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de
las
enzimas.
1
RESUMEN
La
actividad
cataltica
de
la
enzima
-amilasa
se
determin
mediante
el
estudio
del
efecto
del
pH
sobre
la
misma;
la
enzima
fue
sometida
a
distintos
valores
de
pH,
realizando
en
total
6
ensayos.
Para
la
obtencin
del
pH
ptimo
de
la
enzima,
en
donde
alcanza
su
mxima
actividad
cataltica,
se
calcul
el
porcentaje
de
actividad
mediante
la
aparicin
de
maltosa
como
producto.
El
pH
de
la
enzima
donde
se
evidenci
mayor
actividad
es
de
5,4598;
sin
embargo
al
calcular
el
pH
ptimo
de
la
enzima
se
obtuvo
un
valor
de
4,9948,
siendo
este
el
pH
en
donde
la
enzima
presenta
una
buena
actividad
cataltica.
INTRODUCCIN
La
actividad
cataltica
de
un
enzima
se
determina
midiendo
la
velocidad
inicial
de
reaccin,
que
es
la
pendiente
de
la
curva
de
progreso
(curva
de
producto
formado
sustrato
transformado
frente
al
tiempo)
en
el
tiempo
cero.
Inicialmente,
las
reacciones
transcurren
linealmente,
pudindose
tomar
la
pendiente
de
esta
recta
como
velocidad
inicial.
A
tiempos
ms
largos,
el
progreso
de
la
reaccin
se
aparta
de
la
linealidad.
Esta
cada
de
la
velocidad
de
reaccin
se
debe
a
la
disminucin
significativa
de
la
concentracin
de
sustrato,
aunque
tambin
pueden
influir
otros
factores
como
el
aumento
de
la
concentracin
de
producto,
cambios
de
pH,
inactivacin
del
enzima,
etc.
La
mxima
fiabilidad
en
la
determinacin
de
la
actividad
de
un
enzima
la
suministra
el
valor
de
velocidad
inicial
o
velocidad
durante
el
tramo
inicial
de
progreso
lineal
de
la
reaccin
(ALDAVE,
2011).
La
actividad
de
un
enzima
se
ve
afectada
por
el
pH
al
cual
se
lleva
a
cabo
la
reaccin.
La
curva
actividad-pH
puede
ser
diferente
para
cada
tipo
de
enzima.
En
el
caso
ms
general
la
curva
tiene
forma
de
campana.
El
valor
de
pH
al
cual
la
actividad
es
mxima
se
denomina
pH
optimo;
dicho
pH
no
tiene
porqu
coincidir
con
el
pH
intracelular.
La
relacin
entre
el
pH
y
la
actividad
depende
del
comportamiento
cido-base
del
enzima
y
del
propio
sustrato.
Sustrato
y
enzima
(centro
activo)
pueden
contener
grupos
funcionales
cidos
y
bsicos,
siendo
su
grado
de
disociacin
dependiente
del
pH,
lo
que
determinar,
entre
otros
aspectos,
la
conformacin
de
la
protena,
la
capacidad
de
unin
del
sustrato
al
centro
activo
del
enzima
(Km)
y
la
capacidad
de
transformacin
del
sustrato
(kcat).
Los
estudios
cinticos
a
diferentes
valores
de
pH
nos
proporcionan
informacin
sobre
el
mecanismo
cataltico
de
los
enzimas
y
la
naturaleza
de
los
aminocidos
ms
directamente
implicados
en
la
catlisis
(ALDAVE,
2011).
El
presente
trabajo
tiene
como
objetivo
determinar
la
influencia
del
pH
sobre
la
actividad
de
la
enzima
B-amilasa
as
como
tambin
su
pH
ptimo.
MATERIALES
Y
MTODOS
Preparacin
del
tampn
acetato
de
sodio
0,02M
de
pH
4,5
(100
ml):
Se
prepar
las
soluciones
de
cido
actico
y
acetato
de
sodio
0,02M
y
se
las
mezclo
hasta
conseguir
que
el
pH
de
la
mezcla
sea
de
4,5
(relacin
de
mezcla
aproximada
de
1:1).
Soluciones
tampn
citrato-fosfato
de
pH
3,0;
3,5;
4,0;
4,5;
5,0;
5,5;
6,0;
6,5
y
7,0
(50
ml):
Se
mezclaron
las
soluciones
de
cido
ctrico
(0,05
M)
y
fosfato
dibsico
de
sodio
(0,1
M)
de
modo
que
el
pH
final
de
cada
una
de
ellas
alcance
los
valores
antes
indicados.
Soluciones
de
almidn
al
1%
(20
ml)
en
cada
uno
de
los
tampones
citrato-fosfato:
Se
pes
la
cantidad
de
almidn
soluble
correspondiente
y
se
suspendi
en
20
ml
de
tampn
citrato-fosfato,
se
calent
la
suspensin
bajo
agitacin
y
se
dej
hervir
durante
3
min.
Se
enfri
y
restituyo
el
agua
evaporada.
Se
midi
el
valor
de
pH
de
cada
sustrato
(valor
real
que
ser
usado
para
la
grfica
y
el
clculo
del
pH
ptimo).
Solucin
de
enzima
1/40
en
tampn
acetato
(10
ml).-
Se
prepar
la
dilucin
final
de
la
enzima
por
diluciones
sucesivas
(1
dil
1/10;
3,0
mL)
y
(2
;
10
mL).
Preparacin
de
la
curva
estndar
de
Maltosa:
Se
utilizaron
los
valores
de
absorbancia
y
concentraciones
de
la
curva
estndar
de
maltosa
de
la
prctica
1.
Determinacin
de
la
actividad
inicial
a
20
C:
Se
coloc
en
una
gradilla
36
tubos
bacteriolgicos
perfectamente
lavados
y
marcados
con
el
valor
de
pH;
3
tubos
por
cada
valor
de
pH
ms
un
blanco.
Se
aadi
a
cada
tubo
0,4
ml
de
la
solucin
de
sustrato
y
se
los
termostatiz
a
20C
al
igual
que
la
solucin
de
enzima
por
10
minutos.
Se
agregaron
0,1
ml
de
la
solucin
de
enzima
a
cada
una
de
las
rplicas,
se
dej
que
la
reaccin
proceda
durante
3
minutos
y
se
detuvo
la
reaccin
con
la
adicin
de
0,5
ml
de
solucin
de
DNS.
Se
mezcl
bien,
se
dej
hervir
por
5
minutos,
se
enfri,
se
aadi
5
ml
de
agua
destilada
y
se
ley
la
absorbancia
a
540
nm
frente
a
un
blanco
preparado
invirtiendo
el
orden
de
adicin
de
los
reactivos
(enzima,
DNS
y
sustrato).
RESULTADOS
La
estructura
tridimensional
de
una
enzima
de
origen
proteico
determina
su
sitio
cataltico
y,
por
lo
tanto,
su
actividad.
Dicha
estructura
se
encuentra
estabilizada
por
una
serie
de
enlaces
no
covalentes
(hidrofbicos,
puentes
de
hidrgeno,
atracciones
electrostticas)
y
covalentes
(puentes
de
disulfuro)
que
existen
entre
los
grupos
R
de
los
aminocidos.
Los
cambios
de
pH
modifican
las
cargas
de
los
grupos
R
de
los
aminocidos
que
no
son
neutros,
e
interfieren
con
las
atracciones
electrostticas
y
su
estabilidad
estructural
tridimensional,
lo
que
provoca
una
prdida
total
o
parcial
de
la
actividad
enzimtica.
(QUESADA,
2008)
Las
enzimas
son
protenas,
como
tales
poseen
grupos
ionizables
cuyo
estado
depende
del
valor
del
pH;
por
lo
tanto
la
accin
de
las
enzimas
se
altera
al
variar
ste
parmetro
y
es
preciso
controlarlo
por
medio
de
un
tampn
si
se
quiere
obtener
resultados
concordantes.
La
influencia
del
pH
sobre
la
actividad
cataltica
de
la
enzima
-amilasa
fue
estudiada
experimentalmente
mediante
la
% Actividad
85,00
65,00
45,00
0.003
0.003
0.004
0.004
0.005
0.005
0.006
0.006
0.007
0.007
pH
Figura
#
1:
Efecto
del
pH
sobre
la
actividad
cataltica
de
la
-amilasa
A
cierto
pH
las
cargas
de
los
residuos
de
los
aminocidos
que
participan
en
el
sitio
activo
estn
en
condiciones
ptimas
para
la
actividad
cataltica
sobre
el
sustrato
correspondiente.
Por
lo
tanto,
a
ese
pH
la
velocidad
de
la
reaccin
ser
mxima
y
ese
pH
es
conocido
como
pH
optimo
de
la
enzima.
Por
supuesto,
en
valores
de
pH
demasiado
cidos
o
alcalinos,
no
solamente
podr
estar
modificado
el
sitio
activo,
sino
que
la
estructura
terciaria
de
toda
la
molcula
se
encontrara
alterada
y
no
habr
actividad
enzimtica.
El
pH
ptimo
de
la
enzima
-amilasa
es
de
4,9948,
en
donde
la
enzima
adquiri
su
mayor
actividad
cataltica
y
este
fue
calculado
mediante
regresin
cuadrtica
ya
que
la
grafica
presenta
una
curva
en
forma
de
campana
lo
que
refleja
la
ionizacin
de
residuos
de
aminocidos
que
deben
estar
en
un
estado
de
ionizacin
especifico
para
tener
actividad
enzimtica.
El
pH
ptimo
de
la
enzima
-amilasa
bibliogrfico
es
de
5
a
6
lo
cual
indica
que
el
obtenido
en
el
laboratorio
esta
dentro
del
rango
ya
que
presenta
un
pH
ptimo
de
4,9948.
CONCLUSIN
Se
determin
la
influencia
que
tiene
el
parmetro
de
pH
sobre
la
actividad
de
la
enzima
-amilasa,
en
donde
se
puede
concluir
que
la
enzima
presenta
mayor
porcentaje
de
actividad
a
5,4598
ya
que
ah
se
observa
mayor
produccin
de
maltosa
a
partir
del
sustrato
que
es
el
almidn.
Sin
embargo,
el
porcentaje
de
actividad
no
esta
estrechamente
ligado
con
el
pH
ptimo;
ya
que
el
pH
ptimo
es
aquel
en
donde
la
enzima
tiene
condiciones
adecuadas
para
su
actividad
enzimtica
sin
afectar
a
su
estructura
para
as
evitar
la
desnaturalizacin
de
la
misma.
El
pH
ptimo
obtenido
experimentalmente
de
la
-amilasa
es
4,9948,
el
cual
indica
que
a
este
pH
la
enzima
no
se
ve
afectada
tanto
en
su
estructura
como
en
su
porcentaje
de
actividad.
Tambin,
se
puede
concluir
que
el
pH
ptimo
experimental
se
asemeja
al
bibliogrfico
ya
que
la
-amilasa
tiene
un
pH
optimo
bibliogrfico
de
5
a
6.
BIBLIOGRAFA
FERSHT, A. (2009). Estructura y mecanismo de las enzimas. Ed. Reverte. P.p: 149
KOLMAN,
J.
(2008).
Color
Atlas
of
Biochemestry.
Segunda
edicin.
New
York,
USA.
pp:
90,91
ANEXOS
CLCULOS:
a) Curva
estndar
de
maltosa.
Tabla
#
1:
Curva
estndar
de
maltosa
Tubo
Vol
maltosa
(ml)
Peso
(g)
Vol
agua
(ml)
Blanco
0,000
0,000
0,600
Std
1
0,120
0,110
0,480
Std
2
0,240
0,230
0,360
Std
3
0,360
0,370
0,240
Std
4
0,480
0,480
0,120
Std
5
0,600
0,590
0,000
Fuente:
Laboratorio
de
Ingeniera
de
las
Enzimas
Elaborado
por:
Fiallos,
J.
(2015)
Peso
T
(g)
0,600
0,600
0,600
0,630
0,600
0,590
Abs
0,000
0,116
0,306
0,463
0,614
0,777
Maltosa
(mg/ml)
0,0000
0,3703
0,7743
1,1863
1,6160
2,0200
Solucin m adre.
Peso: 0,0101 g
Volumen solucin: 5 ml
Concentracin
solucin
madre:
()
()
0,0101
5
= 2,02
Concentracin
Maltosa:
= [. ]
= 2,02
0,110
0,60
= 0,3703
()
()
0,9
0,8
Absorbancia
(540
nm)
0,7
0,6
0,5
0,4
y
=
0,3885x
-
0,0071
R
=
0,99826
0,3
0,2
0,1
0
-0,1
0
0,5
1
1,5
[Maltosa]
mg/ml
pH
3,0
3,5
4,0
6,0
6,5
7,0
pH
sustrato
2,424
2,999
3,559
5,806
6,335
6,949
pH
real
2,7542
3,2142
3,6622
5,4598
5,8830
6,3742
2,5
4
1
= (2,424) + (4,075)
5
5
= 2,7542
Ecuacin
para
determinar
la
velocidad
inicial
relativa:
= !
!!"#
=
3 0
!!"#
! =
0,7107
! = 0,2369
Ecuacin
para
determinar
el
%
de
actividad
relativa:
(%) =
% =
0,2609
100
0,5089
% = 51,2674