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ROPHET, E. B.; MILLS, B.; ARRINGTON, J.B. & SOBIN, L.H., eds.- Armed Forces Institute of Pathology. Laboratory Methods
in Histotechnology. Washington, D.C., American Registry of Pathology, 1994.
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MIKEL, U.V., ed. - Armed Forces Institute of Pathology. Advanced Laboratory Methods in Histology and Pathology.
BIOSSEGURANA:
MIKEL, U.V., ed. - Armed Forces Institute of Pathology. Advanced Laboratory Methods in Histology and Pathology.
FILTROS DE MEMBRANA
PRINCPIOS
As preparaes com filtro so usadas no processamento de espcimens esparsamente celulares,
e servem como substitutos da citocentrifugao (cytospin). Os fluidos crebroespinhais, a urina, os
lavados brnquicos e os transudatos so espcimens que se encaixam bem neste tipo de
processamento. Para se determinar a celularidade de uma amostra executa-se o teste com o azul de
toluidina. Para os espcimens esparsamente celulares ou de pequeno volume, os filtros oferecem a
potencialidade de se recuperar todas as clulas. O processamento com filtros o mesmo para todos os
espcimens, devendo as suas diretrizes serem seguidas fielmente, ou as preparaes resultantes sero
insatisfatrias. Trs tipos de filtros (discutidos abaixo) podem ser usados nas preparaes citolgicas.
MATERIAIS E SOLUES
Filtro
Suporte do filtro
Grampos para filtro
Pinas para filtro
Seringas descartveis de 10 mililitros
Lminas de vidro
Etanol a 95%
Mtodo de colorao de Papanicolaou
PROCEDIMENTO
Figuras 1 e 2, no final do captulo de tcnicas citopatolgicas.
1. Remova o filtro da caixa usando uma pina e coloque-o no suporte.
2. Expanda o filtro injetando no suporte vrias gotas de etanol a 95%.
3. Injete o espcimen dentro do suporte usando uma seringa de 10 mililitros.
4. Adicione 1 mililitro de etanol a 95% usando a seringa de 10 mililitros.
5. Remova o filtro do suporte, utilizando uma pina, e corte-o para caber na lmina. (Se
utilizar um filtro grande corte-o em duas metades e use duas lminas).
6. Prenda, com um grampo, cada metade do filtro em uma lmina, e mergulhe as lminas
em uma jarra de colorao contendo etanol a 95%.
7. Core pelo mtodo de Papanicolaou (veja adiante).
8. Monte em lminas de vidro, com meio resinoso, mantendo as clulas voltadas para cima,
e tomando o cuidado de no deixar bolhas entre a lmina, o filtro e a lamnula.
OBSERVAES:
H trs tipos de filtro que podem ser usados na preparao de espcimens citolgicos, a saber,
Millipore, Gelman, e Nucleopore. A principal diferena entre eles o tipo de material de que so feitos
e o tamanho dos seus poros. Todos os trs requerem um mtodo de colorao de Papanicolaou
modificado.
Os filtros Millipore so filtros plsticos, contendo steres mistos de celulose, e poros grandes. Tais
filtros devem ser expandidos com etanol a 95%, para que no se retraiam, quando expostos aos
espcimens citolgicos. Durante a colorao, os tempos suficientes nas solues corantes, associados
com os enxgues em etanol, permitem que os corantes sejam absorvidos pelas clulas e no pelo filtro
em si. Precaues especiais devem ser tomadas durante a montagem da lmina com os filtros
Millipore. Eles se tornam transparentes somente quando montados em um meio com ndice de
refrao semelhante ao dos filtros. Um meio de montagem usual o Permount (Fisher Scientific).
Uma quantidade apropriada de meio de montagem deve ser usada, pois o xileno no se mantm nos
poros do filtro e, ao evaporar-se aps alguns dias, levar dessecao do filtro, apesar deste estar
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coberto com a lamnula. Entretanto, muito meio de montagem pode dificultar o exame microscpico
em grande aumento, a seco.
Os filtros Gelman tm propriedades fsicas e pticas semelhantes s dos filtros Millipore, e so
feitos de triacetato de celulose, um polmero mais resistente ao etanol. Em comparao com os filtros
Millipore, expandem-se menos quando expostos ao etanol. A captura de corante por este filtro
marcantemente reduzida, o que permite as clulas coradas sobressarem-se em relao com o fundo da
lmina. Os filtros Gelman tm um ndice de refrao de 1,47 a 1,48 e, para uma boa imagem
microscpica, eles precisam ser montados em um meio com ndice de refrao igual ou semelhante ao
deles. O meio Permount (Fisher Scientific) pode ser usado.
Os filtros Nucleopore so feitos de policarbonato, o qual no afetado pela maioria dos solventes.
Por isso, no necessrio pr-expandi-los com etanol a 95%. Eles no se coram e, desse modo, do
um fundo claro lmina; entretanto, eles tm dois ndices de refrao e so birrefringentes, tornando
impossvel eliminar a imagem dos poros com o meio de montagem. Deve-se tambm chamar a ateno
que se eles forem expostos ao xileno por mais de 15 minutos, eles ficaro ondulados. Isto tornar
difcil a montagem com lamnula e o exame ao microscpio. Os filtros Nucleopore, entretanto, podem
ser dissolvidos em clorofrmio ou em cloreto de etileno, o que elimina a ondulao e a imagem
distorcida dos poros. Contudo, a eliminao do filtro quimicamente pode produzir vrios artefatos, que
podem causar problemas na avaliao do espcimen.
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ESFREGAOS DIRETOS
PRINCPIOS
O esfregao direto da amostra de clulas sobre a lmina o mtodo preferido no
processamento citolgico. Os espcimens ricos em clulas so usados diretamente e os espcimens
menos celulares so concentrados atravs de centrifugao. Os escarros, preparados de acordo com o
mtodo de Saccomanno, so pr-fixados, misturados por meio de um misturador, e concentrados por
centrifugao, antes de serem feitos os esfregaos sobre as lminas. Os esfregaos diretos so
preparados usando-se o mtodo da trao de duas lminas. Duas gotas da amostra so colocados
sobre uma lmina e, sobre esta, colocada uma segunda lmina, sendo as duas gentilmente
tracionadas em sentido opostos de modo que, ao final, haver dois esfregaos.
MATERIAIS E SOLUES
Centrfuga
Tubos de 50 mililitros para centrfuga
Misturador Vortex
Pipetas de vidro
Etanol a 50%
Lminas de vidro cobertas com poli-L-lisina.
PROCEDIMENTO
Figuras 4 e 5, ao final do captulo de tcnicas citopatolgicas.
1. Concentre o espcime atravs de centrifugao, se necessrio.
2. Decante a maior parte do sobrenadante e redissolva o sedimento misturando-o com o
Vortex, por poucos segundos.
3. Transfira, com uma pipeta de vidro, uma pequena quantidade do sedimento para o
centro de uma lmina de vidro, coberta previamente com poli-L-lisina. Coloque uma
outra lmina sobre o sedimento e, gentilmente, movimente as lminas para frente e para
trs, de modo a dispersar as clulas em uma fina camada. A seguir, separe as lminas,
uma da outra, rapidamente.
4. Imerja as lminas em etanol a 95% para a colorao pelo mtodo de Papanicolaou, ou
deixe-as secar ao ar para serem coradas pelo mtodo Diff-Quik.
OBSERVAES:
Os escarros, os fluidos cavitrios corporais, e os aspirados por agulha fina so os tipos de
espcimens, a partir dos quais, podem ser feitos esfregaos diretos.
Faa uma soluo de 50 microgramas/mililitro de poli-L-lisina em gua desionizada,
autoclavada (esta soluo pode ser utilizada por at 1 ms, se mantida a 4oC). Sobre cada lmina
coloque, aproximadamente, 1 mililitro de soluo de poli-L-lisina, e distribua uniformemente em
cada uma das superfcies. Deixe as lminas em repouso, temperatura ambiente, por 30 minutos.
Escorra o excesso da soluo de poli-L-lisina e enxgue as lminas, 3 vezes, em gua desionizada.
Deixe as lminas secarem (as lminas secas podem ser armazenadas por 1 semana temperatura
ambiente).
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REFERNCIA
GILL, G. & PLOWDEN, K.- Laboratory Cytopathology: Techniques for Specimen Preparation.
Baltimore, Md, Johns Hopkins University Press, 1984.
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REFERNCIA
GILL, G. & PLOWDEN, K.- Laboratory Cytopathology: Techniques for Specimen Preparation.
Baltimore, Md, Johns Hopkins University Press, 1984.
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nenhuma clula, use 20 gotas. Poucas gotas de saponina podem ser adicionadas, antes de se colocar o
fixador Cytospin, se o espcimen for sanguinolento. A saponina lisa as hemcias, pois as mesmas so
como um artefato que dificulta a observao das clulas diagnsticas.
Deve-se lembrar que j existem equipamentos disponveis para o preparo citolgico, em
monocamadas finas, sobre lminas de vidro. Tais equipamentos variam desde simples e baratos at os
mais complexos e caros.
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PROCEDIMENTOS DE COLORAO
O mtodo de colorao mais comumente usado nos preparados citolgicos o de
Papanicolaou. Modificaes desta tcnica variam de um laboratrio para outro. aconselhvel a
padronizao deste mtodo, de modo que sejam obtidos resultados satisfatrios. As preparaes secas
ao ar so coradas pelo mtodo de Romanovsky e, usualmente, pelos mtodos Diff-Quick ou de Giemsa.
O uso de outros mtodos de colorao, na rotina do diagnstico citolgico, tem sido limitado. As
coloraes especiais, rotineiramente utilizadas na maioria dos laboratrios histolgicos, so algumas
vezes aplicadas. Ns utilizamos como referncia, para tais tcnicas, o AFIP`s Laboratory Methods in
Histotechnology.
COLORAO DE PAPANICOLAOU
PRINCPIOS
O procedimento de colorao de Papanicolaou foi desenvolvido para uma tima visualizao
das clulas cancerosas esfoliadas das superfcies epiteliais do corpo. uma reao de colorao
policromtica, consistindo de um corante nuclear de base aquosa e de dois contracorantes
citoplasmticos de base alcolica, cujo objetivo mostrar as muitas variaes na morfologia celular e
os graus de maturidade e de atividade metablica celular. Este mtodo no especfico para qualquer
substncia encontrada no cncer.
SOLUES
Hematoxilina
gua destilada .............................................................730 mililitros.
Etileno glicol ...............................................................250 mililitros.
Hematoxilina de Gill II (Lerner, Pittsburgh, PA) ............2 gramas.
Iodato de sdio .................................................................0,2 grama.
Sulfato de alumnio .......................................................17,6 gramas.
cido actico glacial .....................................................20 mililitros.
[N. do T.: A hematoxilina de Gill II pode ser substituida pela hematoxilina, cristais (C.I.: 75290)]
Misture os ingredientes, na sequncia, utilizando uma barra magntica, por 1 hora
temperatura ambiente. O corante pode ser usado imediatamente, porm filtre antes de
cada uso. A hematoxilina empregada nesta frmula a anidra. Se for utilizada a forma
da hematoxilina em cristais, use 2,36 gramas. Um grama de cido ctrico pode ser
substituido por 20 mililitros de cido actico glacial.
Banho de cido clordrico (usado somente para os filtros)
gua destilada........................................................1.000 mililitros.
cido clordrico, concentrado ......................................2 mililitros.
(Prepare fresco em cada dia)
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PROCEDIMENTO
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Hematoxilina...........................................................................3 minutos.
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Xileno.......................................................................................10 gotas.
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Xileno.......................................................................................10 gotas.
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2.
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4.
Hematoxilina..........................................................................2 minutos.
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19.
20.
21.
22.
Xileno....................................................................................1 minuto.
23.
Xileno....................................................................................1 minuto.
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RESULTADOS
Veja as figuras 7 a 10, ao final do captulo de tcnicas citopatolgicas.
NOTAS:
Quando estiver seguindo o procedimento de Papanicolaou, observe que todos os esfregaos
que tenham sido fixados com spray e todas as preparaes de Saccomanno devem permanecer no
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etanol a 95%, por pelo menos 10 minutos, antes de se proceder a colorao. Pode-se usar gua
destilada ou desionizada.
Durante a colorao, um nmero substancial de clulas se solta das lminas ou dos filtros. No
incomum que tais clulas flutuantes se fixem em outro espcimen. Para evitar a ocorrncia de
contaminao cruzada, certas regras devem ser seguidas: Todas as solues devem ser filtradas
diariamente. Os casos menos propensos a soltar clulas devem ser corados primeiro, e aqueles que
mais facilmente soltam clulas devem ser corados por ltimo. A ordem de colorao das amostras noginecolgicas deve ser a seguinte: (1o) fluidos espinhais; (2o) esfregaos e citocentrifugados
(cytospins); e (3o) todos os filtros. Deve-se ter em mente, entretanto, que o problema do
desprendimento de clulas no pode ser totalmente eliminado.
Algumas ocorrncias que precedem a aplicao do meio de montagem na lmina podem
influenciar os resultados. Tais ocorrncias incluem a espessura do esfregao celular e a presena de
gua no etanol absoluto e no xileno. Para os esfregaos celulares espessos, ou para os filtros, uma
quantidade maior de meio de montagem deve ser utilizada. reas densas, como borres, das
preparaes, cobertas pelo meio de montagem, favorecem a produo de bolhas de ar e o aparecimento
de focos secos pelo ar, causando o artefato conhecido com flocos de milho (Figura 11). Se isto
ocorrer, retire a lamnula imergindo a lmina no xileno, e, a seguir, recoloque a lamnula. Outro
problema a transferncia de gua para o etanol absoluto e deste para o xileno, tornando-os
enevoados, esbranquiados. O resultado ser a m-desidratao e imagens pouco ntidas (Figura 12).
Se gua for notada no xileno, IMEDIATAMENTE, troque o xileno, assim como o etanol absoluto.
Acima de tudo, um preparado citolgico satisfatrio depende no somente da colorao, mas
tambm da coleta do espcimen, da sua preparao, e da sua fixao. Uma colorao perfeita no
melhorar as amostras paucicelulares, ou as amostras mal-fixadas com clulas degeneradas, ou as
amostras cujas clulas ficam obscurecidas por lagosde leuccitos polimorfonucleares (neutrfilos).
Tais preparaes podem ser consideradas insatisfatrias.
REFERNCIAS
GILL, G. & PLOWDEN, K.- Laboratory Cytopathology: Techniques for Specimen Preparation.
Baltimore, Md, Johns Hopkins University Press, 1984.
PROPHET, E. B.; MILLS, B.; ARRINGTON, J.B. & SOBIN, L.H., eds.-Armed Forces Institute of
Pathology. Laboratory Methods in Histotechnology. Washington, D.C., American Registry of
Pathology, 1992.
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DESCOLORAO DE LMINAS
PRINCPIOS
Ocasionalmente pode ser necessrio descorar uma lmina de citologia, seja para recolorir pelo
mtodo de Papanicolaou, seja para requerer uma colorao especial, que pode auxiliar no diagnstico.
MATERIAIS E SOLUES
Jarras de colorao
Xileno
Etanol a 100%
lcool-cido (HCl a 1% em etanol a 70%)
Banho azulador
Etanol a 95%
PROCEDIMENTO
1. Coloque a lmina na jarra de colorao contendo xileno e deixe a lamnula se destacar
espontaneamente; no a puxe. As lminas que esto montadas h muito tempo podem
necessitar de vrios dias para que a lamnula se solte.
2. Remova todos os traos do meio de montagem mergulhando a lmina em xileno, fazendo
2 trocas de 1 minuto cada.
3. Coloque a lmina em etanol a 100%, fazendo 2 trocas de 1 minuto cada.
4. Coloque a lmina no lcool-cido at que a descolorao se complete. O tempo variar
nesta etapa.
5. Mergulhe a lmina no banho azulador de deixe por 3 ou 4 minutos.
6. Enxgue em gua de torneira, fazendo 2 trocas.
7. Coloque a lmina na jarra de colorao contendo etanol a 95%. A lmina est agora pronta
para ser recolorida pelo mtodo de Papanicolaou ou por uma colorao especial.
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REFERNCIA
GILL, G. & PLOWDEN, K.- Laboratory Cytopathology: Techniques for Specimen Preparation.
Baltimore, Md, Johns Hopkins University Press, 1984.
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REFERNCIA
LOPES CARDOZO, P.- Atlas of Clinical Cytology. Netherlands, Publisher Targa, Hertogenbosch,
1976.
REFERNCIAS ADICIONAIS SELECIONADAS
BALES, C.E. & DURFEE, G.R.- Cytologic Techniques. In: KOSS, L.G.- Diagnostic Cytology and its
Histopathologic Basis. 4th ed., Philadelphia, Pa, JB Lippincott Company, 1992. pp.1452-1514.
KEEBLER, C.M.- Cytopreparatory Tecniques. In: BIBBO, M. ed.- Comprehensive Cytopathology.
Philadelphia, Pa, W.B. Saunders, 1991. pp. 881-906.
AGRADECIMENTOS: Os autores gostariam de agradecer ao Dr. James Ownbey pela tomada das
fotografias para as ilustraes.
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