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César Sánchez*, Aaroa Pérez, Alfredo F. Braña, Carmen Méndez y José A. Salas
Departamento de Biología Funcional
e Instituto Universitario de Oncología del Principado de Asturias (IUOPA)
Universidad de Oviedo
Generación de nuevos compuestos bioactivos
mediante manipulación genética de microorganismos
Manipulaciones genéticas
OH
HO
MITRAMICINA OH O OH OMe
(inhibidor de replicación y transcripción de ADN)
Streptomyces argillaceus OVIEDOMICINA REBECAMICINA
(inductor de apoptosis) (inhibidor de ADN topoisomerasa I)
Streptomyces antibioticus Lechevalieria aerocolonigenes
OCH3
CH3 OOCCH3
O
HO CH3 OCH3 OH H
O H N O
O O CH3 CH3 CH3 CH3
O OH OH
H3C O
OH OH O OH O
H3C N N
H3C
H3C O
O HO
O O
NC H
HO O
O
CH3 COOH MeO
H3C
O
H3CCOO
NHCH3
HO
H
O N O H
N O
N N
H N N
Cl Cl
O OH O
H3C H
HO
H3CO
OH
NHCH3
OCH3
ESTAUROSPORINA
REBECAMICINA
Derivados en ensayos clínicos:
Derivados en ensayos clínicos: PKC412, CEP-751,
NSC655649 (“rebeccamycin analog”), UCN-01 (7-hidroxi-estaurosporina)
NB-506, J-107088
Aislamiento de genes biosintéticos de rebecamicina
Cósmidos positivos
¿ Producción de rebecamicina ?
Streptomyces albus conteniendo cósmidos “reb”
Extracción y purificación
Caracterización estructural
1400
* O
H
N O
min N N
6.0 12.0 H
Cl Cl
O OH
Streptomyces albus / cósmido 14E8 HO
OH
OCH3
Rebecamicina
Los genes biosintéticos de rebecamicina
1 kb
G O D C P M R F U H T
II. Dimerización
I. Modificación del triptófano
III. Cierre del sistema de anillos
H
NH2 NH2
HOOC HOOC RebO O N O
RebH RebD
x2
N N RebC
RebC
H Cl H RebP N N
RebP H H
L-triptófano Cl Cl
aglicón
Biosíntesis de rebecamicina: ruta propuesta (IV-V)
H
H N
N O O
O O
H
O N O N N
RebG N N RebM
RebG Cl H Cl
Cl H Cl
OH
OH O
N N O
Cl H H Cl HO HO
OH OH
aglicón
OH O
CH3
rebecamicina
Expresión heteróloga de genes biosintéticos de rebecamicina
1 kb
G O D C P M R F U H T
p O D C P M pREB6
G O D C P M R F U pREB7
Streptomyces albus / pREB6
p O D C P M pREB6
Análisis HPLC
H
O N O
mAU
600
1
N N
H H
min
10.0 20.0
Aglicón de descloro-rebecamicina
Streptomyces albus / pREB7
G O D C P M R F U pREB7
(Compuesto esperado: descloro-rebecamicina)
H
O N O
Análisis HPLC
mAU 2 (R=CH3)
2 Descloro-rebecamicina
150 N N
H
O OH 3 (R=H)
3 HO 4’-Desmetil-descloro-
min
10.0 20.0 OH rebecamicina
O R
Biosíntesis combinatoria de indolocarbazoles (I)
H
O N O
O
CH3
H2N
Cl O
NH O
N N
N H H
H O N O
CH3
Cl Cl
H3C
O OH
OH
O
HO N N
O OH
CH3
OCH3 O
O H 3C H
O
rebecamicina H3CO
O CH3
NHCH3
O (Lechevalieria aerocolonigenes)
HN OH
estaurosporina
OH (Streptomyces longisporoflavus)
CH3
H 3C
CH3
COOH
H
pirroindomicina β N O
(Streptomyces rugosporus) R1
R6 R7
O
NH
HN
O O
R4 N N R5 HO
NH2 H H
S R2 R3 N
H
Cl N
H
R1= CO, CHOH, CH2 violaceína
tienodolina R2 , R3= H, Cl, Br (Chromobacterium violaceum)
(Streptomyces albogriseolus) R4 , R5= H, Cl, Br
R6 , R7= H, Cl, Br, OH
Biosíntesis combinatoria de indolocarbazoles (II)
S. longisporoflavus
L. aerocolonigenes rebecamicina estaurosporina
G O D C P M R F U H T
genes biosintéticos
S. rugosporus pirroindomicina
H
staC
M pyrH
estructura básica banco de genes S. albogriseolus tienodolina
S. albus G
modificadores
O D C P thal
vioC
vioD
C. violaceum violaceína
Biosíntesis combinatoria de indolocarbazoles (III)
staC pyrH Ensayos de actividad antitumoral
H staC
vioC vioD G
M pyrH
staC
Caracterización estructural
banco de genes H staC G (MS, NMR)
modificadores
G thal
thal
staC vioD G M
vioD vioC combinaciones de genes
Extracción y purificación (HPLC)
modificadores (en plásmidos)
estructura básica
S. albus
O D C P
I. Modificación III. Cierre del V. Modificación
II. Dimerización IV. Glicosilación
de Trp sistema de anillos del azúcar
RebC
RebP
StaC
RebP
RebH
RebC
RebP
RebO RebM
RebD RebG
StaC
RebP
PyrH
RebC
RebP
StaC
RebP
Trabajo en curso y planes inmediatos