APLICACIN DE LA ELECTROFORESIS

CAPILAR
PARA
EL
ANLISIS
Y
SEGUIMIENTO
DEL
GRADO
DE
MADURACIN DE QUESOS DE OVEJA Y
MEZCLA.

Fundamentos
La complejidad y diversidad de los alimentos genera una gran demanda de
tcnicas que puedan ser utilizadas en el anlisis de los mismos.

Una de las alternativas posibles para tcnicas analtica es la electroforesis

capilar (EC) para alcanzar un alto poder de resolucin.
Las principales ventajas de la aplicacin de la tcnica de electroforesis
capilar son: la eficacia en las separaciones, el bajo consumo de disolvente y
su fcil manejo.
Pero tambin tienen limitaciones como en la deteccin de muestras de
concentracin elevada.

Electroforesis Capilar
Es una tcnica de separacin que se basa en la migracin diferencial (en sentido y
velocidad) de partculas cargadas (analitos) en un campo elctrico establecido. Estas
partculas cargadas pueden ser muy variadas: iones simples o complejos,
macromolculas, coloides, clulas vivas como bacterias o materia inerte como arcilla.

Cuando a una solucin que contiene

molculas cargadas se le aplica un
campo elctrico, estas molculas
comenzaran
a
moverse,
dependiendo de su relacin cargatamao. El tamao de una molcula
esta determinado por su peso
molecular y por su estructura
tridimensional.

Haciendo un balance entre las fuerzas de electromovilidad y

de friccin, la movilidad electrofortica debida al potencial
elctrico aplicado (pe) puede ser expresado como:

pe = q / 6 r

donde:

q = carga neta
= la viscosidad
r = radio inico

La aplicacin del campo elctrico y la diferencia en la

movilidad electrofortica har que los aniones migren hacia el
polo positivo (nodo ) y los cationes haca el polo negativo
(ctodo) en igual cantidad.

El uso de capilares como un canal de electromigracin

para
la
separacin
de
analitos,
incluyendo
macromolculas biolgicas, est asociado con varias
ventajas por encima de los mtodos slidos estndares de
separacin.
Las caractersticas fsicas de los capilares estrechos
perforados los hace ideales para la electroforesis. Los
capilares de slice empleados en EC tienen un dimetro
interno de 20 a 100 m (375 m de dimetro externo),
longitudes de 20 a 100 cm y estn externamente cubiertos
por una sustancia polimrica que confiere al capilar una
enorme flexibilidad, el cual de otro modo seria frgil.

La elevada relacin entre superficie-volumen en un

capilar con estas dimensiones, permite una eficaz
disipacin del calentamiento generado por campos
aplicados altos. Como resultado, las separaciones
electroforticas se pueden llevar a cabo fcilmente a
300,000 voltios, controlando el calor generado, mediante
la utilizacin de un refrigerante activo sobre la pared
externa del capilar.
Con capilares tpicos de EC, las pequeas dimensiones
rinden volmenes totales en columna del orden de
microlitros, por lo tanto se requiere el uso de tampn
(reactivo) en cantidad de mililitros

Las principales modalidades de la EC son:

- Cromatografa capilar micelar electrocintica (MEKC): tcnica
que permite separar compuestos neutros y de movilidad
electrofortica similar.

- Isoelectroenfoque capilar (CIEF): permite separar molculas en

bandas segn el punto isoelctrico de las mismas sobre un
gradiente de pH.
- Electroforesis capilar en gel (CGE): empleo de capilares, con
paredes recubiertas y rellenos de una matriz polimrica
reemplazable.
- Isotacoforesis capilar (CITP): tcnica que implica el movimiento
de las molculas cargadas en un campo elctrico y que est
definido por la movilidad del in de movimiento ms rpido.

- Electroforesis capilar en zona libre (ECZ): es la ms universal de

las tcnicas y se ha mostrado til para la separacin de un
amplio conjunto de analitos de variado tamao y carcter.

Electroforesis Capilar Zonal

Mtodos
Se utilizaron dos capilares:
Capilar sin recubrimiento interior De slice fundida: en la superficie
recubrimiento de poliacrilamida.
Capilar neutro hidrofilicamente recubierto eCap: Con una capa de
poliacrilamida en la superficie interior, la cual neutraliza las cargas del
capilar eliminando a su vez el flujo electrosmotico.

Soluciones tampn.
Tampn universal de Theorell y Stenhangen (citrato-fosfato-borato/HCl)
[T1]
Tampn fosfato 50 mM [T2]
Tampn fosfato 50 mM con HPMC (hidroxipropilmetil celulosa) [T3]
Tampn de carrera ctrico-citrato [T4]

Tampn de lavado ctrico-citrato. [T5]

Preparacin de la muestra
Para disociar las casenas y los productos insolubles de su hidrlisis todas las
muestras se disolvan en el tampn de muestra que consista en una
solucin de tampn fosfato 10 mM (pH 8), el cual contena urea 8M,
ditiotreitol (DTT) 10 mM y como marcador el trpptido Lys-Tyr-Lys 1mM. La
muestra se mantena al menos 1 h a temperatura ambiente antes de ser
filtrada.

Condiciones de separacin

La inyeccin de la muestra en el capilar se realizaba hidrodinmiamente a

presin (5 psi) durante 5 segundos en el extremo andico y la separacin
se llevaba a cabo del nodo al ctodo.

Capilar de slice fundida

La migracin se llev a cabo a 23C, el voltaje aplicado fue un valor
constante y oscilaba entre 15-30 Kv.

Electroforesis capilar en zona libre sin aditivo

Se utilizo el tampn universal [T1] y el tampn fosfato [T2], el capilar se lavaba
primeron con agua durante 2 min, seguido de NaOH 0.03-1M durante 2 min,
se secaba con N2 aprox. 2 min y por ltimo se equilibraba con el tampn de
separacin durante 4 min.
Se consegua una separacin satisfactoria en 40 min.

Electroforesis capilar en zona libre con HPMC

La migracin de protena se realizaba con el tampn fosfato [t3] que
contena HPMC durante un tiempo de 50 min.
El lavado del capilar se llev a cabo con HCl y agua y se equilibr con el
tampn de separacin.

Capilar neutro hidroflicamente

recubierto.
La separacin se llevo a cabo durante 60 min y a una temperatura y
voltaje constantes. Temperatura entre 23-45C y Voltaje 18.5-30 Kv.
Los tampones empleado fueron el tampn de citrato [T4] para correr las
muestras, que contenan un 0.05% p/v de HPMC, y el tampn citrato [T5]
para efectuar el lavado del capilar, ambos tampones a un pH de 3.
El lavado se llevo a caco con HCl 0.1 N (2 min), seguido de un lavado con
agua (2 min) y finalmente con un tampn de lavado (5 min) con el fin de
equilibrar el capilar

PROBLEMA
En un experimento de electroforesis, una partcula esfrica de 0.05
micrmetros de dimetro en una solucin acuosa de cloruro de potasio 0.1
M a 25C tarda 0.85 segundos en recorrer una distancia de 12 micrmetros
a lo largo de uno de los niveles estacionarios de la celda, siendo el
gradiente de potencial de 10 volts/cm. La constante dielctrica del agua
es de 78.5 y su coeficiente de viscosidad es de 8.9x10^-4 kg/m s . A)
Calcular la movilidad electrofortica de la partcula, b) el potencial Z de la
partcula y c) el valor de la densidad de la carga de la superficie si la
distancia entre capas es de 0.99x10^-8 m.

0 =
2
12
= 8.854 10
2
=
=
=
=
=