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Novembro de 2002.
Sumrio
Introduo e histrico
A tcnica
Cintica do PCR
Constituintes do mix
Instalaes e equipamentos
Preparo do mix
Variaes na PCR
Verificao dos produtos de amplificao-eletroforese em agarose
Problemas na reao da PCR
Optimizao da PCR
INTRODUO E HISTRICO
A reao em cadeia da polimerase (PCR) um mtodo para amplificao in vitro
de segmentos de DNA. Este mtodo considerado excelente para caracterizao de cidos
nucleicos, especialmente no que diz respeito a sua sensibilidade e especificidade (tabela 1).
Pela PCR, podem ser amplificados fragmentos de cido nuclicos, a partir de picogramas
do DNA molde presente nas amostras. O nmero de aplicaes para o PCR parece infinito,
sendo que entre elas podemos citar clonagem e seqnciamento de DNA e cDNA
genmicos, mutagnese in vitro, anlise de fingerprinting, medicina forense, testes para
deteco de agentes infecciosos, diagnstico de doenas gentica perinatais, anlise de
variaes nas seqncias genticas allicas, estudos da estrutura de transcritos de RNA. A
PCR foi desenvolvida em 1985, por Saiki e colaboradores, sendo que no mesmo ano os
primeiros artigos aplicando esta metodologia para o diagnstico clinico foram
apresentados. Estes PCRs de primeira gerao propagaram-se rapidamente entre os
laboratrios, principalmente aps o desenvolvimento e comercializao de DNA
polimerases termoestveis, obtidas da alga termoflica Thermus aquaticus. Em 1989, esta
enzima foi clonada expressa em linhagens de E. coli por Lawyer e colaboradores. Em 1990
uma nova gerao de PCR (segunda) foi obtida atravs da construo de termocicladores.
Desde ento, esta tcnica tem sido amplamente utilizada nos laboratrios. A tabela 2
apresenta as vantagens e desvantagens da tcnica de PCR.
Nmero de cpias
108
3
106
104
104
Menos de 10
Desvantagens
Risco de contaminao
Equipamentos necessrios
Reagentes necessrios
Instabilidade dos reagentes
Pessoal necessrio
Problemas tcnicos
Reprodutibilidade
Deteco de organismos no viveis.
TCNICA
Esta tcnica baseada num processo cclico que mimetiza a replicao do DNA, in
vitro uma vez que o nmero de molculas de DNA duplica aps cada ciclo. Logo aps x
ciclos teremos 2x molculas de DNA. Ou seja, aps 30 ciclos seriam obtidos milhes de
molculas de DNA amplificado, o que justifica a sensibilidade da tcnica.
As fases do Ciclo da PCR
OBS.:
* Como dito anteriormente o nmero de ciclos normalmente utilizado em PCR so de 30,
sendo que esta varivel depende da quantidade inicial de DNA presente na amostra.
Entretanto um nmero maior de ciclos pode no ser interessante, uma vez que existe um
efeito plateau onde a amplificao do DNA cessa (meia vida da enzima e esgotamento dos
constituintes da reao-mix);
* As diferentes temperaturas e tempo necessrios para cada ciclo so obtidos com uma
mquina denominada termociclador.
CINTICA DA PCR
Ciclos iniciais
No incio da PCR existe o DNA genmico (molde) e uma alta concentrao dos
primers. Estas pequenas sondas buscaro em todo DNA (que nos casos das bactrias pode
conter 109 nucleotdeos) at encontrar seu stio complementar e desta forma hibridizar com
seqncia molde de DNA. Durante sua busca os primers iro se ligar transitoriamente e ao
acaso com diferentes regies do genoma. Contudo, pelas condies otimizadas de
temperatura e pela adio de MgCl2, estes se dissociaro rapidamente, em busca de regies
onde a ligao ao DNA molde seja favorecida, de modo especfico. A busca dos stios alvo
do DNA pelos primers facilitada pela sua alta concentrao no ciclos iniciais.
Ciclos intermedirios
a fase onde ocorre a amplificao exponencial do DNA. Nesta fase da
amplificao, os primers encontram facilmente os locais de hibridizao, uma vez que as
molculas amplificadas nos ciclos iniciais servem como molde e apresentam um tamanho
menor, assim como regies de homologia perfeita. Nesta a fase a concentrao do DNA
genmico diminui, enquanto que a do produto de amplificao aumenta cada vez mais
(tabela 3).
Ciclos finais e plateau
O final da reao de PCR ocorre devido a alterao na concentrao dos
constituintes do PCR, em particular pelo esgotamento da Taq polimerase (tabela 3). Alm
disto, o acmulo de molculas de DNA amplificado, acompanhado pela reduzida
concentrao dos primers permite que estas se reassociem, impedindo a amplificao. A
ausncia de stios especficos para o anelamento dos primers faz com estes liguem-se a
regies inespecficas da molcula molde, o que pode interferir na reao. Geralmente o
PCR deve acabar com 30-35 ciclos.
Tabela 3. Relao dos componentes do PCR no incio e fim da PCR com relao ao
nmero de produtos amplificados.
Componente
DNA
Produto amplificado
Primer
DNTP
Taq
Inicio
10-6
10-6
108
1010
2 x 105
Fim
10-6
1
99
9.5 x 103
0,2
Template: a molcula de cido nuclico molde (DNA e RNA) utilizado no PCR. Existem
muitos mtodos para preparao do DNA para PCR, sendo que em alguns casos at cidos
nucleicos com um certo grau de degradao podem ser utilizados, principalmente para
amplificao de fragmentos de tamanho menor. Vrias substncias encontradas na amostra
(DNA) podem reduzir a eficincia do PCR, como uria, SDS, acetato de sdio, EDTA,
fenol, etanol, hemoglobina entre outros. Quanto mais limpo o DNA molde, maior a
sensibilidade da tcnica. Logo existem diversos protocolos de extrao e limpeza, sendo em
sua maioria baseados em extrao orgnica, precipitao com etanol, separao em
membranas de slica, extrato brutos utilizando detergentes e proteases, clorofrmio, resinas
quelantes, fervura, autoclavagem, ou extrao direta. A escolha do protocolo est
diretamente relacionada fonte do DNA molde. Entre elas podemos citar:
DNA genmico: Existem diversos protocolos para extrao de DNA genmico de
bactrias, leveduras, fungos, plantas e animais. A alta pureza do DNA a ser utilizado
somente requerida quando produtos grandes (<1Kb) devem ser obtidos. Estas preparaes
geralmente so mais complicadas exigindo reagentes caros e consumindo um maior tempo
para sua execuo.
RNA: O RNA pode ser utilizado como molde para o PCR (RT-PCR). Este pode ser obtido
por lise celular e precipitao com etanol. Entretanto, a estabilidade e quantidade de RNA
obtido so limitantes. Em muitos casos, Kits comerciais podem ser empregado com sucesso
para extrao de RNA das mais diferentes amostras.
Plasmdeos, Bacterifagos, Cosmdeos e Cromossomos artificiais: Estas molculas so
fontes eficientes para utilizao em PCR, sendo muitas vezes o PCR utilizado no Screening
de colnias transformantes. Geralmente o DNA plasmidial extrado atravs de miniprep
(lise alcalina), a qual pode ser realizada tanto para culturas individuais, com em larga
escala, em microplacas (sequenciamento)
Amostras clnicas e forenses: Nestas amostras, a pureza e conservao das amostras
muito importante, principalmente no sentido de prevenir a contaminao com DNA
exgeno presente no meio ambiente. No caso de sangue, a hemoglobina um dos principais
inibidores da reao, sendo necessrio adoo de protocolos visando a sua remoo das
amostras a serem analisadas. Para o diagnstico clnico, o uso de cortes de tecido
embebidas em papel, parafina e at mesmo em lminas de microscspio podem ser
utilizadas.
Amostras de stios arqueolgicos: Geralmente os estudos moleculares baseados em
amostras conservadas ao longo do tempo podem ser realizados atravs da anlise do DNA
mitocondrial ou ribossomal. Estas regies so muito importantes, pois permitem a obteno
de resultados conclusivos utilizando regies pequenas (100-200nt). Isto muito til nestes
casos, pois ao longo do tempo as amostras de DNA tendem a degenerar, mas no o
suficiente para impedir estas anlises. O grande problema neste caso a introduo de
amostras exgenas o que poderia levar a resultados errneos pela ausncia de amostras de
referncia. Logo, controles so muito importantes. Como exemplo temos os estudos feitos
em cadveres de mamuti conservados na Sibria, sendo extrado de mosquitos conservados
em ambar.
A quantidade do DNA necessrio para amplificao no PCR geralmente est
associada ao nmero de molculas molde presentes na amostra. Tendo como padro um
nmero aceitvel de 3x 105 molculas de molde, necessitaramos:
1g de DNA genmico humano
10ng de DNA genmico de levedura
1ng de DNA genmico de E. coli
1-2pg de DNA plasmidial
20pg de DNA de bacterifago
Primers (Iniciadores): Oligonucleotdeos sintticos que variam de 18-30nt, que so
projetados para serem complementares as extremidades do fragmento de DNA a ser
amplificado. Os primers so sempre projetados aos pares, contendo o mesmo nmero de
nucleotdeos, sendo que estes delimitam a regio do DNA a ser amplificada. Os primers
podem ser especficos para determinada regio do DNA de um grupo reduzido de ??? ou
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Primer-Dimer: Ocorre quando da hibridizao dos primers entre si, o que leva a uma
amplificao do DNA dos primers em detrimento ao do DNA alvo. Isto ocorre por que
quanto menor o produto (no caso alguns pares de bases), mais facilmente este ser
amplificado.
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12
13
Ligao
Via T4 PNK e ATP
A partir do ATP[32]
Aminolink
Aminolink
Direto na sntese
Finalidade
clonagem
Deteco autoradiogrfica
ELISA-PCR
PCR Real time
PCR Real time
Tm
No PCR, Tm
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Neste clculo toma-se como padro 4oC para realizar a ligao entre G e C e 2 oC
para ligaes entre A e T. Esta frmula foi descrita por Suggs e colaboradores em 1981,
tomando como base 1M de sal. Frmulas mais acuradas foram desenvolvidas
posteriormente para o desenho de primers que vo de 15 a 70nt em solues aquosas:
Tm= 81,5+16,6[log10(I)] + 0,41 (%GC)- (600/N)
Onde, I a concentrao de ctions monovalentes e N o tamanho do primer
OBS.: Nos clculos devemos sempre considerar somente os nucleotdeos que realmente
hibridizaro com o DNA alvo.
O que podemos concluir destas frmulas que a Tm dependente do tampo onde
o primer ser reconstitudo e que devemos sempre escolher pares de primers que tenham
uma reduzida diferena nesta varivel (5-7oC). Na primeira PCR de padronizao, deve
sempre ser escolhida uma temperatura de anelamento cerca de 5 oC abaixo da Tm descrita
para os primers. A temperatura de anelamento e a concentrao de Mg presente no tampo
so muito importantes para a correta associao dos primers com a seqncia de interesse e
desta forma para especificidade do PCR.
Concentrao dos primers
Na maioria dos casos, os primers devem ser utilizados na mesma concentrao,
sendo que esta variao de 0,1 a 1 M, equivalente a 5-50pmol para um volume de reao
de 50l. Os primers so sempre adicionados em excesso tendo em vista que aps a PCR
cerca de 95% do seu total permanea sem uso. O clculo de concentrao dos primers
sempre baseado na absorbncia obtida durante o processo de sntese dos mesmos. Sendo
calculada a massa dos primers sintetizados e sendo estes diludos a fim de se conseguir uma
concentrao de 1mg/ml ou 1g/l , sendo esta a soluo estoque, que deve ser conservada
a 20oC e manuseada com todo cuidado afim de evitar possveis contaminaes com DNA
ou outros primers. Alquotas devem ser diludas 10X (estoque) afim de se conseguir uma
diluio de 100g/l, o que equivale a 30pmol/l.
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DNTPs: So os nucleotdeos (dATP, dCTP, dGTP e dTTP) que servem de substrato para
duplicao das seqncias de DNA, sendo utilizados numa mistura equimolar, tendo em
vista a fidelidade da reao. Para isto, quantidades iguais dos quatro desoxiribonucleotdeos
devem ser includos na reao, geralmente numa concentrao de 0,2mM (200M) cada, o
que seria suficinete para amplificao de 10ng do produto. Em alguns casos, para aumentar
a especificidade do PCR as concentraes dos nucleotdeos podem ser reduzida, uma vez
que quanto maior a concentrao de nucleotdeos maior a possibilidade da Taq polimerase
amplificar fragmentos inespecficos. Alm disto, devemos evitar quantidades reduzidas de
DNTPs quando queremos amplificar DNA utilizando enzimas de Proofreading, pois sua
atividade de exonuclease 3-5 aumentada nestas condies, levando a degradao de
molculas de DNA fita simples, como os primers. Da mesma forma, quantidades reduzidas
de DNTPs podem comprometer a eficincia da reao. Os nucleotdeos podem ser
marcados com compostos radioativos ou fluorognicos, para diversas finalidades como
preparo de sondas e sequnciamento de regies do DNA (tabela 5).
Tabela 5. Compostos utilizados para marcar os nucleotdeos utilizados no PCR
Nucleotdeo modificado
7deaza-dGTP
Finalidade
Resoluo
de
Principio
estruturas Reduz a
secundrias
formao
estruturas
de
secundrias
(grampos ou hairpin) em
regies
ricas
facilitando
DUTP
Reduo de contaminao
em
o
GC
seu
sequenciamento
Serve de substrato
para
enzima
que
N-glicosilase
marcados Preparo
de
sondas
amplificados
e O material radiotaivo revela
S]
do nucleotdeo ou do produto
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amplificado ou at mesmo de
DNTPs
marcados
compostos
(fluoresceina
digoxigenina)
DdNTPs
com Preparo
de
sondas
fluorescentes serquenciamento
ou radioativo
Sequenciamento de DNA
no
sequenciamento de DNA e
southern blot.
Por no possuir a oxidrila no
carbono 3, realizam a parada
na sntese da molcula de
DNA( terminao de cadeia)
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INSTALAES E EQUIPAMENTOS
Laboratrio
Em um laboratrio onde se trabalhe com a amplificao de cidos nuclicos sempre
devemos levar em considerao a possibilidade de se carrear produtos de amplificao para
reas onde se manipulem as amostras e desta forma altera os resultados. Alm disto, o
preparo do mix deve sempre ser realizado em reas onde no se trabalhe com DNA (capela
de fluxo, ou capela com UV). Desta forma geralmente o laboratrio deve ser dividido em
duas reas, uma limpa, onde se trabalha com os constituintes da mix. Na rea suja seriam
analisados os produtos de amplificao (hibridizao, eletroforese, restrio, clonagem e
sequenciamento de DNA amplificado). Abaixo representado um esquema sugerido para
um laboratrio que trabalhe com PCR.
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Escritrios
Preparo da mix
Amplificao do DNA
Fluxo
Sala escura
Equipamentos
Pipetadores: Utilizadas para o preparo da mix, logo importante que estas estejam
corretamente calibradas para garantir a preciso da PCR. Como o volume de cada um dos
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Material plstico: Existem diferentes fabricantes de produtos plsticos para PCR. O mix
geralmente preparado em tubos de 0,5ml a 1,5ml, enquanto que a PCR pode ser realizado
tanto em microtubos de 0,5ml, 0,2ml e em placas de 96 poos, de acordo com o tipo de
bloco presente no termociclador. No caso de microplacas, membranas plsticas seladoras
devem ser utilizadas, para garantir a ausncia de contaminao, bem como reduzir a
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PREPARO DO MIX
Material Necessrio
Caixa com gelo
Luvas
Pipetadores limpos (preparo da mix)
Pipetadores para o template
Ponteiras e microtubos de 0,5ml ou 0,2 ml
Constituintes do mix
leo mineral estril
Termociclador
Preparo do mix
Constituinte
Tampo
dNTPs
Primer
Enzima
gua
template
Estoque
10mM (cada)
varivel
-
Soluo de uso
10X
1mM (cada)
30pmol/l
5U/l
-
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Interno: para amostras que forma negativas no PCR. Para ter certeza de que no se trata de
inibio da reao repeti-la utilizando o DNA template mais 1l de um produto de
amplificao (controle interno). O segundo PCR deve ser positivo (produto de PCR
adicionado) caso contrario significa que algo est inibindo a reao de PCR
Cuidados na realizao do PCR:
CONTAMINAO!!!!!!!!!!!!!!!!
*Sempre preparar a mix num local onde no exista manipulao com cidos nuclicos
*Utilizar ponteiras (tips) novos
*Utilizar luvas
*Evitar manipulao exagerada
*Utilizar pipetas livres de contaminaes
*Acrescentar o template num local diferente daquele onde se prepara a mix
VARIAES DA PCR
PCR multiplex
Nesta tcnica utilizam-se mais de um par de primers, sendo obtidas mais de um
resultado ao mesmo tempo, poupando tempo e reagentes. Pode ser utilizado para identificar
dois genes de um mesmo organismo, ou dois microrganismos diferentes presentes numa
amostra. Um problema associado a esta tcnica a competio entre os primers para
amplificao de suas seqncias alvo, a formao de primers-dimers e a temperatura de
annealing que deve ser a mesma para os dois conjuntos.
PCR Nested
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RT-PCR
PCR empregado para verificar a expresso de genes e montar bancos de cDNA.
Neste mtodo ocorre inicialmente a sntese de uma fita de DNA molde a partir de uma fita
de RNA, utilizando a enzima transcriptase reversa (retrovrus). Inicialmente gera-se uma
molcula hbrida DNA-RNA, contudo a fita de RNA removida pela adio de RNAses
(RNAse H) e a molcula de DNA serve de molde para o ensaio de PCR convencional.
OBS.: RNA no serve como molde para amplificao por PCR.
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Taq
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DNA. Quando o brometo de etdeo colocado sobre luz ultravioleta este emite uma
fluorescncia laranja, visvel a olho n.
As amostras devem ser aplicadas no gel com um tampo de amostra que contm
compostos de alta densidade (glicerol, xilol) e azul de bromotimol, que permitem a descida
do DNA para os poos formados no gel, para assegurar a correta migrao do DNA estes
devem ser colocados numa cmara contendo um tampo (TBE ou TAE), sendo que a
velocidade de migrao do DNA no gel est diretamente relacionado com a concentrao
de agarose e a voltagem aplicada (tabela 6).
Tabela 6. Resoluo dos gis de DNA
Matriz
poliacrilamida
agarose
Pulse-field
%
20
15
8
2
1,5
1,0
0,8
0,4
Espectro de separao
5- 100pb
20-150pb
60-400pb
0,2-1,5Kb
0,3-3Kb
0,5-5Kb
1-71Kb
5-30Kb
>5000Kb
Obs.
Sequenciamento de DNA
PCR
PCR
DNA GENMICO
Mega plasmdeos
CHEF
27
28
35 e 40 ciclos
Reconsiderar os dados de
sequenciamento
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em agarose
Avaliar
protocolo
de
Problema no termociclador
Desnaturao insuficiente
Tempo reduzido de extenso
extrao
Monitorar
Usar jump start
Utilizar como padro 1 min.
Problema na enzima
para cada Kb
1-2 unidades de enzima so
suficientes
verificar a enzima
testar com alquota de outra
Mltiplas bandas
Desoxinucleotdeos
Baixa
temperatura
anelamento
gradiente
Reduzir o nmero de ciclos
checando
alquotas
da
amplificao
Aumentar o tamanho dos
primers
Arraste
Bandas fracas
muito baixa
Muita polimerase
Muito template
Nmero
insuficiente
Reduzir a quantidade
Diluir o DNA molde
de Aumentar o nmero de ciclos
ciclos
Quantidade e qualidade do Checar o DNA em gel
template
Tempo de extenso curto
Requerimento de aditivos
Aumentar
Utilizar enhancers
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OPTIMIZAO DA PCR
Muitas vezes no se consegue obter nas condies normais do PCR uma banda
intensa e nica de amplificao. Quando ao se observar o gel de agarose se verifica a
ausncia de amplificao ou a ocorrncia de inmeras bandas, isto um indicativo que algo
deve ser alterado na reao a fim de obter-se melhores resultados. A maior parte das
modificaes visa, ou o aumento na sensibilidade do PCR, ou a reduo da contaminao.
Aumentando sensibilidade do PCR
Nos casos onde nenhuma banda de amplificao observada no PCR, diversos fatores
podem ser considerados:
1.Desenho dos primers: O desenho dos primers um ponto muito importante, uma vez
que eles so fundamentais a reao. Logo o par de primers deve ter uma Tm prxima para
que possam trabalhar eficientemente juntos (geralmente no deve ser maior do que 5 oC).
Alm disto, sempre que um novo primer for incorporado a reao, este deve ser analisado,
pois pode trazer consigo grandes problemas ao PCR.
2. Concentrao de Mg e outros ons: O magnsio um dos fatores limitantes para
correta atividade da Taq, logo est diretamente ligado com a estringncia do PCR, sendo
que quanto maior sua concentrao maior a estrigncia do PCR e menor o nmero de
bandas visualizadas no gel. Na padronizao da tcnica de PCR o ideal que tampes
contento diferentes concentraes de cloreto de magnsio sejam testadas (variando de 0,5 a
2,5mM). O KCl tambm muito importante uma vez que concentraes elevadas deste sal
(maiores que 0,2M) levam a uma inibio da PCR, por bloquear a desnaturao das fitas
por um mecanismo de neutralizao das cargas negativas da cadeia de fosfato.
3. Concentrao de Taq: A ausncia de produtos de amplificao ou bandas fracas
observadas no gel pode refletir uma baixa concentrao da polimerase. Para verificar se
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este o problema, uma titulao (diluio seriada) pode ser feita com a enzima a fim de
determinar qual a concentrao de Taq adequada para correta amplificao. Um aspecto
muito importante a ser considerado a meia vida da Taq DNA polimerase, logo PCR muito
longos ou com altas temperaturas de desnaturao devem prever a incorporao de maior
quantidade de Taq.
4. Temperaturas:
Desnaturao: muito importante pois expe os stios de hibridizao dos primers. Para
melhorar a desnaturao do DNA molde geralmente se adiciona um ciclo inicial de 5
minutos a 94oC (Jump Start) a fim de permitir que as molculas de DNA j estejam
desnaturadas no incio do primeiro ciclo do PCR. A temperatura de desnaturao depende
grandemente do contedo GC da seqncia alvo de amplificao, sendo geralmente
utilizado 94oC. Entretanto estudos comprovam que temperaturas entre 90-92 oC j seriam
suficientes.
Anelamento: A temperatura de anelamento um dos pontos chave no controle da
estringncia do PCR. Geralmente em Tm baixas ocorre a ligao aleatria dos primers e
amplificao de fragmentos inespecficos. Desta forma sempre devemos escolher a
temperatura ideal que permita a amplificao correta dos produtos.
Obs: Geralmente na optimizao do PCR os primeiros testes devem ser realizados visando
encontrar a Tm e a concentrao de cloreto de magnsio de maior estringncia.
5. PCR Touchdown: Esta tcnica a temperatura de anelamento deve ser maior que a Tm
dos primers nos primerios ciclos da PCR, sendo gradativamente reduzida. O ideal para um
primer de 20nt que a temperatura de anelamento seja reduzida de 1oC a cada dois ciclos.
Alm disto, ciclos adicionais de anelamento no final do PCR podem ser adequados.
6.PCR Hot Start: Nesta tcnica os componentes do mix devem ser aquecidos antes da
aplicao da polimerase, que ocorre aps o jump start. Isto impede que baixas temperaturas
(ex. gelo e durante o aquecimento), os primers anelem com seqncias inespecficas,
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permitindo sua amplificao. Entretanto este protocolo questionado uma vez que pela
manipulao pode ocorrer a contaminao do PCR.
7.PCR Booster: Nesta tcnica durante os primeiros cilclos se adiciona os primers numa
baixa concentrao a fim de se obter uma relao ideal com a as molculas do template isto
permite que os primers anelem de forma mais especfica
8.Nmero e durao dos ciclos: O nmero de ciclos deve sempre ser mantido no mnimo
necessrio a amplificao de produtos suficientes para uma anlise e manipulao futuras.
Em casos onde a amplificao do material no seja adequada podemos aumentar o nmero
de ciclos de 30 a no mximo 40.
9.Termociclador: Deve sempre ser avaliado para deteco de problemas tcnicos e falhas
no funcionamento. Esta pode ser monitorada atravs da adio de controladores de
temperatura digitais, que podem indicar toda variao de temperatura que ocorreu numa
amostra durante determinado perodo de tempo.
Aditivos para PCR: Uma srie de aditivos (enhancers) so disponveis comercialmente e
muitos deles so supridos com a prpria enzima. Estes so adicionados para aumentar a
eficincia da reao permitindo a amplificao em alta quantidade de produtos especficos.
Porm no existe nenhum componente capaz de solucionar todos os problemas e em muitos
casos so incompatveis com substncias presentes na amostra.
Abaixo so exemplificadas algumas destas substncias:
Tabela 8. Principais aditivos utilizados no PCR
Substncia
DMSO
Formamida
Cloreto de trimetilamnio
Tween 20
PEG 6000
7-deaza-DGTP
Concentrao
Mais de 10%
5%
10-100M
0,1-2,5%
5-15%
150
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Fonte
sangue
Remoo
Obs.
Extrao de clulas
Heparina
sangue
por centrifugao
Extrao de clulas
Porfirinas
Sangue-eritrcitos
por centrifugao
Extrao de clulas
por
das
centrifugao-
Extrao de DNA
clulas- Extrao com fenol
Detergentes
Lise
aninicos
Protocolos
de
Proteinase K
extrao
Protocolos
de Extrao fenlica
Fenol
extrao
Protocolos
Inativao trmica
de Precipitao
e
Compostos
extrao
fezes
SDS
Potentes
inibidores
(conc.
Inferiors a 5%)
aromticos
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Contaminao
A contaminao do PCR por DNA exgeno a principal preocupao de um
laboratrio que trabalhe com a amplificao de cidos nuclicos e principalmente naqueles
onde se realize o diagnstico molecular de enfermidades. A alta sensibilidade do PCR
permite que quantidades nfimas de DNA sejam amplificadas, entretanto uma vez o molde
presente na reao a Taq no pode diferenciara entre molculas da amostras daquelas
incorporadas a reao do ambiente laboratorial. Devido a especificidade do PCR o DNA
molde que pode ocasionar a contaminao do PCR so:
Templates originais
Genes clonados contendo a seqncia alvo
Produtos de amplificao
Tendo em vista a reduo da contaminao no PCR, vrias medidas podem ser
tomadas entre elas:
1.Separao de uma rea para preparo da mix: Que deve ser separada da rea de
manipulao do template e produtos amplificados.
2.Manter os constituintes do mix aliquotados: Especialmente a gua, a qual deve ser
autoclavada e aliquotada em tubos contendo 0,2-1,0 ml.
3.leo mineral : Deve ser esterilizado e sempre devemos evitar o contato do mesmo com
os tubos e pipetadores.
4.Clorina: Trata-se do hipoclorito de sdio a uma concentrao de 1,5%, o qual deve ser
empregado para limpeza da rea de preparo do mix e dos pipetadores (utilizar clorina
diluda, dar uma banho nos componentes dos pipetadores de 10 a 30 miutos, lavar com
gua destilada abundante e secar bem)
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Alta estringncia
aumentar
aumentar
reduzir
reduzir
reduzir
reduzir
reduzir
reduzir
Baixa estringncia
reduzir
reduzir
aumentar
aumentar
aumentar
aumentar
aumentar
aumentar
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37