostras paucicelulares, ou as amostras mal-fixadas com clulas degeneradas, ou as
amostras cujas clulas ficam obscurecidas por lagosde leuccitos polimorfonucleares (neutrfilos).
Tais preparaes podem ser consideradas insatisfatrias.

REFERNCIAS
GILL, G. & PLOWDEN, K.- Laboratory Cytopathology: Techniques for Specimen Preparation.
Baltimore, Md, Johns Hopkins University Press, 1984.
PROPHET, E. B.; MILLS, B.; ARRINGTON, J.B. & SOBIN, L.H., eds.-Armed Forces Institute of
Pathology. Laboratory Methods in Histotechnology. Washington, D.C., American Registry of
Pathology, 1992.

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Washington, D.C., American Registry of Pathology, 1994.

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CONTROLE DE QUALIDADE DO MTODO DE


COLORAO DE PAPANICOLAOU
A apreciao tcnica das lminas coradas feita para se determinar a tima qualidade da
colorao na avaliao citolgica. Um registro dirio da qualidade dos mtodos de colorao celular
deve ser mantido. Neste registro deve-se incluir a data e as observaes quanto a qualidade da
colorao ser ou no-aceitvel. As aes corretivas devem ser documentadas quando as coloraes
estiverem no-aceitveis.
As timas coloraes dependem da quantidade, da qualidade, e da tonalidade verdadeira dos
corantes. A hematoxilina, um corante nuclear, deve ser avermelhada, azul, azul-escura, ou prpuraescura. Uma cor castanha significa excessiva oxidao da hematoxilina o que, geralmente, d
resultados de colorao insatisfatrios. A hematoxilina no deve bloquear a captura ou adulterar a cor
dos contracorantes aplicados subsequentemente. Para a avaliao da qualidade da colorao nuclear, o
ncleo das clulas intermedirias deve ser observado. A cromatina dos mesmos deve ser granular,
ntida, distinta, e de cor prpura-clara. O ncleo dos neutrfilos deve tambm ser utilizado para a
avaliao da qualidade tintorial nuclear. Eles devem corar-se intensamente em azul-escuro a prpuraescuro e ter a cromatina com imagem bem ntida e distinta.
Os contracorantes Orange G e a Eosina-EA65 podem dar cores vvidas, transparncia
citoplasmtica e contracolorao diferenciada. Nas clulas preservadas de modo ideal, vrias cores
citoplasmticas diferentes so identificadas. A eosina Y d a cor rsea-avermelhada s clulas
escamosas maduras e cora o nuclolo em vermelho; o Verde Claro (Light-Green SF) cora em verdeazulado as clulas metabolicamente ativas; e o Orange G cora em laranja ou amarelo o citoplasma
queratinizado.
Fragmentos espessos de tecido ou clulas acumuladas em mltiplas camadas, algumas vezes
apresentam uma penetrao irregular do corante, resultando em cores que no so normalmente
esperadas. Sempre que for possvel, camadas mais finas de clulas so o desejvel. Deve-se ter
cuidado na avaliao da morfologia das clulas, evitando-se a apreciao superficial da colorao que,
eventualmente, pode levar a uma avaliao diagnstica errnea.

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DESCOLORAO DE LMINAS
PRINCPIOS
Ocasionalmente pode ser necessrio descorar uma lmina de citologia, seja para recolorir pelo
mtodo de Papanicolaou, seja para requerer uma colorao especial, que pode auxiliar no diagnstico.

MATERIAIS E SOLUES
Jarras de colorao
Xileno
Etanol a 100%
lcool-cido (HCl a 1% em etanol a 70%)
Banho azulador
Etanol a 95%

PROCEDIMENTO
1. Coloque a lmina na jarra de colorao contendo xileno e deixe a lamnula se destacar
espontaneamente; no a puxe. As lminas que esto montadas h muito tempo podem
necessitar de vrios dias para que a lamnula se solte.
2. Remova todos os traos do meio de montagem mergulhando a lmina em xileno, fazendo
2 trocas de 1 minuto cada.
3. Coloque a lmina em etanol a 100%, fazendo 2 trocas de 1 minuto cada.
4. Coloque a lmina no lcool-cido at que a descolorao se complete. O tempo variar
nesta etapa.
5. Mergulhe a lmina no banho azulador de deixe por 3 ou 4 minutos.
6. Enxgue em gua de torneira, fazendo 2 trocas.
7. Coloque a lmina na jarra de colorao contendo etanol a 95%. A lmina est agora pronta
para ser recolorida pelo mtodo de Papanicolaou ou por uma colorao especial.

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MTODO DO CORANTE DIFF-QUIK


PRINCPIOS
Este corante comprado comercialmente e um corante de Wright-Giemsa modificado. Foi
originalmente idealizado para ser um mtodo de colorao rpido para os esfregaos sanguneos,
porm tambm tem sido um corante de grande valor na avaliao de material citolgico seco ao ar.
SOLUES
Fixador de Diff-Quik
Soluo I de Diff-Quik
Soluo II de Diff-Quik
PROCEDIMENTO
1. Fixador de Diff-Quik...................................................5 gotas.
2. Soluo I de Diff-Quik.........................................8 a 10 gotas.
3. Soluo II de Diff-Quik.......................................8 a 10 gotas.
4. gua corrente de torneira....................................8 a 10 gotas.
5. Seque ao ar a lmina corada.
6. Xileno.........................................................................5 gotas.
7. Montar em meio resinoso.
Recolorir as lminas coradas pelo mtodo Diff-Quik pode ser feito com bons resultados, se
necessrio.
PROCEDIMENTO DE RECOLORAO
1. Coloque a lmina no xileno e gentilmente remova a lamnula, enquanto a mesma vai
soltando.
2. Imerja a lmina em xileno limpo para remover todo o meio de montagem.
3. Seque completamente a lmina ao ar.
4. Coloque a lmina no fixador de Diff-Quik e deixe por 45 minutos.
5. Recolore com as solues I e II acima especificadas.
RESULTADOS
Veja a Figura 13, ao final do captulo de tcnica citopatolgica.
OBSERVAO
Filtre a soluo II diariamente ou antes de cada uso. Complete ou troque os corantes
frequentemente. As lminas coradas no Diff-Quik NUNCA devem ser colocadas numa
superfcie quente para secar lminas. As lminas coradas pelo Diff-Quik podem ser recoradas
se o espcimen ficar hipercorado ou pouco corado.

REFERNCIA
GILL, G. & PLOWDEN, K.- Laboratory Cytopathology: Techniques for Specimen Preparation.
Baltimore, Md, Johns Hopkins University Press, 1984.

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MTODO DE COLORAO DE GIEMSA


PRINCPIO
Este mtodo uma colorao do tipo-Romanovsky em uma etapa, que requer fixao, com o
metanol, de esfregaos citolgicos secos ao ar.
SOLUO
Tampo fosfato 1/15M, pH 6,8
Soluo A:
Na 2HPO4.2H2O........................................................5,93 gramas.
gua destilada at o volume de...............................500 mililitros.
Soluo B:
KH2PO4.....................................................................4,53 gramas.
gua destilada at o volume de..............................500 mililitros.
Soluo tampo de trabalho, pH 6,8
Soluo A.................................................................50 mililitros.
Soluo B.................................................................50 mililitros.
gua destilada........................................................400 mililitros.
Ajuste o pH para 6,8 com a soluo A ou B.
Corante de Giemsa
Giemsa (Merck)........................................................10 mililitros.
Soluo tampo de trabalho.....................................90 mililitros.
Metanol
Xileno
Meio de montagem
PROCEDIMENTO
1. Fixe as lmina em metanol por 15 minutos.
2. Enxgue na soluo de trabalho de tampo, pH 6,8.
3. Core no corante de Giemsa por 20 minutos.
4. Enxgue em gua corrente de torneira at que a gua fique clara.
5. Deixe secar ao ar.
6. Clarifique no xileno por 5 minutos.
7. Monte em meio resinoso.
RESULTADOS
Veja a Figura 14, ao final do captulo de tcnica citopatolgica.
OBSERVAES
Dependendo do tipo de espcimen, diferentes tempos de colorao so aplicados. A maioria
dos tipos celulares corada em 20 minutos, porm os fluidos crebroespinhais levam apenas 5
minutos.
Os esfregaos devem estar bem secos ao ar, antes de serem fixados em metanol, pois a fixao
com o metanol de esfregaes incompletamente secos gera artefatos azuis no ncleo, que podem
mimetizar nuclolo aumentado.

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REFERNCIA
LOPES CARDOZO, P.- Atlas of Clinical Cytology. Netherlands, Publisher Targa, Hertogenbosch,
1976.
REFERNCIAS ADICIONAIS SELECIONADAS
BALES, C.E. & DURFEE, G.R.- Cytologic Techniques. In: KOSS, L.G.- Diagnostic Cytology and its
Histopathologic Basis. 4th ed., Philadelphia, Pa, JB Lippincott Company, 1992. pp.1452-1514.
KEEBLER, C.M.- Cytopreparatory Tecniques. In: BIBBO, M. ed.- Comprehensive Cytopathology.
Philadelphia, Pa, W.B. Saunders, 1991. pp. 881-906.

AGRADECIMENTOS: Os autores gostariam de agradecer ao Dr. James Ownbey pela tomada das
fotografias para as ilustraes.

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