Venancio, Larissa Paola Rodrigues.

Cgado-de-barbelas (Phrynops geoffroanus (Schweigger, 1812),
Testudines; Chelidae) como modelo para ecotoxicologia evolutiva :
relacionamento entre contaminao ambiental, condio e variabilidade
gentica / Larissa Paola Rodrigues Venancio. - So Jos do Rio Preto : [s.n.],
2012.
158 f. : il. ; 30 cm.
Orientador: Claudia Regina Bonini-Domingos
Coorientador: Debora Aparecida Pires de Campos Zuccari
Tese (doutorado) Universidade Estadual Paulista, Instituto de
Biocincias, Letras e Cincias Exatas
1. Biologia animal. 2. Tartaruga. 3. Toxicologia ambiental. 4. Gentica
Animal. I. Bonini-Domingos, Claudia Regina. II. Zuccari, Debora Aparecida
Pires de Campos. III. Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biocincias,
Letras e Cincias Exatas. IV. Ttulo.
CDU 598.13
Ficha catalogrfica elaborada pela Biblioteca do IBILCE
Campus de So Jos do Rio Preto - UNESP

LARISSA PAOLA RODRIGUES VENANCIO

Cgado-de-barbelas (Phrynops geoffroanus (Schweigger, 1812), Testudines:

Chelidae) como modelo para ecotoxicologia evolutiva: relacionamento entre
contaminao ambiental, condio e variabilidade gentica.

Tese apresentada para obteno do

ttulo de Doutor em Gentica, junto ao
Programa de Ps-Graduao em
Gentica do Instituto de Biocincias,
Letras e Cincias Exatas da
Universidade Estadual Paulista Jlio
de Mesquita Filho, Campus de So
Jos do Rio Preto.

BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Claudia Regina Bonini Domingos
Professor Assistente Doutor
UNESP So Jos do Rio Preto
Orientador
_________________________________
Prof. Dr. Alexandre Rodrigues Caetano
Professor Doutor
EMBRAPA Recursos Genticos e Biotecnologia
_________________________________
Prof. Dr. Camilo Dias Seabra Pereira
Professor Assistente Doutor
UNIFESP Universidade Federal de So Paulo
_________________________________
Prof. Dr. Richard Carl Vogt
INPA - Instituto Nacional de Pesquisa da Amaznia
_________________________________
Prof Dr Lilian Madi Ravazzi
Professor Assistente Doutor
UNESP So Jos do Rio Preto
_________________________________

So Jos do Rio Preto, 14 de Junho de 2012

Este trabalho foi realizado no Centro de Estudo de Quelnios (CEQ) e

Laboratrio de Hemoglobinas e Gentica das Doenas Hematolgicas
(LHGDH) do Departamento de Biologia; no Laboratrio de Biomarcadores
de Contaminao Ambiental, do Departamento de Qumica e Cincias
Ambientais do Instituto de Biocincias, Letras e Cincias Exatas, IBILCE,
Universidade Estadual Paulista, UNESP de So Jos do Rio Preto, e
tambm no Laboratrio de Gentica Animal da Embrapa Recursos
Genticos e Biotecnologia (Cenargen), com auxlio financeiro do CNPq e
CAPES.





























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Agradecimentos

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Talvez este seja o momento mais difcil ao organizar este trabalho. Voltar
no tempo, lembrar o que se passou durante esses quatro anos...
impossvel evitar que uma espcie de filme passe pela cabea. Todos os
rostos, todos os gestos, todas as palavras, todo o esforo... A todos que de
alguma maneira participaram de cada momento, o meu sincero obrigado.
Mas, existem aqueles que no poderia deixar de mencionar. Em especial
agradeo:
minha querida orientadora Prof Dra Claudia Regina Bonini Domingos, que
no foi s um exemplo de profissional durante esses quatro anos de convvio,
mas um exemplo de pessoa, que no meu singelo ponto de vista, muito mais
importante. Minha chegada ao laboratrio em 2008 foi um tanto conturbada...
Foi um processo difcil e bastante confuso para mim (e acredito que para voc
tambm Claudia): mudana de orientao, laboratrio, linha de pesquisa...
Confesso que os primeiros dias foram bastante difceis, e no era para menos.
Mas, sem me conhecer, voc abriu seus braos, seu laboratrio e me adotou
como sua filha. Literalmente assim. Alm disso, aceitou minhas ideias
mirabolantes e participou comigo desse desafio. O que posso garantir que
voc, e sua famlia toda, estaro no meu corao para sempre! Obrigada por
tudo, principalmente por confiar em mim e neste trabalho! E por me ensinar
muito mais do que Cincia e Dedicao Pesquisa durante todos esses anos!
Obrigada!
Aos meus amigos, companheiros, parceiros de laboratrio, que se tornaram
meus irmos postios tartaruglos ! Meu carinho e agradecimento aos
meninos do CEQ (Centro de Estudo de Quelnios) que me receberam de braos
abertos desde o incio: Tiago Lucena, Maria Isabel Silva, Vinicius Moschetta,
e os mais novos, Jssica Bacchi, Tayrone Pereira, Nathalia Rossigalli e
Vanessa Leiko. Obrigada por todas as conversas, cientficas ou no, ajuda no
campo e no manejo dos animais - como nos divertimos nas coletas! por todos
os questionamentos levantados, enfim, por tudo! Esse trabalho tambm de
vocs! Vocs so muito importantes para mim!
Agora, meu carinho e agradecimento aos meus irmos postios do grupo dos
humanos! Edis Belini, Gisele Carrocini, Lidiane Torres, Danilo Grnig,
Jessika Okumura, Paula Zamaro, William Barberino e Isabela Chinelato!
Este trabalho tambm um pouco de cada um de vocs. Obrigada pelo auxilio a
todo o momento, me questionando, lendo os trabalhos comigo! Por darem todo o
apoio, incentivo e pelo conhecimento que cada um de vocs me transmitiram
durante esse tempo de convivncia. Sim! E no foi pouco! Deixo aqui meu
agradecimento especial a vocs, Gi e Lidi, meu trio! Vocs so especiais para
mim! Obrigada pela amizade, pelas conversas, confidncias, pelas risadas, pelas

Agradecimentos

festinhas (que no foram poucas!), pelas hospedagens na Delta-Dado... Enfim,

por participarem de um modo especial de todos os momentos bons e no muito
bons durante esse tempo e por terem sido amigas de verdade. Amo vocs!
Apesar de mais novos no laboratrio, no me esqueci de vocs: Mariana,
Vanessa, Barbara, Renan, Giovana, Marina e Cristina. Obrigada por tudo.
Agradeo tambm ao CNPq (Conselho Nacional de Pesquisa e Tecnologia) pela
concesso de bolsa de estudo.
Ao Instituto de Biocincias, Letras e Cincias Exatas, por ter me acolhido por
todos esses anos, desde a graduao.
minha coorientadora Prof Dr Dbora Aparecida Pires de Campos Zuccari
por ter se mostrado to solcita durante todos esses anos.
Agradeo tambm Prof. Dr. Eduardo Alves de Almeida pela colaborao
fundamental para as anlises ecotoxicolgicas realizadas neste estudo. Seu
apoio foi fundamental, desde ensinar a usar os equipamentos, at a discusso
dos resultados. Em especial, menciono minhas amigas Aline Rodrigues e Lilian
Nogueira, que so parceiras desde o perodo da graduao e que foram
fundamentais nos experimentos realizados.
Ao Laboratrio de Gentica Animal (EMBRAPA/CENARGEN), em especial, ao
Prof. Dr. Samuel Rezende Paiva, por ter me recebido to prontamente em seu
laboratrio. Aos colegas de laboratrio Elisabete, Santuza, Naiara, Caio, Lilian
e Carol pela ajuda na genotipagem, pelas conversas, risadas e apoio, mesmo
quando o tudo estava dando errado (raio de ROX!). Obrigada! Em especial,
agradeo a voc, Elisabete pelo auxlio na genotipagem e pela ajuda
incalculvel com a anlise dos dados. Obrigada pela disposio e auxiliar na
discusso dos resultados.
minha mais do que querida amiga, quase-irm, Dr Patricia Ianella. Obrigada
por ter me recebido durante dois meses em sua casa para realizao da
genotipagem dos microssatlites! Sem seu apoio parte deste trabalho no
poderia ter sido concludo! Menciono aqui tambm Dr. Alexandre Caetano que
teve contribuio fundamental para que estes experimentos fossem realizados.
No me esqueci de vocs: Dayane (Daya), Guilherme Scagion (Gui), Kamila
(ComK), Ariela (Babuna), Lucas (Retalho), Guilherme Sabino (Gui) e
Luciane (Lu). Vocs so especiais e se tornaram queridos! Fao um
agradecimento especial a voc, Daya, pela ateno, carinho, reciprocidade,
queijos, tortas, macarronadas, almoos e tudo mais que voc fez por mim
durante esse tempo! Vocs so minhas coisinhas!
Aos meus queridos amigos de graduao, que mesmo longe (em outros pases,
em outros planetas), estavam perto durante todo o tempo: Aline, Viviani,
Daniele, Fernanda, Anita, Thiago, Cadu, Z, Paula, Karla e Gabriela! Sou
muito orgulhosa de cada um de vocs e do que conquistaram!

Agradecimentos

Minha famlia: Orlando, Teresa, Bruna e Beatris. Meu refgio, meu exemplo de
amor, de respeito, de dedicao, de verdade. Obrigada pelo apoio incondicional
e por apoiarem todas as minhas decises, sempre com muito amor e muito
conselho. Vocs so os meus exemplos para tudo, e este trabalho tanto meu
quanto de vocs. Meu amor incondicional. Para sempre.
A Deus. Durante toda a minha vida eu vi tua mo me dirigindo, me auxiliando,
abenoando, repreendendo, ouvindo meus pedidos e confortando meu corao
nos momentos mais difceis. S posso agradecer. O Senhor a minha fora e
o meu escudo; nele confiou o meu corao, e fui socorrido: pelo que meu
corao salta de prazer e com o meu canto o louvarei (Salmo 28:7).


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RESUMO

VENANCIO,
L.P.R.
Cgado-de-barbelas
(Phrynops
geoffroanus
(Schweigger, 1812), Testudines: Chelidae) como modelo para
ecotoxicologia evolutiva: relacionamento entre contaminao ambiental,
condio e variabilidade gentica. So Jos do Rio Preto, 2012, 158p. Tese
de Doutorado Programa de Ps-Graduao em Gentica Instituto de
Biocincias, Letras e Cincias Exatas, Universidade Estadual Paulista
Jlio de Mesquita Filho.

O objetivo deste estudo foi avaliar o papel da influncia da atividade humana,

como a contaminao ambiental e modificaes do hbitat, como direcionadores
de mudanas fisiolgicas, bioqumicas e de diversidade gentica entre
populaes de cgado-de-barbelas em uma das bacias hidrogrficas mais
impactadas do sudeste brasileiro. A fim de analisar o impacto da contaminao
qumica e orgnica na espcie de estudo, foram realizadas anlises
ecotoxicolgicas visando avaliar a ao de alguns dos principais componentes
envolvidos com a proteo ao estresse oxidativo e metabolismo de detoxificao
de fase I e II, e capacidade antioxidante. Os resultados indicam a influncia de
efluentes domsticos e industriais no metabolismo de detoxificao e estresse
oxidativo. No entanto, apesar do aumento da atividade EROD e o efeito da
atividade da GST, os valores mdios de GST na rea urbana esto dentro
daqueles esperados em condio de hipxia descritos na literatura. Esta
observao sugere que o aumento da GST em resposta produo de ERO
pela presena de poluentes, aumenta a rede de defesa antioxidante, controlando
os danos oxidativos causados pela hipxia e pela reperfuso. Com o intuito de
estimar a condio, que reflete a aptido (fitness) individual do animal, foi
avaliada a relao matemtica entre peso e comprimento, que indicam
alteraes na forma do corpo e no incremento em peso, que permitem
inferncias sobre a sade e o bem-estar animal. Os dados gerados informam
diferenas em condio que esto associadas rea de avaliao, mas tambm
ao sexo e perodo reprodutivo, e gradiente de contaminao indicando forte
influncia de estressores ambientais na fisiologia dos espcimes analisados. A
partir da avaliao da estrutura gentica entre populaes do rio Preto e do
crrego Felicidade, baseada em microssatlites, constatou-se que no h
diferenciao gentica, devido ao extenso fluxo gnico entre elas e elevada
diversidade gentica. Contudo, com a anlise de estruturao intrapopulacional,
observa-se a existncia de cinco agrupamentos genticos, que reflete as
alteraes no hbitat gerados pelo represamento e assoreamento nas reas
estudadas, que esto iniciando processos de separao (barreira) de subpopulaes existentes. Com o intuito de avaliar a relao entre as informaes
geradas pelos dados bioqumicos, fator de condio e diversidade gentica, foi
realizado anlise de correlao heterozigosidade-fitness. A relao negativa

observada pode ser explicada pelo perfil de mudanas estruturais e ecolgicas

nas populaes estudadas, indicando a influncia do homem na biologia de
populaes naturais. Portanto, P. geoffroanus apresenta adaptao
contaminao ambiental, mas modificaes ecolgicas e possvel perda do
hbitat esto alterando a diversidade gentica das populaes estudadas. Este
o primeiro trabalho avaliando estes aspectos concomitantemente em populaes
naturais, endmicas do Brasil, e utilizando como objeto de estudo a espcie
Phrynops geoffroanus.

Palavras-chave: Phrynops geoffroanus; ecotoxicologia; fator de condio;

gentica de populaes; correlao heterozigosidade-fitness; alteraes
ambientais.

ABSTRACT

VENANCIO, L.P.R. Geoffroys side-necked turtle (Phrynops geoffroanus,

(Schweigger, 1812) Testudines: Chelidae) as a model for evolutionary
ecotoxicology: relationship between environmental contamination,
condition and genetic variability. So Jos do Rio Preto, 2012, 158p. Tese
de Doutorado Programa de Ps-Graduao em Gentica Instituto de
Biocincias, Letras e Cincias Exatas, Universidade Estadual Paulista
Jlio de Mesquita Filho.

The objective of this study was to evaluate the role of human activity influence,
such as environmental contamination and habitat changes as drivers for
changing physiological, biochemical, and genetic diversity among Geoffroys
side-necked turtle populations in one of the most impacted watersheds in
southeastern Brazil. In order to analyze the impact of chemical an d organic
contamination, ecotoxicological analyses were performed to assess the action of
some of the major components involved in oxidative stress protection and phase I
and II of metabolism detoxification, and antioxidant capacity. The results indicate
the influence of domestic and industrial effluents in detoxification metabolism and
oxidative stress. However, in spite of increased activity and effect of EROD
activity of GST, GST-average values in the urban area conform with those
expected in hypoxia condition in the literature. This observation suggests that
increased GST in response to the ROS production by the presence of pollutants
increases the antioxidant defense network, controlling the oxidative damage
caused by hypoxia and reperfusion. In order to estimate the condition, which
reflects the individual ability (fitness), we evaluated the mathematical relationship
between weight and length, indicating that changes in body shape and weight
increase, allowing inferences about the health and well animal welfare. The data
generated indicate differences in conditions that are associated with the area, but
also with sex and reproductive period, and contamination gradient indicating
strong influence of environmental stressors on the physiology of the specimens.
From the evaluation of genetic structure among populations of the Preto River
and Felicidade Stream, based on microsatellites, we found that there is no
genetic differentiation, due to extensive gene flow between areas and high
genetic diversity. However, with the analysis of intrapopulation structure, we
observe the existence of five genetic groups, which reflects changes in habitat
created by the damming and siltation, which are initiating separation processes
(barrier) of sub-populations. In order to evaluate the relationship between the
data generated by the biochemical data, condition factor and genetic diversity,
analysis of heterozygosity-fitness correlation was performed. The negative
relationship observed may be explained by the profile of structural and ecological

changes in the populations studied, indicating the important influence of man the
natural population biology. Therefore, P. geoffroanus shows adaptation to
environmental contamination and ecological changes and possible loss of habitat
are altering the genetic diversity of populations studied. This is the first study
evaluating all Phrynops geoffroanus these aspects simultaneously in natural
populations in Brazil, using as an object of study.
Key-words: Phrynops geoffroanus; ecotoxicology; condition factor; population
genetics; Heterozigosity-Fitness correlation; environmental changes.

Sumrio

INTRODUO GERAL............................................................................. 14

OBJETIVOS...............................................................................................20

CAPTULO 1.............................................................................................. 21

CAPTULO 2.............................................................................................. 58

CAPTULO 3.............................................................................................. 92

CAPITULO 4.............................................................................................. 116

DISCUSSO GERAL.................................................................................137

CONCLUSES.......................................................................................... 146

REFERNCIAS..........................................................................................148

ANEXOS.................................................................................................... 156

Introduo Geral

I.

Avaliao do impacto ambiental: do indivduo populaes

A ocupao desordenada e a ao humana em reas naturais

ocorrem em taxas aceleradas no mundo todo, mudando a estrutura fsica e
processos ecolgicos de hbitats originais (MARZLUFF, 2001). A perda de
hbitat, mudanas climticas, espcies invasoras, sobrexplorao e poluentes
ambientais so os elementos chave a atuam de modo sinergstico direcionando
os eventos de extino (FRANKHAM et al., 2008; KUUSSAARI et al., 2009). O
impacto do aumento de populaes humanas e suas atividades so percebidos
na depleo da biodiversidade e variabilidade gentica em populaes naturais
(VITUOSEK et al., 1997).
Biodiversidade pode ser definida como o nmero, variedade e
variabilidade de organismos dentro de uma escala temporal e espacial, incluindo
txons superiores (gneros, famlias, etc.), espcies, populaes, subpopulaes, indivduos e genes. A interrupo do equilbrio gentico em um
desses nveis influencia diretamente no declnio da diversidade, podendo
resultar na extino de espcies (BICKHAM et al., 2000).
Sabe-se que a sociedade humana dependente do ambiente e
que a degradao ambiental continuada ameaa qualidade de vida. Essa
recente

preocupao

baseia-se

no

efeito

potencialmente

crnico

da

contaminao ambiental entre geraes (BICKHAM et al., 2000). Embora a

ligao direta entre efeitos ecolgicos e sade humana seja difcil de
estabelecer, o uso de espcies animais como sentinelas de problemas
ambientais mostra-se importante para esta conexo (COLBORN, 1994). Como
os sistemas biolgicos so os alvos para a ao de contaminantes ambientais,
espcies sentinelas fornecem informaes importantes que no so facilmente
disponveis a partir de anlises qumicas de amostras ambientais, e assim,
poderiam ser utilizadas como ferramentas de diagnstico para manejo ambiental
integrado (JHA et al., 2000).
Para avaliar o impacto de cada poluente na qualidade
ambiental pertinente a realizao de estudos de seus efeitos deletrios nos
ecossistemas (WELLS et al., 2001). Nesse contexto, o uso de biomarcadores,
analisados em nvel molecular e celular, so de grande importncia como

Introduo Geral

instrumento para anlise de efeitos biolgicos para avaliao da qualidade

ambiental (LA TORRE FERNANDO et al., 2005; SARKAR et al., 2006). Como
biomarcadores, entende-se a medida de fludos corporais, clulas ou tecidos que
indicam, em termos bioqumicos ou celulares, a presena de contaminantes no
organismo (BODIN et al., 2004). H biomarcadores moleculares, celulares e at
animais inteiros, sendo alguns poluente-especficos e outros que sofrem
alteraes em resposta a estresse natural ou causado por poluentes (PFEIFER
et al., 2005).
Em estudos de problemas intensivos de poluio de animais,
um

grupo

de

biomarcadores tem

recebido especial

ateno

para

biomonitoramento de impacto de poluentes, como por exemplo, anlise de

enzimas de detoxificao de fase I (citocromo P450) e de fase II (glutationa Stransferase, GST), alm de esterases, como acetilcolinesterase (SARKAR et al.,
2006). Esses biomarcadores so de grande significncia para avaliar a
exposio e efeitos de diferentes contaminantes (metais, xenobiticos orgnicos
e compostos organometlicos) e podem ser medidos usando diferentes anlises
moleculares (ROSS et al., 2002). Por meio desses biomarcadores possvel
avaliar a que poluente o organismo foi exposto e/ou magnitude da resposta do
organismo aos poluentes (SARKAR et al., 2006).
ndices morfomtricos tambm so extensamente utilizados
para avaliao fisiolgica do impacto da contaminao ambiental sobre uma
populao. Estressores ambientais podem alterar parmetros fisiolgicos e
bioqumicos

das

espcies,

incluindo

ndices

morfomtricos,

respostas

antioxidantes e parmetros metablicos energticos (LI et al., 2009). Um

parmetro extensivamente utilizado o fator de condio que indica o bemestar animal em relao ao hbitat. Para comparar espcies de diferentes
tamanhos, o fator de condio foi considerado o melhor ndice (BOLGER;
CONNOLY, 1989). De acordo com esses autores, mudanas no fator de
condio, baseado na relao peso-comprimento reflete alteraes sazonais no
balano metablico e padres de maturao. O fator de condio, portanto,
mostra-se um bom indicador do fitness de uma populao.
No

entanto,

os

efeitos

somticos

apresentam

relativa

importncia em toxicologia animal, por causa da conservao e manejo desses

Introduo Geral

animais e do ecossistema. Deste modo, estudos com foco em populaes

mostram-se muito importantes. Embora a sade de um organismo seja um
importante indcio para a natureza do estresse experimentado por uma
populao, o mais profundo efeito ambiental ocorre em nveis maiores de
organizao, como populaes e comunidades (BICKHAM; SMOLEN, 1994;
BELFIORE; ANDERSON, 1998; BICKHAM et al., 2000).
Em condies naturais, ou seja, ausncia de influncias
antropognicas, frequncias allicas dentro de uma populao, flutuam com o
tempo de acordo com processos estocsticos (deriva), migrao e/ou presso de
seleo ambiental, como mudanas climticas ou de hbitat. Entretanto, vrias
perturbaes em uma curta escala temporal, como a poluio causada pelo
homem, pode diminuir a condio e a variabilidade gentica, reduzindo a
viabilidade (fitness) de populaes naturais (MAES et al., 2005), por fixao de
alelos deletrios. Sendo assim, a suscetibilidade ao estresse ambiental aumenta,
enfraquecendo a sobrevivncia das espcies (STANTON et al., 2000; MAES et
al., 2005).
Deste modo, poluentes podem mostrar seus efeitos txicos em
nvel molecular, mas tambm iniciam uma cascata de respostas em nveis
superiores, nos tecidos e sade geral do organismo (efeito somtico),
reproduo, demografia populacional (efeito ecolgico), gentica de populaes,
e finalmente, processos evolutivos (efeito evolutivo) incluindo, nos casos mais
drsticos, a extino (BICKHAM et al., 2000; MEDINA et al., 2007; JHA, 2008).
O desenvolvimento de tecnologias de DNA, principalmente
aps a descoberta da reao em cadeia da polimerase (PCR), tem aumentado
as oportunidades de estudos do efeito da variao gentica como um fator de
seleo, resistncia e viabilidade de indivduos e populaes (BROWN et al.,
2001).
Abordagens moleculares oferecem potencial para acessar a
composio gentica de populaes e permitir estudos correlacionando gentica
de populaes e exposio contaminantes ambientais (STATON et al., 2001).
Os enfoques empregados para medir a variao gentica so selecionados
baseando-se na necessidade do nvel de diversidade allica a ser analisada.
Quando altos nveis de variao gentica, ou seja, extenso polimorfismo so

Introduo Geral

necessrios, estratgias como AFLP (amplified fragment length polymorphism),

RAPD (random amplified polymorphic DNA), anlise de seqncias da regio
controle de mtDNA e DNA microssatlite so utilizados (BROWN et al., 2001).
Microssatlites so particularmente variveis e apresentam alto grau de
polimorfismo identificado de modo satisfatrio dentro de vrios txons (HUGHS;
QUELLER, 1993).
Microssatlites so repeties em tandem de di-, tri-, tetra-,
penta- e hexanucleotdeo, amplamente distribudas no genoma eucarioto e
procarioto (KANDPAL et al., 1994; TTH et al., 2000; ZANE et al., 2002;
ELLEGREN, 2004). Os microssatlites esto entre os mais versteis marcadores
moleculares devido a sua natureza altamente polimrfica, modo codominante de
herana, fcil identificao, abundante distribuio no genoma e fcil utilizao
em experimento envolvendo PCR (BARKER et al., 1997; KIM et al., 2004).
Devido alta variabilidade e rpida evoluo desses elementos
genticos, os microssatlites mostram-se interessantes para estudos de
diferenciao entre populaes relacionadas e mudanas recentes ou rpidas
em variabilidade gentica dentro de uma populao, como aquelas causadas por
contaminantes ambientais (ELLEGREN et al., 1997).
Outra vantagem dos microssatlites a possibilidade de avaliar
mltiplos locos, aumentando a chance de detectar e observar eventos
mutacionais.

Esta

vantagem

pode

ser

particularmente

importante

no

monitoramento de ambientes poludos onde o tamanho amostral limitado por

causa da pequena rea envolvida ou do perigo de extino de alguns
organismos. Pelo aumento do nmero de locos, o tamanho amostral
indiretamente aumentado, enquanto limita o impacto da amostragem na
populao (BICHKAM et al., 2000). Esses marcadores, portanto, mostram-se
como uma ferramenta importante para avaliar a plasticidade e composio
gentica que se apresentam como um fator determinante para o sucesso de
esforos em conservao e restaurao.
Finalmente, o uso de biomarcadores para identificar efeitos
somticos pode ser empregado em conjunto com estudos de gentica de
populaes, fornecendo uma conexo convincente entre os efeitos de

Introduo Geral

contaminantes em mltiplos nveis de organizao biolgica (BICKHAM;

SMOLEN, 1994; PRETTI; COGNETTI-VARRIALE, 2001).

II.

Phrynops geoffroanus como modelo para estudos ecotoxicolgicos

evolutivos

O Brasil possui a fauna e a flora mais ricas de toda a Amrica

Central e Sul. No entanto, informaes para muitas das espcies, principalmente
no que diz respeito aos rpteis, ainda so preliminares (RODRIGUES, 2005).
Possui 732 espcies de rpteis, sendo seis espcies de jacars, 67 anfisbnia,
248 lagartos, 375 serpentes e 36 quelnios. Atualmente, o Brasil ocupa a
segunda colocao na relao de pases com maior riqueza de espcies de
rpteis, atrs da Austrlia (SOCIEDADE BRASILEIRA DE HERPETOLOGIA,
2011).
Entre os rpteis, a ordem Testudines mostra elevada
importncia

no

contexto

ecotoxicolgico.

Representantes

deste

grupo

apresentam-se teis como indicadores de contaminao qumica e radioativa,

nos ecossistemas aquticos e terrestres, em programas de monitoramento, por
apresentarem ampla distribuio geogrfica e serem encontrados em uma
grande variedade de hbitats, alm de possurem vida longa (MEYERSSCHNE; WALTON, 1994).
A ordem Testudines constituda por 322 espcies de
tartarugas, cgados e jabutis (TTGW, 2011) e est subdividida em duas subordens: Cryptodira (cripto: escondido; dire: pescoo), animais que retraem a
cabea horizontalmente para dentro do casco, dividida em trs superfamlias:
Testudinoidea, Trionychoidea e Chelonoidea. A outra subordem chamada de
Pleurodira (pleuro: lado), que retraem a cabea e o pescoo lateralmente,
dividida em duas famlias: Chelidae e Pelomedusidae encontrados apenas no
Hemisfrio Sul (POUGH et al., 2003).
MCCORD et al., 2001 adjetiva a histria taxonmica dos
Pleurodira do Novo Mundo como no mnimo turbulenta. Phrynops (senso latu)
um gnero de quelnio endmico da Amrica do Sul, que inclui espcies de

Introduo Geral

cgados cujo interrelacionamento incerto. Dentro deste grupo, a espcie

Phrynops geoffroanus, popularmente conhecida como cgado-de-barbelas, tem
ampla distribuio geogrfica, ocorrendo na Amrica do Sul a leste dos Andes,
desde a Colmbia at a Argentina (Missiones) (LEMA; FERREIRA, 1990).
Segundo Pritchard e Trebbau (1984), esta espcie parece habitar mais
frequentemente lagoas e riachos a rios de maior volume. Outra observao
interessante que Phrynops geoffroanus pode ser encontrado em rios poludos
que atravessam algumas cidades brasileiras (BRITES, 2002; FERRONATO,
2008; PIA et al., 2009). Esta espcie vista com frequncia, em concentraes
de indivduos em alguns pontos, principalmente nas reas mais urbanizadas com
a presena de esgotos domsticos e industriais. A concentrao desta espcie
nestas reas parece estar relacionada a abundancia de alimentos provenientes
dos esgotos e de outras fontes (BRITES, 2002).
Apesar do registro na literatura da concentrao desta espcie
em reas afetadas por influncia antropognica, no existem estudos avaliando
biomarcadores para anlise de estresse ambiental e a influncia deste fator na
histria evolutiva dessa espcie. Alm disso, h registros escassos sobre a
arquitetura gentica da espcie em questo. O conhecimento sobre marcadores
nucleares, em especial microssatlites, permite a identificao de unidades de
conservao e manejo, diferenas no comportamento migratrio de macho e
fmeas e comportamento sexual (BOWEN et al., 2005; JENSEN et al., 2006).

Baseando-se no fato de que Phrynops geoffraonus uma

espcie que ocorre com certa frequncia em reas impactadas por
poluio gerada por esgoto domstico e industrial, avaliar a ao desses
contaminantes em nvel bioqumico, fisiolgico e da influncia dos
mesmos na diversidade gentica desta espcie, mostra-se de grande
importncia no somente para quelnios de forma geral, mas tambm
para toda a comunidade associada a esses ambientes impactados,
inclusive para a manuteno de mananciais para benefcio humano.

Objetivos

Este trabalho teve como objetivo principal avaliar os

efeitos de contaminantes originados por atuao antrpica (despejo de
lixo orgnico e industrial) e suas influncias nas mudanas evolutivas por
padres de diversidade gentica em populao de Phrynops geoffroanus
existentes no Rio Preto e seu afluente Crrego Felicidade, localizados na
bacia hidrogrfica Turvo/Grande. Esta bacia considerada a mais
degradada e poluda do estado de So Paulo.

Os objetivos especficos foram:

A) Avaliar sistemas relacionados com a biotransformao de xenobiticos,
metais e compostos organometlicos de fase I (atividade EROD) e fase II
(atividade da GST), capacidade antioxidantes (G6PDH) e avaliar a
atividade

da

esterase

acetilcolinesterase

(AChE)

em

Phrynops

geoffroanus, como biomarcadores sensveis a contaminao;

B) Avaliar a condio dos animais coletados por meio da anlise do

fator de condio, baseando-se em dados de peso e comprimento
como ferramenta para averiguao da condio fisiolgica e bemestar dos animais capturados em ambiente controle e urbano;

C) Realizar anlise de diversidade populacional com a finalidade de

realizar um estudo de estrutura populacional e gentica de
populaes;

D) Estimar parmetros de relao dos dados observados pela anlise

de

biomarcadores

variabilidade

gentica

(correlao

heterozigosidade-fitness) como um primeiro estudo ecotoxicolgico

evolutivo para uma espcie endmica da Amrica do Sul e
especificamente para a espcie Phrynops geoffroanus.


Captulo 1

Pollution-induced metabolic responses in hypoxia-tolerant freshwater

turtles

Larissa Paola Rodrigues Venancio1, Maria Isabel Afonso da Silva1, Tiago Lucena
da Silva1, Vinicius Augusto Gobbe Moschetta1, Dbora Aparecida Pires de
Campos Zuccari2, Eduardo Alves de Almeida3, Claudia Regina Bonini-Domingos1
1

Departamento de Biologia, Centro de Estudo de Quelnios (CEQ) e Laboratrio

de Hemoglobinas e Gentica das Doenas Hematolgicas (LHGDH), IBILCE,
UNESP;
2
Faculdade de Medicina de So Jos do Rio Preto, FAMERP, So Jos do Rio
Preto,
3
Departamento de Qumica e Cincias Ambientais, Laboratrio de
Biomarcadores de Contaminao Ambiental (LABCA), IBILCE, UNESP.

*Artigo submetido revista indexada Environmental Science and Technology

Captulo 1

Captulo 1

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Captulo 1

Captulo 1

Captulo 1

Captulo 1

Captulo 2

Influncia da contaminao e modificao ambiental em Phrynops

geoffroanus (Schweigger 1812) evidenciado pela avaliao da condio.
Larissa Paola Rodrigues Venancio1*, Tiago Lucena da Silva1, Maria Isabel
Afonso da Silva1, Vinicius Augusto Gobbe Moschetta1, Jessica Basilio Bacchi2,
Tayrone Luis Coltro1, Nathalia Rossigalli Alves Costa1, Claudia Regina BoniniDomingos1.

Departamento de Biologia, Universidade Estadual Paulista (Unesp), Instituto de

Biocincias, Letras e Cincias Exatas (Ibilce), So Jos do Rio Preto, So Paulo,
Brasil.
2
Departamento de Qumica e Cincias Ambientais, Universidade Estadual
Paulista (Unesp), Instituto de Biocincias, Letras e Cincias Exatas (Ibilce), So
Jos do Rio Preto, So Paulo, Brasil.
*Correspondncia: larissa_biorp@yahoo.com.br

Resumo

1. Estressores ambientais como a contaminao por efluentes domsticos e

industriais podem influenciar a taxa de sobrevivncia de indivduos e de
populaes inteiras pela alterao na magnitude das reservas energticas, e por
sua vez a dinmica reprodutiva da espcie.
2. Este estudo avaliou a influncia da degradao ambiental, por meio do ndice
de condio de espcimes de Phrynops geoffroanus, um quelnio de gua doce
sul-americano. anlise do fator de condio, foram associadas avaliaes de
abiticos como pluviosidade e temperatura do ar, alm de fatores como sexo e
perodo reprodutivo.
3. Baseando-se em dados de peso e comprimento durante quatro anos e trs
reas de estudo, avaliou-se 1) se alteraes ambientais modificam a condio
dos animais, baseando-se na comparao com animais de ambiente controle; 2)
se h diferena na condio entre os sexos nos trs ambientes; 3) se a condio

Captulo 2

foi alterada em relao ao perodo de reproduo; 4) se h relao dos valores

do fator de condio com a temperatura do ar e pluviosidade.
4. A anlise dos dados sugere que existe influncia do ambiente na condio
destes animais e que est associado a um gradiente de contaminao,
apresentando piores condies na rea mais impactada. O perodo reprodutivo
foi um fator importante para alteraes da condio nos ambientes avaliados; no
entanto, na rea mais contaminada, esta relao foi menos clara, indicando que
as alteraes deste ambiente podem exercer maior influncia sobre a fisiologia
dos animais. Alm disso, houve relao da pluviosidade e temperatura do ar com
a condio das fmeas, principalmente s do ambiente controle, sugerindo, que
em condies controladas, a reproduo e as mudanas nos nveis de umidade
e temperatura refletem significativamente sobre a condio.
5. Os resultados deste estudo sugerem influncia de estressores ambientais
sobre a condio de P.geoffroanus e indicam a necessidade de ateno e
monitoramente das reas de ocorrncia da espcie, em especial quelas
alteradas pelo homem, visto que existe pouca informao a respeito da biologia
desta espcie pertencente a um grupo taxonmico de histria natural e evolutiva
controversa.

Palavras-chave: condio, contaminao aqutica, estao chuvosa e seca,

perodo reprodutivo, Phrynops geoffroanus

Introduo

A ocupao desordenada de reas naturais ocorre em taxas

aceleradas no mundo todo, mudando a estrutura fsica e processos ecolgicos
de hbitat originais (Marzluff 2001). Os efeitos biolgicos da poluio e o impacto
antropognico em sistemas aquticos brasileiros so pouco avaliados, apesar da
importncia do Brasil no cenrio mundial em relao sua riqueza natural. O
Brasil possui a fauna e flora mais rica do mundo, com cerca de 1,8 milhes de
espcies, e est em segundo lugar no que diz respeito riqueza de espcies de
rpteis (Brnilis 2011) incluindo rpteis, ainda so preliminares (Rodrigues,
2005).


Captulo 2

O cgado sul-americano, Phrynops geoffroanus (Schweigger

1812), conhecido popularmente como cgado-de-barbelas, apresenta uma
ampla distribuio geogrfica, abrangendo desde a Amaznia Colombiana at
Sudeste do Brasil, Uruguai e Nordeste da Argentina (Pritchard & Trebbau 1984;
Vanzolini 1994). P. geoffroanus uma espcie integrante do chamado
Complexo Phrynops geoffroanus, que abrange espcies como P. hilarii,
P.williamsi, P.tuberosus (Rhodin & Mittermeier, 1983). Este complexo de
espcies objeto de grande controvrsia taxonmica, que ainda no foi
completamente esclarecida. Vrios autores sustentam este txon como uma
superespcie, suscetvel a ser fracionada em vrias entidades especficas; j
outros autores, sustentam que esta uma espcie politpica com vrias
subespcies diferentes (Rueda-Almonacid et al 2007). Apesar da ampla
distribuio geogrfica da espcie, estudos com interesse na histria natural so
praticamente inexistentes e, grande parte das informaes biolgicas est
relacionada com estudos de espcimes cativas (Guix et al 1989; Molina, 1989,
1996).
Alm de habitar rios e lagos de maior volume, P. geoffroanus
tambm pode ser encontrada em rios urbanos poludos por efluentes domsticos
e industriais (Souza & Abe 2001; Brites, 2002; Pia et al 2009). Por este motivo,
sugere-se que esta espcie seja resistente ao impacto da poluio ambiental,
visto que os ninhos e filhotes aparentemente apresentam morfologia e fisiologia
normais, suportando, inclusive, os maiores nveis de concentrao de metal para
rpteis descritos na literatura. No entanto, como no h o registro da escala
temporal da contaminao nestes locais, muitos dos efeitos deletrios da
contaminao ambiental podem ainda ser subclnicos, podendo levar ruptura
no sucesso reprodutivo das populaes em alguns anos (Pia et al 2009).
Estressores ambientais podem alterar parmetros fisiolgicos e
bioqumicos das espcies, incluindo respostas antioxidantes, parmetros
metablicos energticos e ndices morfomtricos (Li et al 2010). Condio um
importante determinante da aptido (fitness) individual do animal, e suas
implicaes so relevantes no contexto ecolgico (Green 2000). Em termos
gerais, condio um termo utilizado para referir-se magnitude das reservas
energticas orgnicas, que afeta a probabilidade de sobrevivncia no nvel
individual e populacional (Ardia 2006; Jennings et al 2006). Os ndices de


Captulo 2

condio corporal so utilizados para auxiliar na descrio da sade e do bemestar de vrias espcies selvagens (Stevenson & Woods 2006), definir a
influncia de fatores como a degradao ambiental, parmetros da histria de
vida e interaes ecolgicas na sade animal (Stevenson & Woods 2006).
Mudanas na condio resultam de alteraes na composio
bioqumica tecidual e mobilizao de reservas energticas, podendo ser
relacionado com as estaes do ano, perodos de vida, reproduo, sade e
exposio a estressores (Barton et al 2002). Sendo assim, o sucesso
reprodutivo, e, portanto, a dinmica populacional depende da condio dos
organismos (Stevenson & Woods, 2006; Labrada-Martagn et al 2010). Deste
modo, entender as causas da variao na condio permite avaliar e predizer
variaes demogrficas, bem como a habilidade de uma populao em
responder a estressores ambientais (Sandeman et al 2008). A avaliao da
condio baseia-se na relao entre massa corporal e medidas lineares do
tamanho do corpo (Green 2001). No h informaes na literatura sobre ndices
de condio em cgados e tartarugas de gua doce, mas apenas para
tartarugas marinhas (Labrada-Martagn 2010) e tartarugas terrestres (Hailey
2000).
Assim, justifica-se avaliar a condio de espcimes de P.
geoffroanus que habitam ambientes impactados pelo homem, e tais dados
podem indicar alteraes subclnicas que afetariam diretamente a aptido
(fitness) das populaes impactadas. O objetivo deste estudo foi avaliar o ndice
de condio de P. geoffroanus de ambientes contaminados por efluentes
domsticos e industriais em relao a animais de ambiente controlado, alm das
possveis diferenas neste parmetro em relao ao sexo e perodo reprodutivo,
associados inclusive, com fatores abiticos como precipitao, temperatura do ar
e estao (chuvosa e seca). A condio foi avaliada por meio da utilizao de
dados de peso e comprimento, a fim de averiguar a sade e bem-estar destes
animais como elemento importante na determinao da aptido das populaes
estudadas.
Material e Mtodo

REA DE ESTUDO


Captulo 2

Durante os anos de 2008 a 2011, espcimes de P.

geoffroanus foram capturados em trs reas, da Bacia Hidrogrfica do
Turvo/Grande, regio Noroeste do estado de So Paulo (Sudeste do Brasil)
(Figura 1a). Duas reas de coleta localizam-se no permetro urbano da cidade de
So Jos do Rio Preto - SP, e so elas: Crrego Felicidade (CF) (204625.99S,
492117.63O) e rio Preto (RP) (204831.86S, 492227.61O). Esta cidade
situa-se a 489 m acima do nvel do mar; possui clima tropical de altitude, que
indica inverno seco e ameno, com mdia de temperatura anual de 25,33C.
Durante o ano, a temperatura mnima mdia de 17C, a mxima mdia
30,4C e a pluviosidade mdia anual 1259,1mm. As estaes do ano no so
bem definidas como nas regies temperadas; mas as caractersticas
meteorolgicas da rea confirmam a existncia de duas grandes estaes: uma
chuvosa, de outubro a maro, e outra seca, de abril a setembro (Barbieri, Rao &
Franchito 2010). Os dados meteorolgicos utilizados referem-se mdia mensal
de temperatura do ar e pluviosidade dentro do perodo de estudo. A cidade
dividida fisicamente pelo rio Preto e seus tributrios, sendo o crrego Felicidade
um deles (Figura 1b). O rio Preto possui aproximadamente 120 km de extenso,
e tributrio do rio Turvo, que desgua no rio Grande (Bacia Turvo/Grande)
(20). Com aproximadamente 450 mil habitantes, a cidade fonte constante de
poluio aqutica derivadas de resduos agrcolas gerados pela cultura da canade-acar e curtumes nos nove crregos que atravessam a cidade (Zago et al
2010).

A)
B)

Figura 1. Mapas de localizao da Bacia Hidrogrfica do Turvo/Grande e da cidade de So Jos do Rio Preto. A) Mapa do estado de So Paulo
e da Bacia, com destaque para a regio da cidade de So Jos do Rio Preto SP. B) Mapa da cidade de S. J. Rio Preto, com indicao dos
pontos de coleta. O ponto 1 refere-se ao crrego Felicidade (204625.99S, 492117.63O) e o ponto 2 refere-se ao rio Preto (204831.86S,
492227.61O) (Mapa da cidade adaptado de Whitacker 2007 e mapa da bacia adaptado de Comit da Bacia Hidrogrfica Turvo/Grande 2010).

Captulo 2

A terceira rea de coleta refere-se ao criatrio comercial de

animais silvestres e exticos Reginaldo Uvo Leone, na cidade de Tabapu
SP (204620.6S, 492118.9W), onde foram coletados os animais controle do
estudo (AC-ambiente controle). Os animais eram alimentados com rao de
peixe (45% de protena), e mantidos em lagos artificiais abastecidos com gua
de poos artesianos.

CAPTURA DE ANIMAIS, SEXAGEM E MORFOMETRIA

Captura e Morfometria - Para captura dos animais, foi utilizada uma armadilha
cilindrica tipo covo, medindo 150X60 cm. As armadilhas foram presas por
arame galvanizado em rvores nas margens do rio e dos crregos, e em seu
interior, foram colocadas iscas (carne bovina e peixe) presas por ganchos de
arame galvanizado. Para todos os espcimes coletados foram tomadas duas
medidas: o comprimento curvilneo mximo da carapaa (CCCmx), em
centmetros, do ponto anterior mdio do escudo nucal at a extremidade
posterior dos escudos supracaudais (Wyneken 2001), com auxlio de uma trena
(0,1mm); e a massa corporal em gramas, utilizando balana com escala (10g10Kg).
As atividades de coleta dos espcimes foram autorizadas e
aprovadas pelo IBAMA/ICMBio (registro 2838725/n 16488-1, n16488-2, 164883) e pela comisso de tica em Experimentao Animal (CEEA) da Faculdade
de Medicina de So Jos do Rio Preto (FAMERP) (Protocolo FAMERP n
5517/2008).

Sexagem - Os espcimes coletados foram caracterizados quanto ao sexo por

meio de avaliao do tamanho da cauda, abertura da placa anal e concavidade
do plastro (Molina 1989).
Todos os espcimes capturados no rio e nos crregos foram
marcados por perfuraes nos escudos marginais, que indicam a ordem
numrica e cronolgica da captura com auxlio de furadeira manual. As
perfuraes foram feitas baseando-se no primeiro escudo nucal como ponto zero
e os escudos marginais seguintes como nmero um, dois, trs e assim
sucessivamente. Para composio das dezenas e centenas, foram feitas


Captulo 2

perfuraes duplas ou triplas respectivamente, contando os escudos marginais

direitos no sentido horrio e os esquerdos no sentido anti-horrio. Estas
marcaes, como so feitas em regies sseas, no sofrem cicatrizao,
impossibilitando assim a perda da marca, no so invasivas e no atrapalham a
locomoo do animal (Figura 2).

Este o primeiro registro desse tipo de

marcao em quelnios. Em seguida, aps pesagem e sexagem, os animais

foram devolvidos ao local de coleta.

Captulo 2

1
2
3
4

1
2
3
4

6
7

7
8

8
9

Figura 2. Esquema de marcao dos animais capturados durante o estudo. A placa

nucal considerada como a placa zero. Os animais com numerao acima de 10 foram
marcados da seguinte maneira: perfurao na placa 1 nas placas marginais direitas
(sentido horrio) e o nmero 0 na placa zero; o animal nmero 11 foi marcado com uma
perfurao na placa 1 no sentido horrio e na placa 1 do sentido anti-horrio. O mesmo
processo foi feito para as centenas. As setas indicam o sentido horrio (direita) e antihorrio (esquerda). A faixa branca indica a rea de medida do comprimento curvilnio
mximo da carapaa (CCCmax) (Foto de Luiz Dino Vizotto).

Captulo 2

Os

animais

capturados

foram

agrupados

conforme

as

indicaes de Souza & Abe (2001) em relao ao perodo de reproduo da

espcie, visto que este fator de extrema importncia para avaliao do ndice
de condio. Estes autores sugerem, pela presena de ovos no oviduto, que o
perodo de nidificao ocorre de Fevereiro a Agosto. J o perodo de
acasalamento e incubao ocorre de Setembro a Janeiro, apontando para a
ocorrncia de sincronizao com a estao chuvosa (Guix et al 1989; Souza &
Abe, 2001).

ANLISE ESTATSTICA

Todas as anlises foram realizadas utilizando o programa

estatstico STATISTICA 7.0 (StatSoft). A proporo sexual foi determinada pelas
frequncias de captura de espcimes nos perodos de Fev-Ago e Set-Jan para o
total de machos e fmeas coletados por meio do teste de qui-quadrado (2).
O ndice de condio e a relao peso-comprimento foram
estabelecidos pela mensurao do peso total e comprimento total, e os
parmetros a e b foram determinados pela transformao dos dados para
log(10) (Le Cren 1951). As curvas de crescimento obtidas pela anlise de
regresso entre peso e comprimento seguiram a equao:
logPeso = log(a) + logComprimento*b,
onde logPeso

a varivel dependente, logComprimento a varivel

independente, a a constante de regresso ou grau de engorda e b o

coeficiente de regresso, que est relacionada com o tipo de crescimento dos
indivduos. A equao terica de relao peso-comprimento foi seguida por:
Peso = a*Comprimentob.
O parmetro b o exponente da forma aritmtica da relao
peso-comprimento e o declive da linha de regresso na forma logartmica. Se
b=3 (crescimento isomtrico), ento espcimes pequenos na amostra em
considerao tem a mesma forma e condio de espcies maiores. Se b>3
(crescimento alomtrico positivo), ento espcimes grandes apresentam maior
incremento em peso do que em comprimento; inversamente, se b<3
(crescimento

alomtrico

negativo),

ento

espcimes

grandes

sofreram

mudanas na forma do corpo para tornarem-se mais alongados ou espcimes



Captulo 2

pequenos esto em melhores condies nutricionais no perodo da amostragem

(Froese 2006).
Para testar as diferenas entre os parmetros das curvas
ajustadas para machos e fmeas, foram realizadas anlises de covarincia
(ANCOVA) aplicadas aos parmetros das regresses lineares do comprimento e
peso (log10).
O ndice de condio (K) foi estimado para cada espcime
coletado por meio da expresso K = Peso/Comprimentob (Le Cren, 1951), onde
b o coeficiente angular da relao peso-comprimento. Para comparao dos
valores de K entre as reas de coleta foram realizadas testes de ANOVA
complementado por Tukey (post hoc). Tambm foram realizadas anlises de
correlao de Pearson para averiguao de possvel relao da pluviosidade e
temperatura do ar (mdias mensais) com os valores de K para os sexos e rea
de coleta separadamente.
Em relao s diferenas estatisticamente significantes entre
duas amostras independentes, foram utilizados os testes t-student para dados
paramtricos, e Mann-Whitney, para no paramtricos. Para todas as anlises
realizadas foi considerado o nvel de significncia de = 0,05 e as barras de
erros dos grficos representam desvio padro para duas ou mais amostras
independentes, ou mximo e mnimo, quando as medianas foram avaliadas.
Resultados

CAPTURA E MORFOMETRIA

Na tabela 1 encontram-se detalhes das informaes descritivas

a respeito dos animais coletados no perodo de estudo separado pelas reas
avaliadas. No total, foram capturados 130 animais nas quatro reas analisadas,
sendo 80 fmeas e 50 machos. Em relao ao peso, as fmeas mostraram-se
mais pesadas (p<0,01) e com maior comprimento em relao aos machos
(p<0,05). Em relao ao peso, de maneira geral, no houve diferena entre os
ambientes (F=0,17; p=0,844); no entanto, houve diferena estatisticamente
significante no tamanho dos animais entre as reas de estudo (F=4,109;

Captulo 2

p=0,018), apresentando diferena significativa entre os machos do AC e CF (tstudent; p=0,0138).

Tabela 1. Descrio dos espcimes coletados quanto rea, sexo, nmero amostral,
peso e comprimento e relao estatstica entre peso e comprimento.

Ambiente Controle
(AC)

Nmero amostral
Mdia Peso (g)
DP

Mdia
Comprimento
(cm) DP
Comparao
estatstica entre
pesos*
Comparao
estatstica entre
comprimento*

Rio Preto
(RP)

Crrego
Felicidade
(CF)
F
M
48
25
2258,1 1616,0
25
753,9
78
973,4
77
29,077
26,62
4,249 4,235

F
11
2554,5
45472
,109

M
10
1655,00
388,308

31,064
1,988

27,890
1,757

p=0,007 (fmeas mais

pesadas)

p=0,005 (fmeas
mais pesadas)

p=0,0001 (fmeas
mais pesadas)

p=0,046 (fmeas
maiores)

p=0,021 (fmeas
maiores)

p=0,001 (fmeas
maiores)

F
21
2320,00
1018,052

M
15
1510,00
496,847

31,662
4,356

28,973
2,974

F: Fmea
M: machos
DP: desvio padro
*: teste t-student

Na Figura 3, os dados de peso total (g) foram agrupados por

classe de comprimento (cm). Observa-se que o peso dos animais aumenta em
relao ao aumento do tamanho do corpo e a ocorrncia de fmeas maiores do
que os machos principalmente nas classes de 34 a 39,9 cm corroboram dados
da literatura em que fmeas de P.geoffroanus apresentam tendncia de serem
maiores do que os machos (Gibbons & Lovich, 1990).

Captulo 2

Figura 3. Grfico da relao entre peso total (g) e classes de comprimento (cm) para as
trs reas de estudo (AC rea Controle, CF crrego Felicidade, RP rio Preto).
Observa-se que o peso do corpo aumento seguindo o padro de crescimento do corpo.
Destaca-se a ocorrncia de apenas fmeas nas classes 34 a 39,9 cm, confirmando
dados da literatura de que fmeas tendem a serem maiores do que os machos. As
barras dos grficos indicam a mdia do peso (g) desvio padro.

As propores sexuais foram calculadas para CF e RP, e no

apresentaram diferena estatisticamente significante entre a proporo de
machos e fmeas, que foi de 1,52:1 para CF (2=1.455 p=0.692), e 1,1:1 para
RP (2=1.047 p=0.3).

NDICE DE CONDIO (K)

Captulo 2

Os dados de peso e comprimento de cada espcime foram

plotados em grficos de disperso, ajustando-se os parmetros por regresso
linear pelo mtodo dos mnimos quadrados. Os animais foram agrupados para
teste das diferenas entre os parmetros das curvas ajustadas para machos e
fmeas para cada perodo de anlise, com a finalidade de verificar se havia
diferena entre os coeficientes de regresso b e o parmetro a (ANCOVA)
(Froese 2006) entre os sexos e para cada rea separadamente.
Apesar das fmeas apresentarem, em sua grande maioria,
maior peso e comprimento em relao aos machos, a anlise de covarincia
(ANCOVA) indicou que no houve diferena entre os coeficientes angulares (a) e
lineares (b) entre os sexos para CF (Fev-Ago), CF (Set-Jan) e AC (Set-Jan)
(p>0.05). Deste modo, os sexos foram agrupados para avaliao dos valores de
b. No entanto, esta mesma situao no foi encontrada para AC e RP no
perodo de Fev-Ago (p<0,05), indicando assim, a necessidade de anlise de b
para cada sexo separadamente nestes casos. A tabela 2 apresenta as
informaes referentes s anlises de regresso e valores dos coeficientes de
regresso

encontrados

em

cada

situao.

Tabela 2. Relao dos dados gerados pelas regresses lineares para cada ambiente e perodo avaliado.

Fev-Ago
a
-1,18 (F); 1,150(M)

Ambiente
controle

Crrego
Felicidade

0,963
(F/M)

-1,427 (F/M)

3,2174
(F/M)

0,9580,07 (F);
1,010,09 (M)

0,837
(F/M)

Rio Preto

0,938 (F);
0,864 (M)

-0,725 (F);
-2.157(M)

2.766 (F);
3,7132
(M)

0,1880,008 (F);
0,0070,0006 (M)

b
3,0133(F);
2,956 (M)

K
0,990,07 (F);
1,040,06(M)

(F): Fmeas
(M): Machos
b: coeficiente de regresso
a: coeficiente angular
2
R : ajuste dos pontos da reta de regresso
K: ndice de condio
*: no houve coleta de machos e fmeas neste perodo

Set-Jan
R2
a
0,686 (M)
-2,582
(M)

R2
0,935 (F);
0,857 (M)

b
3.894
(M)

K
0,7010,043

-0,811
(F/M)

2.837
(F/M)

1,162
0,09 (F);
1,20,12

Captulo 2

Com os valores de b para cada relao, o K foi calculado

para cada espcime (tabela 2). Os maiores valores de K foram encontrados em
AC seguido do CF e RP, respectivamente (Figura 4), mostrando que h
diferena entre os perodos relacionados com reproduo e entre as reas de
coleta para machos e fmeas, sugerindo influncias fisiolgicas e ambientais
sobre a condio desta espcie nas reas de estudo.

Figura 4. Comparao dos valores de K entre os trs ambientes analisados no perodo

de Fev-Ago entre machos e fmeas. Observa-se que houve diferena estatisticamente
significante somente entre RP e as outras reas (**; p<0,01), no ocorrendo entre AC e
CF, para ambos os sexos. AC: ambiente controle; CF: crrego Felicidade; RP: Rio Preto.
As barras indicam a mdia dos valores de K desvio padro.

Os valores de K mostraram diferena estatisticamente

significante entre as fmeas (AC, CF e RP) (p=0,000; F=620,796, gl=2) no

Captulo 2

perodo de Fev-Ago, no ocorrendo diferena somente entre AC e CF. Houve

diferena significante entre os machos de CF, RP e AC (p=0,000; F=763.306,
gl=2) para o perodo de Fev-Ago (Figura 5), no havendo diferena somente
entre AC e CF, como ocorreu entre as fmeas para o mesmo perodo. No foi
possvel fazer esta comparao para o perodo Set-Jan pelo fato de que o
nmero amostral de machos do ambiente controle neste perodo foi de apenas
trs espcimes.
Quando o K das fmeas so avaliados e comparados entre os
perodos, h diferena significativa para valores mdios de K CF(Fev-Ago)
versus CF (Set-Jan) (t-student; p=0,0000), sendo que o perodo com maior valor
mdio de K foi Set-Jan (Figura 5a). Este padro tambm foi encontrado para
machos quando da comparao entre os perodos em CF (Fev-Ago) versus CF
(Set-Jan) (t-student; p=0,000194), sendo o perodo de Set-Jan o de maiores
valores mdios de K, equivalente ao observado com as fmeas (Figura 5b). Nas
comparaes de valores de K entre os sexos, no foram identificadas diferenas
estatisticamente significantes entre os valores mdios de K para machos e
fmeas de CF nos perodos Fev-Ago (t-student; p=0,0753) e Set-Jan (t-student;
p=0,269).

Captulo 2

A)

B)

Figura 5. Comparao entre os valores de K de machos e fmeas entre os dois perodos

analisados. Em todas as comparaes a diferena foi estatisticamente significante
(p<0.01), sendo os valores de K maiores para ambos os sexos no perodo de Set-Jan. A)
Fmeas; B) Machos. As barras referem-se mdia dos valores de K em cada perodo
desvio padro.

Aps a plotagem dos dados de K em relao classe de

comprimento e peso, observou-se que para fmeas e machos em CF houve forte

Captulo 2

correlao inversa entre peso e tamanho no perodo de Fev-Ago, indicando que

os maiores valores de K pertencem aos animais de menor peso e tamanho
(Figura 7a) (Fmeas CF Fev/Ago comprimento: r = -0,9781; p=0,0000; peso: r
= -0.8826; p = 0,0000 e machos CF (Fev/Ago comprimento: r = -0,9729;
p=0,0000; peso: r = -0,8397, p = 0,0009). Esta relao ocorre tambm em SetJan para as fmeas (Set/Jan comprimento: r = -0,9306; p = 0,0000; peso: r = 0,7508; p = 0,0000), mas no ocorre nos machos do mesmo perodo
(comprimento: r = -0,5571; p = 0.0944) (Figura 6a). No entanto, a mesma
situao no ocorreu nos animais do RP, indicando que nestes locais no h
relao entre K, tamanho e peso (Figura 6b).

Captulo 2

A)

B)

Figura 6. Relao entre K e as classes de comprimento entre machos e fmeas. A)

Crrego Felicidade, perodo Fev-Ago e Set-Jan. Observa-se que os maiores valores de
K pertencem aos animais de menor comprimento. Alm disso, a relao inversa do K e
comprimento nos machos de Set-Jan no foi visualizada (barras cinzas - comprimento: r
= -0,5571; p = 0.0944; B) Rio Preto, perodo Fev-Ago. Observa-se que no existe
relao entre K e o comprimento em machos e fmeas nesta rea. As barras referem-se
aos valores mdios de K desvio padro.

Captulo 2

Quando anlises de correlao entre os valores de K,

pluviosidade e temperatura do ar (mdias mensais) foram realizadas, observouse correlao entre os parmetros citados em fmeas de AC para o perodo de
Fev-Ago, apresentando r = 0,575; p = 0,006 para pluviosidade mdia e r = 0,495;
p = 0,022 para temperatura do ar. Esses resultados indicam a existncia de
relao entre os fatores abiticos com os valores de K para este grupo amostral.
Avaliando as medianas de K para machos e fmeas,
separados por estao chuvosa e seca, houve diferena significante em fmeas
entre as duas estaes (Mann-Whitney; p = 0,00006); no entanto, esta diferena
no foi observada para machos (Mann-Whitney; p = 0,16) (Figura 7).

Captulo 2

Figura 7. Avaliao dos valores de K para machos e fmeas em relao ocorrncia de

estao chuvosa e seca. Observa-se que para as fmeas (barras cinza escuro) os
valores de K aumentam com o aumento da pluviosidade (*); p = 0,00006). A estao
chuvosa coincide como perodo de incubao e, portanto, liberao dos ovos da
cavidade abdominal. No entanto, esta relao no foi observada nos machos (barras
cinza claro), sugerindo que outros fatores esto associados com a condio destes
animais.

Sendo assim, a partir da anlise dos resultados, os animais de

ambiente controle apresentaram condio equivalente aos animais do crrego
Felicidade, apesar do K no ambiente controle ser numericamente maior do que o
observado nos animais do crrego. Os mais baixos ndices de condio foram
detectados nos espcimes do rio Preto, indicando que estes animais possuem
pior condio em relao aos animais de CF e de AC. Os resultados indicam
tambm que os machos de CF e de AC apresentam melhor condio do que as


Captulo 2

fmeas; no entanto, esta relao inversa para os animais do RP, indicando

que h maior alterao das condies fisiolgicas para esse sexo quando se
trata do RP. Outra informao resultante das anlises do K que os maiores
valores do ndice de condio foram identificados no perodo de Set-Jan, que
corresponde ao acasalamento e desova desta espcie nesta regio.
Alm disso, a temperatura do ar e pluviosidade mostraram
relao com os valores de K em fmeas do AC, sugerindo que para este grupo
amostral fatores abiticos naturais como chuva e seca, exercem forte influncia
sobre a condio em situaes onde no h interferncia de contaminantes
ambientais.
Discusso

Neste estudo, demonstramos que estimativas de condio

baseada na avaliao da relao peso-comprimento em Phrynops geoffroanus
detectou diferenas na condio destes animais em relao ao sexo, perodo
reprodutivo/no-reprodutivo e principalmente quanto rea de avaliao,
indicando forte influncia de estressores ambientais na fisiologia.
Na regio de estudo, o maior impacto aos sistemas aquticos
reside na contaminao por efluentes urbanos e agrcolas no tratados.
Somente 3,7% do seu territrio apresentam vegetao natural, alto risco de
contaminao qumica de solos e guas e ndice preocupante de qualidade de
gua para proteo da vida aqutica. Esses indicadores foram resultantes da
avaliao da Secretaria do Meio Ambiente do estado de So Paulo, em matas
ciliares e anlise qumica das guas superficiais, lenis freticos e solo de toda
a bacia. Os dados da avaliao deste rgo informam que a bacia hidrogrfica
em questo a rea mais impactada por contaminao do estado de So Paulo
(CBH-TG-UGRHI15 2010).

CAPTURA E MORFOMETRIA

O dimorfismo sexual em Testudines geralmente se

expressa pela diferena de porte entre os sexos, cauda mais longa e
concavidade no plastro dos machos, caracteres relacionados com o


Captulo 2

comportamento reprodutivo (Berry & Shine 1980; Molina 1989). Fitch (1981)
relatou que, os machos so geralmente maiores que as fmeas nas espcies em
que os machos lutam e/ou realizam inseminao forada; e menores quando
estes comportamentos esto ausentes. Berry & Shine (1980) relataram que nas
espcies aquticas de nado ativo, as fmeas so maiores e os machos
dificilmente conseguem subjug-las, sendo que esta diferena no tamanho seria
explicada no aumento do sucesso reprodutivo das fmeas e da capacidade
locomotiva dos machos, com consequente sucesso na localizao das fmeas.
H, portanto, um direcionamento da energia para reproduo e no para o
crescimento corpreo em machos. Desta forma, os machos devem ser menos
pesados para facilitar a locomoo, localizao e subjugao das fmeas. Esta
diferena no padro corporal pode ser observada neste trabalho, visto que os
machos mostraram-se menores e menos pesados do que as fmeas, com ntido
dimorfismo sexual como anteriormente relatado por Molina (1989) e Brites
(2002).
Berry & Shine (1980), ao comparar dados da literatura para
75 espcies de Testudines, relataram que, 97% das fmeas das famlias
Cheloniidae, Chelidae, Emydidae e Trionychidae alcanam tamanho corpreo
maior que os machos. Sugere-se que maior tamanho corpreo nas fmeas
proporcionaria maior espao para o desenvolvimento dos ovos, como constatado
em Phrynops hilarii (Astort, 1984) e P.geoffroanus (Souza; Abe, 2001. Brites,
2002). Para os machos, Astort (1984) sugere que a menor altura do casco
estaria relacionada com a estabilidade sobre as fmeas durante a cpula.

NDICE DE CONDIO

Sabe-se que o tamanho e forma do corpo das fmeas de

P. geoffroanus esto diretamente relacionados com a produo e manuteno
dos ovos na cavidade abdominal, e que a nidificao dos ovos ocorre entre
Fevereiro e Agosto (Astort 1984; Souza & Abe 2001). Uma das dificuldades na
confirmao dos parmetros do ndice de condio o fato de que alm de
haver diferenas na dieta dos animais em contedo de nutrientes, o papel
reprodutivo das fmeas e machos difere em muitas espcies animais (Trivers
1972). Deste modo, os espcimes coletados foram agrupados em dois perodos


Captulo 2

relacionados diretamente com a reproduo: Fev-Ago (nidificao) e Set-Jan

(acasalamento e desova).
Aps a anlise dos dados, pode-se observar que o valor de
K diferente entre os perodos que refletem momentos diferentes: nidificao,
acasalamento e desova. Este ndice aumenta no perodo de Set-Jan, tanto para
machos quanto para fmeas, sendo sempre maior para os machos. Estas
mudanas no K devem-se, provavelmente, ao extenso gasto e esforo
energtico sofrido pelas fmeas quanto produo de ovos e vitelognese,
principalmente no perodo de Fev-Ago. Alm disso, a relao inversa entre
peso/comprimento e K sugere que o esforo fisiolgico maior quando h
aumento do peso do corpo e possibilidade de aumentar o nmero de ovos a ser
produzido, indicando que animais mais novos, e que no possuem maturao
gonadal possuem maior condio por apresentarem menor depleo das
reservas energticas.
Apesar do consumo energtico neste perodo, as fmeas
tendem a aumentar o estoque de lipdios (Moya-Larao et al 2008) para
produo e manuteno dos ovos, refletindo no aumento do peso corpreo. A
condio das fmeas aumenta nos meses de Set-Jan, perodo que abrange o
acasalamento e formao dos ninhos. Aps a liberao dos ovos h diminuio
do peso mdio. Este resultado indica, portanto, que as modificaes no ndice de
condio em fmeas e machos esto associadas principalmente com as
mudanas fisiolgicas provocadas pela maturao sexual, relacionando-se com
modificaes gonadais e presena de ovos.
No que se refere aos espcimes do RP no perodo de Fev-Ago,
esta relao entre peso-comprimento e K no foi observada. As observaes
destacadas nos resultados para a relao RP no perodo de Fev-Ago, sugerem a
influncia de outros fatores sob a condio dos animais destas reas,
possivelmente exercendo maior influncia do que aquelas associadas
maturidade sexual. Pode-se sugerir que esta influncia seja exercida pela
presena de contaminantes como metais pesados existentes no RP (Maschio
2009).
Informaes a respeito da situao de baixa condio em
machos e o reflexo disto na reproduo so praticamente inexistentes,
principalmente tratando-se de quelnios como cgados e tartarugas. Sabe-se


Captulo 2

que fmeas em piores condies investem menos energia na maturao; mas

em relao disponibilidade de reservas, o gasto muito maior (Lambert & Dutil
2000). Assim, a energia despendida em reproduo por estas fmeas pode
aumentar o risco de mortalidade (Dutil & Lambert 2000), inclusive pelo
comportamento de desova no ambiente terrestre, que fora as fmeas sada
da gua para busca de reas para construo dos ninhos. J para os machos,
estas afirmaes so mais difceis de serem feitas. No entanto, baseando-se nos
resultados encontrados neste trabalho e no comportamento reprodutivo de P.
geoffroanus, pode-se inferir que a reduo da condio possivelmente esteja
associada com o gasto das reservas energticas associadas com a atividade
reprodutiva, principalmente no que diz respeito busca pelas fmeas e
locomoo.
Os resultados encontrados em relao correlao entre os
valores de K e fatores abiticos como temperatura do ar, pluviosidade e estao
chuvosa e seca sugerem que estes parmetros esto relacionados com o K,
visto que no perodo de maior temperatura e maior intensidade de chuvas, os
valores de K aumentam. A correlao entre os dois parmetros meteorolgicos
foi identificada somente em AC possivelmente porque em locais controlados, os
fatores associados condio restringem-se alimentao, reproduo,
temperatura e umidade, pois no existem estressores ambientais, como
poluentes. Sendo assim, pode-se inferir que a flutuao do K associado chuva
e temperatura seja a condio natural da espcie, quando em boas condies
ambientais.
Os maiores valores de K associados estao chuvosa para
fmeas mais um fator importante para auxiliar na influncia da associao do K
com a reproduo. Como observado por Guix et al (1989) e Souza & Abe (2001),
h sincronia entre a desova e incubao com a estao chuvosa e forte presso
de seleo para esta ocorrncia (Alho & Pdua,1982). A estao mais quente e
chuvosa, associada liberao dos ovos, pode auxiliar, portanto, na melhora da
condio em fmeas. No entanto, a mesma situao no foi observada nos
machos. Pode-se sugerir que estes fatores so menos relevantes e pouco
influentes na condio destes espcimes, refletindo a existncia de diferenas
sazonais e fisiolgicas importantes entre machos e fmeas e direcionamento
diferenciado das demandas energticas entre os sexos. Desse modo, outros


Captulo 2

fatores esto associados com as mudanas nos valores de K de machos de P.

geoffroanus. Esta diferena entre a condio dos sexos baseados em mudanas
de temperatura e pluviosidade tambm ocorre em outras espcies de animais
como em gastrpodos, como Achatina fulica (Albuquerque et al 2009) e em
mamferos ruminantes (Antidorcas marsupialis Turner et al., 2011).
A poluio do RP associado alterao do perfil do rio pela
construo de barreiras em sua margem podem ser os fatores determinantes
para a baixa condio nos machos e fmeas desta rea. Alm do aumento da
atividade metablica para detoxificao dos contaminantes presentes na gua
(Hochacka & Putz, 2001), h maior consumo energtico por parte das fmeas
para busca de reas para desova; e por parte dos machos, maior esforo
metablico para busca das fmeas para cpula. Cabe salientar que pela
modificao do leito e margem do RP, praticamente toda a rea de desova na
regio urbana foi perdida, destruindo ninhos existentes e impedindo novas
desovas. Este cenrio indica importante impacto da ao humana sob as
populaes destas reas; contudo, o reflexo desta situao nesta populao
ainda no pode ser avaliado, j que a alterao no perfil do rio recente.
Os resultados encontrados em animais coletados em rea
urbana, objeto deste estudo, refletem as anlises fsico-qumicas realizadas nos
recursos hdricos da Bacia do Turvo/Grande por Campanha et al. (2010), que
afirmam que estas reas encontram-se altamente degradadas, afetadas
principalmente pelo lanamento de efluentes domsticos in natura. Os autores
destacam que os crregos Felicidade e rio Preto, apresentaram concentrao
dos parmetros avaliados em desacordo com os valores admissveis pela
Resoluo CONAMA 357/05. O rio Preto um dos corpos aquticos mais
impactados da bacia, contaminados por efluentes domsticos da cidade de So
Jos do Rio Preto e cidades vizinhas, seguido pelo Crrego Felicidade,
contaminado por efluente agrcola e urbano. O impacto ambiental encontrado
pelas analises fsico-qumicas so coerente com a diferena nos ndices de
condio para P. geoffroanus observados no presente estudo.
Apesar das mudanas em condio refletida neste estudo,
nenhuma alterao morfolgica foi detectada nos animais coletados, como
observado por Pia et al (2009), ao avaliar a concentrao tecidual de metais
pesados em espcimes de P. geoffroanus em rea altamente impactada por


Captulo 2

contaminantes. Sugere-se que esta espcie resistente a estressores

ambientais,

mostrando,

inclusive,

grande

biomassa

alta

densidade

populacional nestes locais (Souza & Abe, 2000; Pia et al 2009).

Em

muitas

espcies

de

peixes,

como

por

exemplo,

Oreochromis niloticus, os baixos ndices de condio em locais poludos esto

diretamente associados com o aumento da fecundidade como resposta aos altos
ndices de mortalidade (Lein & de Vries 1998; Scoppettone & Rissler, 2000). O
aumento da fecundidade uma resposta adaptativa de uma populao frente a
mudanas no ambiente, assegurando a preservao e no a eliminao da
espcie, na tentativa de manter relativa estabilidade da populao no espao e
no tempo (Khallaf et al 2003). No presente estudo, nenhuma anlise a respeito
da taxa de fecundidade em P. geoffroanus foi realizada; no entanto, esta pode
ser uma relao verdadeira para esta espcie em ambientes impactados, pelo
grande nmero de espcimes existentes nestas reas, inclusive na bacia
Turvo/Grande, e pela forte indicao de relao das mudanas nos ndices de
condio associadas reproduo. Possivelmente, a diminuio dos ndices de
condio reflita os gastos energticos na tentativa de manter o equilbrio
populacional frente ampla flutuao ambiental.
Deste modo, pode-se concluir que a avaliao da condio em
espcimes de P. geoffroanus no crrego Felicidade e no rio Preto reflete o
impacto das alteraes ambientais causadas por contaminao e influncia
antropognica,

indicando

alteraes

nas

condies

fisiolgicas

destes

organismos, especialmente com aquelas associadas reproduo, visto que os

ndices

foram

significativamente

alterados

quando

os

perodos

foram

comparados, indicando influncia sazonal neste parmetro. Alm disso, o ndice

de condio em P. geoffroanus mostrou-se coerente com as caractersticas de
contaminao das reas de captura, refletindo o gradiente de contaminao
existente evidenciado por anlises fsico-qumicas dos corpos dgua avaliados.
Para entender a ecologia de qualquer espcie, deve-se
entender como as variaes ambientais influenciam na sua fisiologia e histria
de vida (Getz 2011). Este trabalho foi o primeiro a avaliar este ndice em
cgados do Brasil e indica que populaes de P. geoffroanus de reas
impactadas pelo homem apresentam mudanas em sua condio fisiolgica e
bem-estar. Sabendo-se que o grupo taxonmico qual pertence esta espcie


Captulo 2

ainda controverso e qual a real amplitude da poluio ambiental sob a sua

capacidade reprodutiva, os resultados deste trabalho sugerem a necessidade de
ateno e monitoramento das reas de ocorrncia da espcie, em especial as
impactadas pelo homem.

Agradecimentos

Agradecemos ao Prof. Dr. Luis Dino Vizotto pela permisso

de uso da imagem da espcie e pelas importantes sugestes. Este estudo teve
auxlio financeiro do CNPq-Brasil (bolsa de estudo de Doutorado LPRV
(MCT/CNPq n27/2007 143419/2008-0) e do Laboratrio de Hemoglobinas e
Gentica das Doenas Hematolgicas (LHGDH).

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Captulo 3

Estimativa da estrutura gentica e histria demogrfica de Phrynops

geoffroanus (SCHWEIGGER 1812): influncia da ocupao humana
Larissa Paola Rodrigues Venancio1, Tiago Lucena da Silva1, Maria Isabel Afonso
da Silva1, Vinicius Augusto Gobbe Moschetta1, Jssica Baslio Bacchi1, Tayrone
Luiz Coltro Pereira1, Nathalia Rossigalli Alves Costa1, Elisabete Cristina Silva2,3,
Patricia Ianella2, Samuel Rezende Paiva2, Claudia Regina Bonini Domingos1
1

: Universidade Estadual Paulista Jlio de Mesquita Filho, Instituto de

Biocincias, Letras e Cincias Exatas UNESP/IBILCE, Campus de So Jos
do Rio Preto-SP.
2
: Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria Embrapa/Cenargen-BrasliaDF.
3
: Universidade de Braslia Braslia-DF.

Resumo
Entender a estrutura de populaes e a diversidade gentica crucial para
conservao da vida selvagem e determinar a integridade de populaes
naturais. Uma causa relevante para a perda da biodiversidade a modificao
de hbitats naturais, afetando processos dinmicos como seleo natural, fluxo
gnico e deriva gentica, aumentando a possibilidade de extino devido
eroso gentica e processos demogrficos estocsticos. O cgado sulamericano, Phrynops geoffroanus (SCHWEIGGER 1812), conhecido
popularmente como cgado-de-barbelas, apresenta ampla distribuio
geogrfica, abrangendo desde a Amaznia Colombiana at o Sudeste do Brasil,
Uruguai e Nordeste da Argentina. Esta espcie pertence a um complexo de
espcies que objeto de grande controvrsia taxonmica, ainda no
completamente esclarecida; alm disso, esta espcie ainda pouco estudada
em termos ecolgicos e principalmente genticos. Neste trabalho foram
avaliadas 12 microssatlites com a finalidade de elucidar a estrutura gentica e
histria demogrfica de populaes pertencentes bacia hidrogrfica mais
poluda e impactada da regio sudeste brasileira, uma das reas mais populosa
e industrialmente desenvolvidas do Brasil. Os dados indicam baixa estruturao
gentica entre as reas amostradas, baixo grau de consanguinidade
intrapopulacional e alto fluxo gnico. Apesar da pouca diferenciao gentica
entre
as
populaes,
observou-se
alta
subestruturao
gentica
intrapopulacional, provavelmente devido ao intenso fluxo gnico com outras
reas de sub-bacia e, principalmente, devido ao impacto da ocupao humana e
modificao do leito do rio. Essa interferncia pode estar iniciando processos de
formao de barreiras fsicas, diferenciando possveis demes existentes por toda
a extenso da rea. Anlises demogrficas indicam tambm mudanas no
equilbrio mutao-deriva, como indicativo de eventos de gargalo da garrafa
recentes, que podem ter sido mascarados, como por exemplo, pelo pequeno
tempo de alteraes e histria natural da espcie. Essas observaes indicam
que, apesar da adaptao desta espcie a reas impactadas, a alterao do

Captulo 3

habitat natural realizada pela ao humana pode ser refletida na estrutura

gentica dessas populaes, indicando ateno para conservao no somente
desta espcie pouco conhecida, mas de toda a comunidade pertencente a estas
reas.
Palavras-chave: Phrynops geoffroanus, microssatlites,
populaes, demografia, conservao, evoluo.

estrutura

de

Introduo

A modificao de hbitats naturais pelo homem uma

importante causa da perda de biodiversidade (MEFFE; CARROL, 1997;
MARZLUFF, 2001; CLARK et al. 2010), afetando processos dinmicos como
seleo natural, fluxo gnico e deriva gentica, aumentando a possibilidade de
extino devido eroso gentica e processos demogrficos estocsticos
(FRANKHAM et al., 2002). Como a diversidade gentica pode aumentar as
chances de sucesso de uma espcie variaes ambientais, a perda de alelos
um fator importante que pode reduzir a habilidade de adaptao a novos
desafios evolutivos (WRITE, 1978).
Conhecer a estrutura da populao e a diversidade gentica
crucial para preservao efetiva da vida selvagem devido a sua importncia na
determinao da integridade e viabilidade de populaes naturais. Alm disso,
esses parmetros podem revelar mais processos atuando em populaes e
espcies, como, por exemplo, de que maneira a estrutura gentica de espcies
de ampla distribuio formada e mantida, e se h grupos genticos crpticos
existentes dentro do txon (TAMMELEHT et al., 2010).
Marcadores genticos moleculares podem prover informaes
importantes sobre a distribuio geogrfica da diversidade gentica (e processos
causais associados) de espcies cuja observao na natureza dificultada, por
exemplo, pelo comportamento e/ou pela dificuldade de acessar o seu hbitat
(TZIKA et al., 2008), como por exemplo, espcies de ambiente aqutico.
O

cgado

sul-americano,

Phrynops

geoffroanus

(SCHWEIGGER 1812), conhecido popularmente como cgado-de-barbelas,

Captulo 3

apresenta ampla distribuio geogrfica, abrangendo desde a Amaznia

Colombiana at Sudeste do Brasil, Uruguai e Nordeste da Argentina
(PRITCHARD; TREBBAU 1984). P. geoffroanus uma espcie integrante do
chamado Complexo Phrynops, que um complexo de espcies cuja taxonomia
ainda no foi completamente esclarecida. Vrios autores sustentam este txon
como uma superespcie, suscetvel a ser fracionada em vrias entidades
especficas; j outros autores, sustentam que esta uma espcie politpica com
vrias subespcies diferentes (RUEDA-ALMONACID et al., 2007). Apesar da
ampla distribuio geogrfica da espcie, estudos com interesse na histria
natural so praticamente inexistentes e, grande parte das informaes biolgicas
foram derivadas de estudos de espcimes cativas (GUIX et al 1989; MOLINA,
1996).
P. geoffroanus uma espcie pouco conhecida no somente
em termos de ecologia bsica, mas principalmente em estrutura gentica
populacional. Estudos com ferramentas moleculares so importantes, no
somente para auxiliar no entendimento de processos biogeogrficos e
fenmenos populacionais atuantes na modelagem da estrutura gentica e
demogrfica deste txon, mas tambm para avaliar os eventuais efeitos do
impacto antropognico na diversidade gentica da espcie a fim de auxiliar a
implementao de programas efetivos de conservao (ESCALONA et al.,
2009). Assim, pode-se evitar a perda de variao gentica e fixao de alelos
deletrios, com consequente depresso endogmica e reduo do potencial
adaptativo (CORNEUT; LUIKART, 1996).
Neste estudo, marcadores moleculares microssatlites foram
utilizados para avaliar a estrutura gentica de populaes selvagens de P.
geoffroanus, coletados em reas impactadas por poluentes qumicos e
orgnicos, de origem antromrfica e por barreiras fsicas decorrentes da
construo de represas, com o objetivo de avaliar o impacto que esses fatores
podem ter sobre a diversidade gentica desta tartaruga de gua doce sulamericana.

Material e Mtodos

Captulo 3

A) Coleta de amostras, extrao de DNA e gerao de dados moleculares

Espcimes de Phrynops geoffroanus foram capturados em duas

reas da Bacia Hidrogrfica do Turvo/Grande, regio Noroeste do estado de So
Paulo (Sudeste do Brasil) (Figura 1). As reas de coleta localizam-se no
permetro urbano da cidade de So Jos do Rio Preto - SP, e so elas: Crrego
Felicidade (CF) (204625.99S, 492117.63O) e rio Preto (RP) (204709.82S,
492226.24O). Para captura dos animais, foi utilizada uma armadilha cilindrica
tipo covo, medindo 150X60 cm. As armadilhas foram presas por arame
galvanizado em rvores nas margens do rio e dos crregos, e em seu interior,
foram colocadas iscas (carne bovina e peixe) presas por ganchos de arame
galvanizado. As atividades de coleta dos espcimes foram autorizadas e
aprovadas pelo IBAMA/ICMBio (registro 2838725/n 16488-1, n16488-2, 164883) e pela comisso de tica em Experimentao Animal (CEEA) da Faculdade
de Medicina de So Jos do Rio Preto (FAMERP) (Protocolo FAMERP n
5517/2008).

A)
B)

Ponto 1

Ponto 2

Figura 1. Mapas de localizao da Bacia Hidrogrfica do Turvo/Grande e da cidade de So Jos do Rio Preto. A) Mapa do estado de So Paulo
e da Bacia, com destaque para a regio da cidade de So Jos do Rio Preto SP. B) Mapa da cidade de S. J. Rio Preto, com indicao dos
pontos de coleta. O ponto 1 refere-se ao crrego Felicidade (204625.99S, 492117.63O) e o ponto 2 refere-se ao rio Preto (204831.86S,
492227.61O) (Mapa da cidade adaptado de Whitacker(2007) e mapa da bacia adaptado de Comit da Bacia Hidrogrfica Turvo/Grande 2010).

Captulo 3

Amostras de sangue (~1mL) foram coletados de cada

espcime, seguindo mtodo descrito por Silva et al. (2012), e posteriormente
armazenados em tubos contendo EDTA como anticoagulante. O DNA das
amostras foi extrado at aproximadamente 3 horas aps a coleta, visto a rpida
coagulao do sangue.
Os espcimes coletados foram caracterizados quanto ao sexo
por meio de avaliao do tamanho da cauda, abertura da placa anal e
concavidade do plastro (MOLINA, 1989). Foram coletados 36 fmeas e 13
machos nas duas reas amostradas, totalizando 49 espcimes de Phrynops
geoffroanus.
O DNA genmico total foi extrado utilizando o protocolo fenolclorofrmio descrito por Sambrook et al., (1989), e ressuspendido em 60L de
tampo TE. A concentrao de DNA foi avaliada com espectofotmetro
NanoDrop (ND-1000), a integridade avaliada em gel de agarose 1% corado com
brometo de etdeo, e posteriormente estocados a -20C.
Protocolos de reaes em cadeia da polimerase (PCR) foram
utilizados para amplificao individual de 19 pares de oligonucleotdios
iniciadores de microssatlites com repetio dinucleotdica originalmente
desenvolvidos para Podocnemis unifilis e Podocnemis expansa (Tabela 1).

Tabela 1. Informaes gerais a respeito dos 19 locos testados, como tipo de repetio, tamanho esperado, marcao, espcie onde o marcador
foi isolado e condies de amplificao em Phrynops geoffroanus.
Microssatlite

Repetio

Tamanho esperado

Marcao

PE1075
Puni2C11
Pod79
Puni1C9
Puni1C3
Puni1D9
Puni2E7
Puni2F6
Pod147
Pod62
Puni1B11
Puni2D10
Pod1
Pod128
Puni1B2
PE519
Puni1F10
Puni2A9
PE344

(AC)11
(CT)17
(CT)13(CA)16
(GA)17
(GA)8
(GA)12
(GA)5GC(GA)8
(CT)6T(CT)10
(GT)16(A)20
(GT)13(TA)3
(GA)7GG(GA)9
(GA)8
(CA)12
(GT)23(GC)8
(GA)17
(CT)7(CA)8(CG)2(CA)8
(CT)8
(GA)8
(AG)13

247-283bp
200-400bp
220-260bp
200-350bp
200-400bp
200-300bp
100-300bp
EXCLUDO
200-300bp
EXCLUDO
265-287bp
140-170bp
EXCLUDO
EXCLUDO
300-400bp
EXCLUDO
150-250bp
100-300bp
EXCLUDO

FAM
HEX
HEX
FAM
HEX
FAM
FAM
HEX
HEX
FAM
FAM
HEX
FAM
HEX
FAM
HEX
FAM
FAM
FAM

Taq
polimerase
Promega
Qiagen
Qiagen
Promega
Promega
Promega
Promega
EXCLUDO
Qiagen
EXCLUDO
Qiagen
Qiagen
EXCLUDO
EXCLUDO
Qiagen
EXCLUDO
Qiagen
Promega
EXCLUDO

Temp. annealing

[MgCl2]

Espcie de Origem

52C
52C
56C
54C
52C
58C
52C
EXCLUDO
60C
EXCLUDO
54C
62C
EXCLUDO
EXCLUDO
52C
EXCLUDO
52C
52C
EXCLUDO

2,0mM
___
___
2mM
3,5mM
2,0mM
3,5mM
EXCLUDO
___
EXCLUDO
___
___
EXCLUDO
EXCLUDO
___
EXCLUDO
___
1,5mM
EXCLUDO

Podocnemis expansa
(1)
Podocnemis unifilis
(3)
Podocnemis expansa
(1)
Podocnemis unifilis
(1)
Podocnemis unifilis
(1)
Podocnemis unifilis
(1)
Podocnemis unifilis
(1)
Podocnemis unifilis
(3)
Podocnemis expansa
(3)
Podocnemis expansa
(1)
Podocnemis unifilis
(1)
Podocnemis unifilis
(3,4)
Podocnemis expansa
(3)
ambas
(1)
Podocnemis unifilis
(5)
Podocnemis expansa
(1)
Podocnemis unifilis
(1)
Podocnemis unifilis
(5)
Podocnemis expansa


(1)FANTIN et al.; 2007; (2) VALENZUELA, 2000; (3) SITES et al., 1999; (4) VALENZUELA, 2001; (5) VALENZUELA, 1999.

(2)

Captulo 3

As reaes de amplificao para parte dos marcadores foram

estabelecidas utilizando 3ng de DNA genmico, 2M de cada par de
oligonucletdeo iniciador, 2,5L de 2X Qiagen Multiplex PCR Master Mix, 5X QSolution e gua em um volume final de 5L, e as temperaturas otimizadas por
reaes de gradiente de temperatura. Para os marcadores que no puderam ser
amplificados com QIAGEN Multiplex PCR, foram testados com o seguinte
protocolo: 9ng de DNA genmico, 2M de cada oligonucleotdeo iniciador,
tampo 10X, dNTPs 2.5mM, MgCl2 25mM, 0.5 U de Taq Promega e gua em um
volume final de 10L. As concentraes ideais de MgCl2 foram padronizadas
para cada marcador e otimizado nestas condies (Tabela 1). O protocolo de
ciclagem foi o seguinte: desnaturao inicial de 95C por 15 min (QIAGEN) ou
94C por 5 min (Promega), seguidos por 40 ciclos de 94C por 30s, 56-62C por
1 min, 72C por 1 min, e extenso final a 72C por 30m. Os alelos foram
genotipados em sequenciador automtico ABI3100 (Applied Biosystems), e
analisados manualmente utilizando o programa Genemapper v4.1 (Applied
Biosystems). Aps genotipagem, os fragmentos foram atribudos a categorias de
alelos de acordo com o seu tamanho, por meio do programa FLEXBIN (AMOS et
al., 2007).

B) Anlise de Dados

1) Diversidade gentica dentro de localidades

O nmero de alelos por populao e locos, heterozigosidade

observada (HO), heterozigosidade experada (HE), e alelos privados foram
calculados utilizando o programa GenAlEx 6.1 (PEAKALL; SMOUSE, 2005). A
riqueza allica (RA) foi calculada como descrito por El Mousadik e Petit (1996),
por meio do programa FSTAT verso 2.9.3.2 (GOUDET, 2001).
A avaliao do desequilbrio de ligao par a par entre locos foi
testada utilizando o programa GENEPOP verso 4.0 (ROUSSET, 2008), e os
nveis de significncia foram avaliados usando procedimento de aleatorizao da
cadeia de Markov (GUO; THOMPSON, 1992) com 10.000 passos de


Captulo 3

dememorizao, 1.000 lotes e 5.000 iteraes por lotes. Desvios do equilbrio de

Hardy-Weinberg (EHW) foram testados com o programa ARLEQUIN verso
3.5.1.2, utilizando teste exato baseado no procedimento descrito por Guo e
Thompson (1992), com 100.000 passos de dememorizao (EXCOFFIER;
LISCHER, 2010). Para avaliar a presena de alelos nulos, foi utilizado o
programa MICRO-CHECKER 2.2.3 (VAN OOSTERHOUT et al., 2004).

2) Diversidade gentica entre localidades

A estrutura interpopulacional foi avaliada por meio de clculos

de valores de Fst (WEIR; COCKERHAM, 1994), e calculado com o programa
FSTAT. A subdiviso populacional e estrutura foi avaliada por meio da anlise de
varincia molecular (AMOVA) (EXCOFFIER et al., 1992) implementado no
GenAlEx. As estimativas do nmero de migrantes por gerao (Nm = (1-Fst)/4Fst
(WRIGHT, 1969) foi realizado com GENEPOP.
O mtodo de agrupamento bayesiano implementado pelo
programa STRUCTURE 2.3.3 (PRITCHARD et al., 2000) foi aplicado para
identificao de agrupamentos gentico entre todo o grupo de dados. O mtodo
empregado constituiu do teste de sete clusters (k=7; um at sete), em cinco
corridas independentes (iteraes), sem utilizao de informao populacional
prvia. A probabilidade posterior dos dados [LnPr(x/kK)] para cada valor de k foi
inferido com iteraes MCMC (algortimo cadeia de Markov Monte Carlo) de
10.000 cada e burn-in de 100.000, utilizando o modelo de ancestralidade
compartilhada (admixture ancestry model) e frequncia de alelos correlacionado
entre amostras, que considera as frequncias semelhantes entre as populaes
devido migrao ou ancestralidade, em que alguns alelos esto em
desequilbrio de ligao. O verdadeiro k selecionado utilizando o valor mximo
do log likelihood [LnPr(x/kK)] da probabilidade posterior a partir de um dado k
(EVANNO et al., 2005).
Foram realizados tambm testes de atribuio individual para
calcular a probabilidade de que gentipos multilocos individuais derivem de
populaes alternativas (PAETKAU et al., 1995), utilizando mtodo Bayesiano
pelo programa GENECLASS 2 (PIRY et al., 2004).

Captulo 3

3) Anlises demogrficas

A histria demogrfica baseada em microssatlites foi avaliada

utilizando dois mtodos: 1) o teste de sinal de Wilcoxon foi utilizado para
examinar se populaes exibem maior nvel de heterozigosidade do que predito
em uma populao em equilbrio mutao-deriva. Este teste mais sensvel
para detectar efeitos de gargalo de garrafa (bottlenecks) que ocorreram
aproximadamente na ltima 2-4 Ne geraes, tendo mais poder estatstico para
detectar gargalos mais recentes (por exemplo, 0.2-1Ne geraes atrs). 2) um
teste mode-shift (LUIKART et al., 1998) que detecta distoro na distribuio L
esperada de frequncias allicas. Este teste mais apropriado para detectar
declnios populacionais que tenham ocorrido mais recentemente (em poucas
dezenas de geraes (LUIKART et al., 1998, CORNUET; LUIKART, 1996). A
deficincia de heterozigosidade, excesso de heterozigosidade e os testes modeshift foram realizados por meio do programa BOTTLENECK 1.2.02 (PIRY et al.,
1999). Foram realizados 5.000 simulaes em 2 populaes sob o modelo de
IAM (infinite allele model) (ESTOUP et al., 1995a,b; CORNUET; LUIKART,
1996). Os valores de p do teste de Wilcoxon foram utilizados para evidncia de
gargalos e o nvel de significncia foi de 0.05.

Resultados e Discusso

1) Estatsticas intrapopulacionais

Dezenove

pares

de

oligonucleotdeos

iniciadores

de

microssatlites originalmente desenvolvidos para Podocnemis expansa e

Podocnemis unifilis foram submetidos PCR; destes, 12 apresentaram sucesso
na amplificao em Phrynops geoffroanus e foram utilizados para estimar a
estrutura da populao da espcie em estudo (Tabela 1).
A avaliao global do conjunto de microssatlites utilizando o
MICRO-CHECKER revelou no haver nenhuma evidncia de erro de
genotipagem devido ao padro de bandas gagas (stuttering) ou perdas de

Captulo 3

alelos grandes, mas evidenciou que alelos nulos podem estar presentes nos
locos Pod147 (Crrego Felicidade - CF) e Puni2C11 (Rio Preto - RP).
A mdia do nmero de alelos por locos foi de 7.833 em CF e
5.917 em RP. Do total de 92 alelos, 59 foram privados; sendo que estes foram
mais comuns em CF, com destaque para Puni1F10 (sete alelos privados) e
Pod147 (13 alelos privados).
A diversidade allica observada por populao foi de 5.917
(RP) a 7.833 (CF) (mdia=6.875), e a riqueza allica (RA) foi de 5.57 (RP) e 6.11
(CF). A heterozigosidade esperada (HE) mostrou-se elevada para as duas
localidades amostradas (mdia entre CF e RP = 0.688), indicando, de modo
geral, que altos nveis de diversidade gentica esto presentes entre as reas.
Estes dados esto apresentados na Tabela 2. Nenhuma diferena significante
em RA e HE foi identificada entre as localidades (ANOVA, p = 0.233), e as duas
medidas mostraram alta correlao (R2 = 0.7274, p<0.01).

Tabela 2. Informaes gerais a respeito das estatsticas intrapopulacionais inferidas dos

dados de microssatlites para as duas reas amostradas.

Diversidade
gentica*
HO
HE

AP

Fis

5.57

0.768 0.698

18 (8)

-0.104

6.11

0.719 0.678

41 (9)

-0;061

Local de
coleta

Diversidade
allica*
Aob
RA

Rio Preto

16

5.917

Felicidade

33

7.833

N: tamanho amostral; Aob: mdia de nmero de alelos observados por locos; RA: riqueza
allica; HO: heterozigosidade observada; HE: heterozigosidade esperada; AP: nmero de
alelos privados por localidade (nmero de locos); Fis: coeficiente de consanguinidade de
Weir e Cockerham (1984). *: calculados com GenALex; : calculado com FSTAT

O teste de probabilidade para o equilbrio de Hardy-Weinberg

(EHW) identificou sete locos que se mostraram significantemente fora do EHW
(=0.05). O maior nmero de locos fora do equilbrio de EHW pertence RP
(significante para seis dos 12 locos estudados). Os locos em desvio de EHW em
comum nas duas populaes amostradas so: Puni1C3, Puni2E7 e Pod147.
Pearse et al. (2006), avaliando a estrutura populacional sob condies de noequilbrio em 18 populaes de Podocnemis expansa, identificou desvio do EHW
para o loco Pod147 em sete das populaes amostradas. Avaliando todos os


Captulo 3

pares de locos entre as populaes, pode-se verificar desequilbrio de ligao

(DL) entre Puni2A9 e Puni2D10 (p= 0.022); no entanto, foi observado ocorrncia
de DL em outros locos em cada rea de coleta.
Vrios estudos tm revelado diferenas na extenso e no grau
de DL entre populaes resultantes de diferenas da histria e na demografia de
populaes (AMARAL et al., 2008; LI; MERIL, 2011). Endogamia e
subestruturao populacional (ou estratificao) aumentam os nveis de DL em
uma populao (PELTONEN et al., 2000). No caso da subdiviso populacional,
associaes estatsticas entre locos que no so fisicamente ligados podem
ocorrer (PRITCHARD; ROSENBER, 1999). Essa associao ocorre porque a
subdiviso da populao permite que as frequncias allicas variem entre
segmentos de populaes como resultado da deriva gentica ou efeito de
fundador (SLATKIN; 1991).
Os testes exatos para deficincia e excesso de heterozigotos
por populao, baseado em estimativas de Fis, realizados pelo Genepop,
indicam que dois locos em CF e trs locos em RP apresentam dficit de
heterozigoto; trs locos em CF e cinco locos em RP apresentam excesso de
heterozigotos. O loco coincidente para o dficit de heterozigotos em CF e RP foi
Pod147 e os coincidentes para excesso so Puni2A9 e Puni2E7. Estes
resultados encontrados em Phrynops geoffroanus para o loco Puni2E7 foi
equivalentes ao encontrado por Fantin et al. (2007), que desenvolveu e avaliou
este marcador em Podocnemis unifilis.

2) Diferenciao gentica entre localidades

Geralmente, o grau de estrutura gentica em uma espcie

distribuda continuamente dependente de 1) a ocorrncia de um mosaico de
subpopulaes delimitadas por efetivas barreiras fsicas para o fluxo gnico
como montanhas, rios e estradas; ou ecolgicas, como especializao prhabitat, (MUSIANI et al., 2007); e 2) um nico grupo gentico com nenhuma
fronteira definida ou subdiviso clara onde o fluxo gnico entre partes distantes
da populao podem ser restritas somente pela capacidade limitada de
disperso (EPPERSON, 2003).

Captulo 3

Avaliando a diferenciao gentica entre as localidades, o valor

de Fst global entre as duas populaes foi de 0.018 (IC 95% 0.004-0.033),
indicando existncia de fluxo gnico entre as localidades amostradas e baixa
estrutura gentica entre as reas. A avaliao da estimativa de migrantes aps
correo por tamanho (Nm) (Genepop) indicou em 3.7 migrantes. Resultado
semelhante tambm foi observado quando da deteco de migrantes de primeira
gerao realizado pelo GENECLASS, resultando em trs indivduos com
probabilidade abaixo de 0.01.
De acordo com Kimura e Maruyama (1971), quando Nm
assume valores maiores do que quatro entre localidades, as reas podem ser
consideradas pertencentes a uma nica populao panmtica, enquanto que Nm
menor do que um indica que as localidades so diferenciadas. Hedrick (2005)
sugere que um nico migrante por gerao suficiente para prevenir a
diferenciao completa das populaes ideiais, independentemente do seu
tamanho. Deste modo, pode-se inferir a existncia de fluxo gnico entre CF e
RP, concordando com os padres detectados pela estatstica F e com o perfil
geogrfico das reas, j que CF tributrio do RP.
As anlises de distncia geogrfica e gentica entre as
localidades apontam para uma correlao fraca (r2 = 0.0545; p>0.01) (Figura 2),
indicando baixa diferenciao entre as localidades que abrangem a rea
geogrfica estudada (cerca de 6 Km entre os pontos de coleta, seguindo o
percurso do rio e do crrego). O padro de baixa estruturao gentica entre
populaes separadas geograficamente descrito para quelnios da Bacia
Amaznica como Podocnemis expansa (PEARSE et al., 2006) e Podocnemis
sextuberculata (SILVA et al., 2011), assim como para outras espcies, como por
exemplo, peixe-boi (Trichechus inunguis, CANTANHEDE et al., 2005) e pirarucu
(Arapaima gigas; HRBEK et al., 2005).
H poucas informaes na literatura a respeito da capacidade
migratria de Phynops geoffroanus. Souza e Abe (2001) sugere que, devido
baixa taxa de recaptura (2.4%) em coletas realizadas mensalmente durante um
ano, possivelmente a espcie apresente alta capacidade de mobilidade.
Condio semelhante foi observado nas coletas no CF e RP; durante todo o
perodo de coleta, houve recaptura de somente dois animais. Os resultados de
anlise de diferenciao gentica entre localidades contribuem para a afirmao


Captulo 3

destes autores e com a nossa observao em relao ao sucesso de recaptura.

Contudo, para confirmar esta observao, faz-se necessria a avaliao da
estruturao entre maior nmero de indivduos e reas da bacia hidrogrfica.

Figura 2. Teste de Mantel para averiguao da dependncia entre distncia geogrfica e

distncia gentica entre os indivduos coletados e rea de coleta. GGD: Distncia
geogrfica. FstP: distncia gentica [Fst/(1-Fst)]. O coeficiente de regresso indica a no
existncia de relao entre distncia gentica e geogrfica, indicando que os indivduos
no apresentam isolamento por distncia.

Avaliando os dados de diversidade gentica entre as

localidades, os valores elevados dos ndices que a descrevem indicam que o
impacto da contaminao ambiental e da alterao do perfil do leito do rio ainda
no afetou consideravelmente as populaes avaliadas (ELLSTRAN; ELAM,
1993). O perfil de alta diversidade gentica foi descrito em outras espcies de
tartarugas de gua doce que sofrem algum tipo de impacto antrpico, como
Podocnemis expansa (PEARSE et al., 2006) e Podocnemis unifilis (ESCALONA
et al., 2009), e esta condio pode indicar variabilidade histrica nas condies
ambientais que poderiam ter encoberto recentes eventos de gargalo gentico
(bottleneck effect) devido longevidade da espcie e sobreposio de geraes
(VALENZUELA, 2000; GARZA; WILLIAMSON, 2001; ESCALONA et al. 2009).

Captulo 3

Alm disso, distrbios ecolgicos muito recentes no reduzem a diversidade

gentica dentro de poucas geraes, a menos que leve a perda populacional
catastrfica (LIN et al., 2012).

3) Relacionamento gentico entre localidades, testes de reduo de

populao e consideraes gerais

A anlise de AMOVA sugere baixa diferenciao gentica

(st=0.065, p=0.001) entre as populaes, com apenas 7% da variao sendo
explicada por diferenas interpopulacionais e 93% sendo explicada pela variao
dentro da populao. No entanto, este resultado sugere a existncia de
diferenciao gentica entre grupos de indivduos, visto que o valor de st foi
maior que 0.05 e o valor de p significativo (WRIGHT, 1931).
Quando os dados foram

avaliados por

algoritmos de

agrupamento Bayesiano (STRUCTURE), foi identificada alta subestruturao,

como sugere os dados de varincia molecular, indicando cinco populaes
subdivididas entre as avaliadas (k = 5), no agrupando indivduos por rea de
coleta. Este resultado aparentemente no possui explicao bvia; no entanto,
esta observao pode ser justificada pelas alteraes no leito do rio, como por
exemplo, o represamento do rio Preto e processos avanados de assoreamento
nos seus tributrios, como o caso do crrego Felicidade. Estes processos de
alterao esto estabelecendo importantes barreiras fsicas ao longo do
percurso do rio, dificultando a migrao dos animais, como, por exemplo, retorno
de espcimes para a rea do lago artificial aps o ponto do represamento,
influenciando na diferenciao gentica de possveis sub-grupos populacionais
existentes antes dessas alteraes e nos que esto sendo recentemente
formados devido formao de barreiras fsicas.
Testes

demogrficos

utilizando

BOTTLENECK

foram

realizados para avaliar se as populaes se encontram em equilbrio entre

mutao e deriva gentica (mutation-drift equilibrium) segundo metodologia
descrita por Cornuet e Luikart (1996). O modelo de IAM (inifite allele model;
WATTERSON 1984), indicou a existncia de excesso de heterozigosidade em
RP e CF (teste de Wilcoxon-sign rank; p = 0.00049); no entanto, no mostrou
alterao na distribuio L-shaped. Apesar do teste de Wilcoxon sugerir a


Captulo 3

possibilidade de ocorrncia de eventos recentes de gargalo gentico, esta

inferncia no foi confirmada pelo modelo de distribuio de alelos, sugerindo a
possibilidade

de

mudanas

no

equilbrio

mutao-deriva

sem

declnio

populacional, haja vista que no h sinais de eroso gentica, como avaliado

pela riqueza allica. Deve-se considerar tambm o tempo de alteraes no
ambiente natural dessas reas, como contaminao por despejo orgnico e
industrial, represamento e processos de assoreamento. preciso considerar
tambm a histria natural do animal, como, por exemplo, o tempo de vida, que
dificultaria a identificao de eventos de declnio populacional no momento; alm
da influncia da amostragem.
Os dados de Fis indicam a no ocorrncia de consanguinidade
intrapopulacional, e, portanto, a ocorrncia de acasalamentos ao acaso (CF=0.061; RP=-0.104). Este resultado sugere a existncia de nmero elevado de
indivduos nas reas, em especial no RP, dificultando o acasalamento entre
espcimes aparentados. O nmero elevado de indivduos poderia explicar em
parte a existncia de mudanas no equilbrio mutao-deriva sem declnio
populacional.
Outra

observao

importante

respeito

da

densidade

populacional est no fato de que as reas amostradas apresentam intensa

contaminao por efluentes domsticos e industriais (CAMPANHA et al., 2010).
Sabe-se que populaes de P.geoffroanus apresentam maior densidade nestas
reas devido alta concentrao de materiais orgnicos em decomposio que
favorece a alimentao. A alta densidade populacional da espcie e grande
biomassa sugere que estes animais so altamente resistentes e adaptados a
ambientes contaminados no somente por despejo orgnico, mas poludos com
altas concentraes de metais pesados (PIA et al., 2009), como o caso das
duas reas amostradas.
Concluses

Este o primeiro trabalho a avaliar a diversidade gentica e

estrutura populacional de Phrynops geoffroanus, uma espcie de quelnio
endmica da Amrica do Sul.

Captulo 3

A manuteno da diversidade entre populaes reconhecida

como um problema central da conservao (HUGHES et al. 1997), e o
diagnstico da estrutura baseada em marcadores genticos neutros
geralmente correlacionada com variaes demogrficas ou ecolgicas entre
populaes e/ou adaptao local (CRANDALL et al., 2000).
Os resultados deste estudo preliminar de gentica de
populaes em P.geoffroanus apresentam implicaes para a conservao
desta espcie ainda pouco conhecida. Apesar dos resultados no indicarem
perda relevante da diversidade gentica em relao diversidade gnica e
riqueza allica, apresentam uma assinatura de vulnerabilidade gentica
provocada por alteraes demogrficas, que podem influenciar na integridade
gentica.
Os dados gerados indicam influncia das alteraes fsicas,
ocasionadas pelo processo de represamento e assoreamento nas populaes,
das reas amostradas. O processo de alterao do leito do rio implica em
modificaes de curso dgua, construo de barreiras nas encostas,
ocasionando a perda de indivduos adultos e, em especial, na destruio de
ninhos e reas de desova, influenciando diretamente no nmero de indivduos
em fase reprodutiva e de novas geraes.
As questes aqui levantadas refletem o impacto da atuao e
da modificao gerada pelo homem sobre as populaes naturais e seus
habitats e concordam com outros trabalhos que identificaram a influncia, como
por exemplo, da agricultura e do desenvolvimento residencial e urbano na
estrutura de gentica de populaes (ROW et al., 2010; ROW et al., 2011).
O tempo de alterao na rea estudada ainda muito pequeno
para modificaes evolutivas importantes, mas os dados refletem desvios no
equilbrio entre mutao e deriva gentica que ainda no podem ser
quantificados, mas que podem resultar em modificaes no fitness (GAUTSCHI
et al. 2002; BEHEREGARY et al., 2003) e aumento da probabilidade de extino
(FRANKHAM 1998; SACCHERI et al., 1998). Estudos abrangendo um nmero
amostral mais expressivo e de toda a bacia hidrogrfica em questo, alm de
estudos ecolgicos e comportamentais mostram-se necessrios para a
conservao, no somente da espcie, mas de toda a comunidade associada a
essas reas intensamente impactadas pelo homem.


Captulo 3

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Captulo 4

Correlao negativa entre heterozigosidade e fitness em Phrynops

geoffroanus (SCHWEIGGER 1812): impacto das mudanas ecolgicas
sobre a diversidade gentica e a condio.

Larissa Paola Rodrigues Venancio1, Tiago Lucena da Silva1, Maria Isabel Afonso
da Silva1, Vinicius Augusto Gobbe Moschetta1, Jssica Baslio Bacchi1, Tayrone
Luiz Coltro Pereira1, Nathalia Rossigalli Alves Costa1, Patricia Ianella2, Elisabete
Cristina Silva2,3, Claudia Regina Bonini Domingos1

: Universidade Estadual Paulista Jlio de Mesquita Filho, Instituto de

Biocincias, Letras e Cincias Exatas UNESP/IBILCE, Campus de So Jos
do Rio Preto-SP.
2
: Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria Embrapa/Cenargen-BrasliaDF.
3
: Universidade de Braslia Braslia-DF.

Resumo
A relao entre diversidade gentica e fitness possui implicaes na biologia
evolutiva e da conservao. Este relacionamento tem sido amplamente
investigado em nvel individual em estudos de correlao heterozigosidadefitness (CHF). De modo geral, efeitos gerados pela endogamia e/ou efeitos locais
de locos nicos tem sido utilizados como explicaes para a correlao. Neste
trabalho foi investigada a correlao entre heterozigosidade individual e vrios
aspectos do desempenho fisiolgico de cgado-de-barbelas (Phrynops
geoffroanus). Neste contexto foi avaliado o fator de condio, que se baseia na
relao entre peso e tamanho dos indivduos e a avaliao de diversos
elementos associados capacidade antioxidante e de detoxificao. Foram
genotipados 49 animais com 12 microssatlites. A relao entre
heterozigosidade e fitness mostrou-se negativa, possivelmente por codominncia
e vantagem de alelos recessivos devido a mudanas ecolgicas recentes nas
reas amostradas, refletindo a influncia da atividade humana sobre essas
populaes.

Palavras-chave: microssatlites, correlao heterozigosidade-fitness (CHF),

correlao negativa entre CHF, Phrynops geoffroanus

Captulo 4

Introduo

A influncia da diversidade gentica no fitness em indivduos e

populaes mostra implicao para biologia evolutiva e da conservao. A
correlao heterozigosidade-fitness (CHF) tem sido usada para o estudo do
relacionamento entre diversidade gentica e traos relacionados com o fitness
em nvel individual em uma variedade de organismos (COLTMAN; SLATE, 2003;
CHAPMAN et al., 2009).
O impacto da heterozigosidade no fitness tem uma longa
histria na biologia evolutiva. Charles Darwin (1876) notou que indivduos com
altos nveis de heterose podem apresentar vigor do hbrido, e estudos desde
ento suportam esta ideia (CHAPMAN et al., 2009). Contudo, ainda no claro
como atua a fora do efeito da heterozigosidade no fitness de populaes
naturais (CHAPMAN et al., 2009; SZULKIN et al., 2010).
A CHF comumente explicada pelo efeito de endogamia em
todo o genoma (hiptese do efeito geral) ou por efeitos localizados em um nico
loco (hiptese do efeito local/direto) (DAVID, 1998; HANSSON; WESTERBERG,
2002). A endogamia causa a reduo na heterozigosidade individual pelo
genoma, e assim, aumenta o risco da expresso de alelos deletrios recessivos
e diminui a ocorrncia do efeito benfico da vantagem do heterozigoto. Este
fenmeno conhecido como depresso endogmica (CHARLESWORTH;
WILLIS

et al., 2009). Neste caso, espera-se que a relao entre

heterozigosidade e fitness seja positiva.

O fenmeno oposto, depresso exogmica, geralmente ocorre
quando a prognie produzida por cruzamento entre indivduos de populaes
geneticamente diferenciadas apresenta o fitness reduzido do que aquela
originada entre cruzamentos de indivduos da mesma populao. O declnio no
fitness neste caso pode ser atribudo quebra de complexos gnicos coadaptados ou favorecimento de interaes epistticas negativas(LYNCH, 1991).
Deste modo, o que se observa efeito negativo da heterozigosidade no fitness
(MARSHALL; SPALTON, 2000; NEFF, 2004).
Apesar do nmero crescente de trabalhos avaliando CFH,
revises indicam que essas avaliaes tendem a ser fracas e inconsistentes
(COLTMAN; SLATE, 2003; CHAPMAN et al., 2009; SZULKIN et al., 2010).


Captulo 4

Provavelmente, isto se deve a variaes na base gentica de traos importantes

(como, por exemplo, se so traos polignicos) ou devido a variaes na
frequncia e histria de endogamia na populao estudada (SZULKIN et al.,
2010). Nota-se tambm que a histria de vida e traos comportamentais podem
tambm apresentar plasticidade fenotpica (POSTMA; VAN NOORDWIJK, 2005).
A plasticidade pode gerar variaes intra e inter-individuais que podem
obscurecer o impacto da heterozigosidade (WETZEL et al., 2012).
Neste trabalho o efeito da heterozigosidade foi avaliado em
vrios aspectos do desempenho fisiolgico de cgado-de-barbelas (Phrynops
geoffroanus). Neste contexto foi avaliado o fator de condio, que se baseia na
relao entre peso e tamanho dos indivduos e a avaliao de diversos
elementos associados capacidade antioxidante e de detoxificao.

Material e Mtodos

1) rea de estudo de amostras

Espcimes de Phrynops geoffroanus foram capturados em duas
reas da Bacia Hidrogrfica do Turvo/Grande, regio Noroeste do estado de So
Paulo (Sudeste do Brasil) (Figura 1). As reas de coleta localizam-se no
permetro urbano da cidade de So Jos do Rio Preto - SP, e so elas: Crrego
Felicidade (CF) (204625.99S, 492117.63O) e rio Preto (RP) (204709.82S,
492226.24O). Para captura dos animais, foi utilizada uma armadilha cilindrica
tipo covo, medindo 150X60 cm. As armadilhas foram presas por arame
galvanizado em rvores nas margens do rio e dos crregos, e em seu interior,
foram colocadas iscas (carne bovina e peixe) presas por ganchos de arame
galvanizado.

Figura 1. Regio Noroeste do estado de So Paulo e Bacia Hidrogrfica Turvo/Grande. Em destaque, a cidade de So Jos do Rio Preto.


Captulo 4

As atividades de coleta dos espcimes foram autorizadas e

aprovadas pelo IBAMA/ICMBio (registro 2838725/n 16488-1, n16488-2, 164883) e pela comisso de tica em Experimentao Animal (CEEA) da Faculdade
de Medicina de So Jos do Rio Preto (FAMERP) (Protocolo FAMERP n
5517/2008).
Os espcimes coletados foram caracterizados quanto ao sexo
por meio de avaliao do tamanho da cauda, abertura da placa anal e
concavidade do plastro (MOLINA, 1989). Foram coletados 36 fmeas e 13
machos nas duas reas amostradas, totalizando 49 espcimes de Phrynops
geoffroanus.
Todos

os

espcimes

capturados

foram

marcados

por

perfuraes nos escudos marginais, que indicam a ordem numrica e

cronolgica da captura com auxlio de furadeira manual. As perfuraes foram
feitas baseando-se no primeiro escudo nucal como ponto zero e os escudos
marginais seguintes como nmero um, dois, trs e assim sucessivamente. Estas
marcaes, como so feitas em regies sseas, no sofrem cicatrizao,
impossibilitando assim a perda da marca, no so invasivas e no atrapalham a
locomoo do animal.

2) Microssatlites e anlise de dados

Amostras de sangue (~1mL) foram coletados de cada

espcime, seguindo mtodo descrito por Silva et al. (2012), e posteriormente
armazenados em tubos contendo EDTA como anticoagulante. O DNA das
amostras foi extrado at aproximadamente 3 horas aps a coleta, visto a rpida
coagulao do sangue.
O DNA genmico total foi extrado utilizando o protocolo fenolclorofrmio descrito por Sambrook et al., (1989), e ressuspendido em 60L de
tampo TE. A concentrao de DNA foi avaliada com espectofotmetro
NanoDrop (ND-1000), a integridade avaliada em gel de agarose 1% corado com
brometo de etdeo, e posteriormente estocados a -20C.


Captulo 4

Protocolos de reaes em cadeia da polimerase (PCR) foram

utilizados para amplificao individual de 12 pares de oligonucleotdios
iniciadores de microssatlites com repetio dinucleotdica originalmente
desenvolvidos para Podocnemis unifilis e Podocnemis expansa (Tabela 1).

Tabela 1. Informaes gerais a respeito dos 12 locos testados, como tipo de repetio, tamanho esperado, marcao, espcie onde o marcador
foi isolado e condies de amplificao em Phrynops geoffroanus.
Microssatlite

Repetio

Tamanho esperado

Marcao

PE1075
Puni2C11
Puni1C9
Puni1C3
Puni1D9
Puni2E7
Pod147
Puni1B11
Puni2D10
Puni1B2
Puni1F10
Puni2A9

(AC)11
(CT)17
(GA)17
(GA)8
(GA)12
(GA)5GC(GA)8
(GT)16(A)20
(GA)7GG(GA)9
(GA)8
(GA)17
(CT)8
(GA)8

247-283bp
200-400bp
200-350bp
200-400bp
200-300bp
100-300bp
200-300bp
265-287bp
140-170bp
300-400bp
150-250bp
100-300bp

FAM
HEX
FAM
HEX
FAM
FAM
HEX
FAM
HEX
FAM
FAM
FAM

(1) FANTIN et al., 2007; (2) VALENZUELA, 2000; (3) SITES et al., 1999

Taq
polimerase
Promega
Qiagen
Promega
Promega
Promega
Promega
Qiagen
Qiagen
Qiagen
Qiagen
Qiagen
Promega

Temp. annealing

[MgCl2]

Espcie de Origem

52C
52C
54C
52C
58C
52C
60C
54C
62C
52C
52C
52C

2,0mM
___
2mM
3,5mM
2,0mM
3,5mM
___
___
___
___
___
1,5mM

Podocnemis expansa
(1)
Podocnemis unifilis
(1)
Podocnemis unifilis
(1)
Podocnemis unifilis
(1)
Podocnemis unifilis
(1)
Podocnemis unifilis
(3)
Podocnemis expansa
(1)
Podocnemis unifilis
(1)
Podocnemis unifilis
(1)
Podocnemis unifilis
(1)
Podocnemis unifilis
(1)
Podocnemis unifilis

(2)


Captulo 4

As reaes de amplificao para parte dos marcadores foram

estabelecidas utilizando 3ng de DNA genmico, 2M de cada par de
oligonucletdeo iniciador, 2,5L de 2X Qiagen Multiplex PCR Master Mix, 5X QSolution e gua em um volume final de 5L. Para os marcadores que no
puderam ser amplificados com QIAGEN Multiplex PCR, foram testados com o
seguinte protocolo: 9ng de DNA genmico, 2M de cada oligonucleotdeo
iniciador, tampo 10X, dNTPs 2.5mM, MgCl2 25mM, 0.5 U de Taq Promega e
gua em um volume final de 10L. As concentraes ideias de MgCl2 foram
padronizadas para cada marcador otimizado nestas condies (Tabela 1). O
protocolo de ciclagem foi o seguinte: desnaturao inicial de 95C por 15 min
(QIAGEN) ou 94C por 5 min (Promega), seguidos por 40 ciclos de 94C por
30s, 56-62C por 1 min, 72C por 1 min, e extenso final a 72C por 30m. Os
alelos foram genotipados em sequenciador automtico ABI3100 (Applied
Biosystems), e analisados manualmente utilizando o programa Genemapper
v4.1 (Applied Biosystems). Aps genotipagem, os alelos foram binados, isto ,
os fragmentos foram atribudos a categorias de alelos de acordo com o seu
tamanho, por meio do programa FLEXBIN (AMOS et al., 2007).
O nmero de alelos por populao e locos, heterozigosidade
observada (HO), heterozigosidade experada (HE), e alelos privados foram
calculados utilizando o programa GenAlEx 6.1 (PEAKALL; SMOUSE, 2005).
(maiores detalhes no Captulo 4 da Tese).

3) Fator de condio e anlise bioqumica de enzimas de detoxificao e

capacidade antioxidante

O fator de condio (avaliao do fitness) e a relao pesocomprimento foram estabelecidos pela mensurao do peso total e comprimento
total, e os parmetros a e b foram determinados pela transformao dos dados
para log(10) (LE CREN, 1951). As curvas de crescimento obtidas pela anlise de
regresso entre peso e comprimento seguiram a equao:
logPeso = log(a) + logComprimento*b,


Captulo 4

onde logPeso

a varivel dependente, logComprimento a varivel

independente, a a constante de regresso ou grau de engorda e b o

coeficiente de regresso, que est relacionada com o tipo de crescimento dos
indivduos. A equao terica de relao peso-comprimento foi seguida por:
Peso = a*Comprimentob. (Maiores detalhes Captulo 3 da Tese).
Para os ensaios ecotoxicolgicos, foi utilizado fgado, crebro e
sangue perifrico dos animais eutanaziados de acordo com os procedimentos
recomendados pelo COBEA. Para anlise de AChE (acetilcolinesterase),
amostras de tecido cerebral foram homogeneizados (1:4, w-vol) em um tampo
Tris a 0.1M, pH 8.0, e centrifugados por 30 min a 30,000g. A atividade de AChE
foi medida e ento caracterizada seguindo a metodologia previamente descrita
(ELLMAN et al., 1961). Para anlise de GST (glutationa S-transferase) (KEEN et
al., 1976), G6PDH (Glicose 6-fosfato desidrogenase) (GLOCK; MCLEAN, 1953)
e atividade EROD (Etoxiresorufina-O-deetilase, referente atividade do
citocromo P450) (BURKE; MAYER, 1974) (com modificaes) amostras do
fgado foram homogeneizados (1:4, w/v) em tampo Tris 20 mM (pH 7.4),
sucrose 0.5 mM, KCl 0.15 mM e 1 mM de inibidor de protease (PMSF). As
amostras foram ento centrifugadas a 9,000g for 20 min a 4C, e o fase superior
foi coletada e centrifugada mais uma vez a 50,000g for 1h. A frao citoslica foi
ento coletada de anlise de GST e G6PDH, enquanto que a atividade EROD foi
medida no pellet, que foi ressuspendido em 100 L de tampo Tris 100 mM, pH
7.5 contendo EDTA 1 mM, DTT 1 mM, KCl 100 mM e 20% glicerol.
O nvel de espcies reativas ao cido tiobarbitrico (TBARS)
(YAGI, 1976) (com modificaes) no plasma foi usado para avaliar a peroxidao
lipdica. O mtodo baseado na reao do malondialdedo e outros aldedos
com o cido tiobarbitricos (TBA) em pH baixo e alta temperatura para formar
um complexo com absoro mxima de 535nm. A quantidade de TBARS em
cada amostra obtida em ng/mL.
O potencial antioxidante da amostra foi determinada de acordo
com sua equivalncia a um potencial antioxidante conhecido, o trolox (6-hydroxy2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid), um anlogo sinttico da vitamina
E solvel em gua. Este um mtodo colorimtrico baseado na reao entre
ABTS (2,2-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic-acid)) com persulfato de
potssio (K2S2O8), produzindo um radical cation ABTS+, cromfero verde


Captulo 4

azulado, com absorbncia mxima 645, 734 and 815nm de comprimento de

onda. A adio de amostras contendo este ction reduz o mesmo novamente em
ABTS e a descolorao avaliada a 734nm. Os resultados finais foram
expressos em nM, correspondente a concentrao de antioxidantes equivalentes
aos trolox da amostra estudada, chamado de TEAC (RE et al., 1999) (Maiores
detalhes no Captulo 2 da Tese).

4) Anlise estatstica de CHF

A heterozigosidade loco-por-loco (HO) foram comparados

usando teste no-paramtrico para duas amostras independentes (MannWhitney). As variveis tamanho total (cm), peso (g), fator de condio (K), ndice
hepatossomtico (IHS), atividade EROD, GST, G6PDH, AChE, TBARS e TEAC
foram correlacionados com diversidade gentica de locos individuais das
populaes. Para as comparaes que revelaram correlao significante, foi
utilizado modelos de regresso linear. As anlises estatsticas foram realizadas
no programa STATISTICA 8.0, e nvel de significncia =0,05.

Resultados

A Tabela 2 apresenta os dados gerais das anlises

bioqumicas, ndices morfomtricos e resultados de anlise de microssatlites
realizados em espcimes de Phrynops geoffroanus para avaliao da correlao
heterozigosidade-fitness nas duas populaes avaliadas.

Tabela 2. Valores de mdia para todos os elementos avaliados no estudo para as duas reas analisadas neste estudo. O IHS e atividade das
enzimas foram avaliados somente no Crrego Felicidade (animais abatidos).

rea de Coleta

Ho

Peso (g)

IHS

EROD

GST

G6PDH

AChE

TBARS

TEAC

0,768

Tamanho
total (cm)
28,3

Crrego
Felicidade
Rio Preto

2245

1,076

5,18

0,85

2,73

34,62

55,05

564,67

1,98

0,719

30,24

2351,9

0,186

HO: heterozigosidade observada; cm: centmetros; g: gramas; K: fator de condio, IHS: ndice hepatossomtico (%); EROD: Etoxiresorufina-Odeetilase (pmol resorufina/min/mg proteina), GST: glutationa S-transferase (U/mg protena); G6PDH: glicose 6-fosfato desidrogenase (U/mg
proteina), AChE: acetilcolinesterase (U/mg protena); TBARS: espcies reativas ao cido tiobarbitrico (ng/mL); TEAC: capacidade antioxidante
equivalentes ao trolox (nM).


Captulo 4

As anlises comparativas entre amostras independentes

utilizando dados individuais entre CF e RP indicam que existem diferenas entre
as duas reas no que diz respeito HO, com RP apresentando os valores de HO
(Mann-Whitney, p=0,006) (Figura 1A). No entanto, comparaes dos valores de
fator de condio, indicam que CF apresenta os maiores valores deste ndice
(Mann-Whitney; p<0.01) (Figura 1B), refletindo o gradiente de contaminao
existente entre RP e CF, visto que RP apresenta os maiores ndices de
contaminao orgnica e qumica em relao ao crrego (CAMPANHA et al.,
2010).


Captulo 4

A)

B)

Figura 1. A) Avaliao dos valores de HO entre CF e RP; B) Avaliao dos valores de K

(fator de condio) entre as duas reas estudadas. O asterisco indica que h diferena
estatstica significativa entre as reas (Teste Mann-Whitney, p<0,05).


Captulo 4

Os testes univariados realizados no apresentaram correlao

entre heterozigosidade observada (HO) e peso do corpo (p=0,7749), tamanho do
corpo (p=0,89), atividade EROD (p=0,4348), GST (p=0,084), AChE (p=0,2310),
G6PDH (p=0,3228), TBARS (p=0,5046), TEAC (p=0,6066) e IHS (p=0,2669).
Entretanto, apresentou fraca correlao negativa com K (r=-0,3417; p=0.0175).
Anlises de regresso entre HO como varivel independente e K como varivel
dependente indicam que as variaes deste ndice dependem 11% de HO
(r2=0,1167; p=0.017) (Figura 2).




Figura 2. Anlise de correlao entre fator de condio (K), uma avaliao do fitness
individual, e heterozigosidade observada (HO) de cada indivduo avaliado no estudo. (r:
2
coeficiente de correlao; r : coeficiente de regresso).

Os testes de correlao entre HO e K para sexos separados

indicam a existncia de correlao fraca e negativa em fmeas (r=-0.3348;
p=0.04). Anlise de regresso indica que, neste sexo, as variaes de K



Captulo 4

dependem, como para a anlise da populao toda, 11% de HO (r2=0.112;

p=0.049). Contudo, a avaliao desta relao nos machos mostrou a no
ocorrncia dessa relao (r=0.069; p=0.82).

Discusso

Este

trabalho

primeiro

avaliar

correlao

heterozigosidade-fitness em espcimes de P. geoffroanus, uma espcie de

cgado endmica da Amrica do Sul. Observou-se correlao negativa entre
heterozigosidade de vrios locos e a condio de cgado-de-barbelas e, que
esta relao indica dependncia com o sexo.
Geralmente, espera-se que a heterozigosidade de todo o
genoma inferida por meio de marcadores neutros como os microssatlites 1)
seja reflexo de endogamia individual, e 2) covarie positivamente com o fitness,
gerando correlaes entre heterozigosidade-fitness (CHF) positivas (SZULKIN;
DAVID, 2011). No entanto, o resultado do contnuo endogamia-exogamia, a
depresso exogmica, esquecida: aps certo grau de heterozigosidade, os
heterozigotos tendem a apresentar fitness menores do que os homozigotos. A
depresso exogmica ocorre quando h alguma quebra de complexos gnicos
co-adaptados e/ou introgresso de genes no adaptados localmente, refletindo
em CHF negativas (LYNCH; WALSH, 1998). Significa dizer, portanto, que a
heterozigosidade nem sempre benfica (KPPER et al., 2010).
A depresso exogmica pode ocorrer por meio de adaptaes
locais como, por exemplo, quando ocorre fluxo de imigrantes em uma populao,
indivduos com genomas misturados tendem a ter maior proporo de alelos que
no tenham sido selecionados no contexto local (KAWECKI; EBERT, 2004).
Apesar da existncia de fluxos gnicos entre as populaes estudadas, no se
sabe qual a capacidade migratrias dos espcimes entre todas as reas da
bacia, implicando na dificuldade de confirmar a existncia e influncia da carga
gentica de outras populaes nas que foram avaliadas.
Poucos estudos relatam a ocorrncia de CHF negativa, e isso
se deve a vrios motivos: 1) questes de endogamia e seus efeitos em



Captulo 4

populaes naturais so mais comumente relatados na literatura. Isto

provavelmente se deve ao fato de que CHF negativo pode ser subestimado por
no apresentarem uma interpretao bvia; 2) a depresso exogmica pode no
ser to comum como a depresso endogmica, e certamente, a escala que a
depresso exogmica ocorre (dentro de populaes, entre populaes,
subespcies, etc.) pode ser txon-especfico, dificultando sua observao
(EDMANDS, 2007).
Na ausncia de depresso exogmica e vantagem do
homozigoto (underdominance), locos sob seleo direcional podem produzir
sinais de CHF negativo via codominncia ou vantagem do alelo recessivo
(MELLER et al., 2011). Estes mecanismos so importantes como causa de
CHF de vrios locos de populaes de grande tamanho efetivo so sujeitas a
mudanas ecolgicas recentes ou forte seleo flutuante (BELL, 2010;
MELLER et al., 2011). Cgado-de-barbelas tem mostrado sinais de adaptao
a locais altamente impactados por poluentes orgnicos e inorgnicos (SOUZA;
ABE, 2001; BRITES; 2002), inclusive suportando os maiores ndices de
concentrao de metais em rpteis descrito na literatura (PIA et al., 2009).
Alm disso, efeitos dependentes da densidade causados pela heterogeneidade
de hbitat (DHONDT et al., 1992) podem resultar em seleo flutuante nas
populaes destas reas.
Ao avaliar a CHF levando em considerao o sexo, pode-se
observar efeito negativo estatisticamente significativo somente nas fmeas; no
entanto, as anlises de correlao em machos tambm indicam correlao
negativa, porm no significativo (p>0,05, dados no apresentados), sugerindo
que a correlao entre heterozigosidade e fitness neste sexo tambm
negativa. A anlise no mostrou significncia possivelmente devido a
amostragem de machos, que foi inferior em relao ao nmero de fmeas.
Em vista das condies da rea e o impacto antropognico que
as populaes desta espcie esto sofrendo, torna-se difcil afirmar qual
condio

evolutiva

tem

direcionado

essa

relao

negativa

entre

heterozigosidade e fitness. Contudo, a condio de mudanas ecolgicas

recentes, como alteraes no leito do rio devido ao represamento e presena de
contaminantes ambientais, pode indicar reflexo de codominncia e vantagem de
alelo recessivo.



Captulo 4

Para confirmao deste dado, necessrio aumentar o nmero

amostral de indivduos e locos genotipados, associando marcadores neutros e
funcionais, isto , marcadores que esto localizados em regies expressas do
genoma. Marcadores neutros refletem fenmenos gerais afetando o genoma
como um todo (como endogamia ou exogamia), enquanto que marcadores
funcionais podem ser pressionados, possivelmente devido a seleo atuante
nele (OLANO-MARIN et al., 2011a,b). Associado a isso, faz-se necessria
tambm anlises de outros componentes do fitness, como tamanho da ninhada,
tamanho dos ovos, sucesso de ecloso dos ovos e sobrevivncia (WETZEL et
al., 2012).
Concluses

Os dados gerados sugerem a existncia de correlao negativa

entre heterozigosidade e fitness nas populaes de cgado-de-barbelas
analisadas, possivelmente por codominncia e vantagem de alelos recessivos
devido a mudanas ecolgicas recentes nas reas amostradas, refletindo a
influncia da atividade humana sobre essas populaes.
Na

perspectiva

conservacionista,

entender

como

as

populaes perdem o fitness importante para elaborar estratgias de manejo

(JAQUIRY et al., 2009). Como os efeitos gerais da heterozigosidade so
complexos, isto , efeitos negativos e positivos podem ocorrer simultaneamente,
e so dependentes do contexto (diferem entre os sexos, ambientes, traos e
locos) difcil predizer a heterozigosidade tima para indivduos de diferentes
locos em diferentes perfis ambientais (OLANO-MARIN et al., 2011). Essas
observaes indicam

a necessidade do conhecimento de marcadores

moleculares de vrias espcies em associao com avaliaes ecolgicas a fim

de averiguar o impacto das alteraes ambientais no fitness das espcies a fim
de auxiliar na persistncia das populaes naturais.

Referncias


Captulo 4

AMOS, W. Automated binning of microsatellite alleles: problems and solutions.

Molecular Ecology Notes, v.7, p.10-14, 2007.

BRITES, V.L.C. Hematologia, bioqumica do sangue, parasitologia,

microbiologia, algas epizorias e histopatologia de Phrynops geoffroanus
(Schweigger, 1812) (Testudinata, Chelidae), expostos a diferentes influncias
antrpicas no rio Uberabinha, Minas gerais. Tese de Doutorado, Universidade
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Discusso Geral

O principal objetivo deste estudo foi avaliar o papel da

influncia da atividade humana, como a contaminao ambiental e modificaes
do hbitat, como direcionadores de mudanas fisiolgicas, bioqumicas e de
diversidade gentica entre populaes de cgado-de-barbelas em uma das
bacias hidrogrficas mais impactadas do sudeste brasileiro. Este o primeiro
trabalho avaliando todos estes aspectos concomitantemente em populaes
naturais endmicas do Brasil e utilizando como objeto de estudo a espcie
Phrynops geoffroanus.
Entender como o impacto da ao do homem nas
populaes naturais de fundamental importncia para preservar o potencial
evolutivo de populaes ameaadas, pois diversidade gentica elevada confere
o potencial de adaptao a foras seletivas (GILLESPIE; GUTTMAN, 1989).
Entretanto, vrias alteraes em uma pequena escala temporal, como aquelas
ocasionadas pelo homem, podem interferir na condio e variabilidade gentica,
reduzindo a viabilidade (fitness) de populaes naturais (STANTON et al., 2000;
MAES et al., 2005).

Por que Phrynops geoffroanus?

Estudos anteriores avaliando a espcie em questo apontaram

para a existncia de resposta em nvel celular e molecular de P. geoffroanus ao
impacto ambiental, principalmente em relao poluio qumica e orgnica
(ZAGO et al., 2010a,b).
No entanto, a alta densidade populacional em reas com
registro de contaminantes qumicos e orgnicos em diferentes regies, sugere
que a espcie se adapta facilmente a essas condies (PIA et al., 2009).
Contudo, o reflexo dessas modificaes do hbitat na estrutura gentica dessas
populaes ainda no havia sido investigado, direcionando, ento, os objetivos
deste estudo ecotoxicolgico evolutivo.
Alm

desses

fatores,

importante

salientar

pouco

conhecimento cientfico existente sobre esta espcie de cgado, tanto ecolgico




Discusso Geral

como gentico, sendo essa espcie alvo de controvrisa taxonmica. Deste

modo, este estudo tambm teve por inteno contribuir para incrementar o
conhecimento sobre a biologia da espcie.

Phrynops geoffroanus e controle do dano oxidativo

A fim de analisar o impacto da contaminao qumica e

orgnica na espcie de estudo, foram realizadas anlises ecotoxicolgicas
visando avaliar a ao de alguns dos principais componentes envolvidos com a
proteo ao estresse oxidativo e metabolismo de detoxificao de fase I e II, e
capacidade antioxidante, como descrito no Captulo 1 desta Tese.
A

primeira

fase

do

metabolismo

adiciona

grupos

funcionalmente reativos, envolvendo oxidao, reduo ou hidrlise (GOEPTAR

et al., 1995). Para a maioria dos compostos xenobiticos as reaes de fase I
so catalizadas por monooxygenases microssomais, como por exemplo,
citocromo P450, citocromo b5 e NADPH citocromo P450 redutase. As citocromo
P450 compreendem uma grande famlia de heme protenas; so protenas de
membrana que predominantemente esto localizadas no retculo endoplasmtico
do fgado (BUCHELI; FENT, 1995), mas tambm podem ser encontrados em
vrias outras organelas e tecidos.
A principal caracterstica desses sistemas a habilidade em
facilitar a excreo de certos compostos pela fase I do metabolismo,
transformando xenobiticos lipoflicos em compostos mais solveis em gua
(BUCHELI; FENT, 1995). A induo dessas enzimas iniciada pela ligao de
um xenobitico especfico a um complexo de protenas que compreende o
receptor Ah citoslico (AhR aryl hydrocarbon receptor) e a protena heat shock
90 (HSP 90). O complexo AhR ento liga-se a aryl hydrocarbon nuclear
transferase (ARNT) e migra para o ncleo celular. No ncleo da clula, ARNT
liga-se a um stio de reconhecimento no DNA upstream aos genes do citocromo
P450, tambm conhecidos como elementos reguladores de xenobiticos (XRE)
ou elementos responsivos a dioxinas (DRE). Fatores de transcrio podem ter
desta


forma

amplo

acesso

regio

promotora

do

gene

CYP1A.

Discusso Geral

Consequentemente, a sntese de mRNA aumentada, resultando na elevao

dos nveis da protena (STEGEMAN; HAHN, 1994).
A segunda fase do metabolismo envolve a conjugao de
compostos xenobiticos ou seus metablitos com um ligante endgeno. Essas
reaes compreendem a adio de grandes grupos qumicos polares, ou
compostos como acares e aminocidos (LECH; VODICNIK, 1985). O mais
importante grupo polar adicionado pelas enzimas de fase II a glutationa (GSH)
para compostos eletroflicos (GEORGE, 1994). O mecanismo de induo da fase
II semelhante da fase I, isto , a regulao desses processos mediada
tambm pelo AhR (HAYES; PULFORD, 1995). A conjugao de compostos
eletroflicos (ou metablitos da fase I) com GSH catalizada pelas glutationa Stransferases (GSTs), uma famlia multignica de enzimas dimricas e
multifuncionais. O papel mais importante das GSTs a defesa contra o dano
oxidativo e produtos de peroxidao de DNA e lipdios (GEORGE, 1994).
Comparado com muitos pssaros e mamferos, vertebrados
ancestrais (peixes, anfbios e rpteis) so tolerantes a disponibilidade varivel de
oxignio. Muitas espcies de peixes e tartarugas representam o grupo de
vertebrados mais tolerantes anxia, sobrevivendo falta completa de oxignio
por perodos prolongados (BICKLER; BUCK, 2007). Atualmente, a literatura
apresenta uma gama de informaes sobre as respostas e os mecanismos
adaptativos que permitem longos perodos de submergncia anxica em
tartarugas de gua doce como Chrysemys picta picta e Trachemys scripta
elegans

(WILLMORE;

STOREY,

1997;

HERMES-LIMA

et

al.,

2001;

HOCHACHKA; LUTZ, 2001; LUTZ; MILTON, 2004; WILLMORE; STOREY, 2005;

STOREY, 2007; KRIVORUCHKO; STOREY, 2010; PAMENTER et al., 2011).
As espcies de tartarugas tolerantes hipxia/anxia so
animais aerbicos que dependem do oxignio para suas funes normais. Mas
estes animais so tambm anaerbios facultativos, e portanto, que possuem
elementos que permitem a manuteno das funes orgnicas em nveis
mnimos em situaes de nenhuma disponibilidade de oxignio. A baixa taxa
metablica e a manuteno de nveis suficientemente altos de ATP so os
principais elementos que permitem tolerncia desses animais ausncia de
oxignio (BICKLER; BUCK, 2007).

Discusso Geral

Entretanto, o retorno condio aerbia, ou seja, o retorno da

respirao quando da submerso, gera uma situao potencialmente perigosa
de superproduo de ERO. Esta situao anloga ao que ocorre em rgos de
mamferos sujeitos isquemia e reperfuso. A diferena fundamental entre, por
exemplo, um corao humano isqumico e uma tartaruga sob anoxia que
estas desenvolveram mecanismos especficos que permitem a sobrevivncia a
este tipo de estresse. Os mecanismos associados a esta proteo esto
intimamente relacionados com aqueles envolvidos na diminuio da produo de
ERO e a grande capacidade antioxidante (HERMES-LIMA; ZENTENO-SAVN,
2002; STOREY, 2007; GORR et al., 2010).
Em

estudos

com

tartarugas

dulccolas

tolerantes

anxia/hipxia, a atividade de vrias enzimas antioxidantes foi monitorada em

fgado, encfalo, corao, rins, msculo vermelho e branco. A exposio
anxia leva a significante diminuio na atividade destas enzimas. O corao o
rgo que mais se destaca durante o estresse da anxia com 31-67% de
diminuio na atividade de trs enzimas (CAT, GR, GST). No entanto, a
atividade da GSH-sintetase trs vezes maior na musculatura branca em
condies de anoxia, assim como a atividade da GR no fgado e na musculatura
vermelha (WILLMORE; STOREY, 2005, 2007).
Aps as informaes citadas acima paradoxal pensar que os
rgos de tartarugas apresentam alta atividade de enzimas antioxidantes e altos
nveis de GSH. Na verdade, a atividade destas enzimas, apesar de ser alterada
pela condio de anxia, alcana nveis muito maiores quando comparados com
outros vertebrados no-mamferos e mamferos, mesmo quando a taxa
metablica extremamente baixa. Significa dizer, portanto, que mesmo com a
diminuio da atividade de algumas enzimas antioxidantes e dos nveis de GSH,
a atividade remanescente ainda suficiente para proteger os tecidos do dano
oxidativo durante a reoxigenao (WILLMORE; STOREY, 2005, 2007).
Aps avaliao bioqumica das atividades EROD (referente ao
citocromo P450), GST, AChE (acetilcolinesterase), ndices morfomtricos (fator
de

condio

ndice

hepatossomtico),

G6PDH

(glicose

6-fosfato

desidrogenase), TBARS (peroxidao lipdia) e TEAC (capacidade antioxidante),

observou-se, nos espcimes de ambiente urbano avaliados nesse estudo,
resposta destes elementos quando comparados espcimes de ambiente


Discusso Geral

controlado. Esses resultados indicam a influncia de efluentes domsticos e

industriais no metabolismo de detoxificao e estresse oxidativo. No entanto,
apesar do aumento da atividade EROD e o efeito da atividade da GST, os
valores mdios de GST na rea urbana esto dentro daqueles esperados em
condio de hipxia descritos na literatura. Esta observao sugere que o
aumento da GST em resposta produo de ERO pela presena de poluentes,
aumenta a rede de defesa antioxidante, controlando os danos oxidativos
causados pela hipxia e pela reperfuso.
Desta maneira, pode-se inferir que o elevado controle do dano
oxidativo para proteo dos tecidos contra os efeitos da hipxia empenham
papel fundamental para o suporte desses organismos em reas altamente
contaminadas, controlando os efeitos dos radicais livres gerados pelo
metabolismo de detoxificao. No entanto, os ndices morfolgicos indicam a
existncia de resposta fisiolgica, sugerindo que espcies de rea contaminada,
apesar de adaptadas, demandam maior esforo fisiolgico para o controle da
homeostase, como observado pelos menores valores de fator de condio.
Sendo assim, pode-se sugerir que a elevada capacidade antioxidante o
elemento fundamental para conferir adaptao destes animais a reas altamente
contaminadas por poluentes qumicos e orgnicos.

Investigando a condio como reflexo do bem-estar animal em reas

contaminadas

No Captulo 2, com o intuito de estimar a condio, que reflete

a aptido (fitness) individual do animal (GREEN, 2000), foi avaliada a relao
matemtica entre peso e comprimento, que indicam alteraes na forma do
corpo e no incremento em peso, que permitem inferncias sobre a sade e o
bem-estar animal. Os dados gerados indicam diferenas em condio que esto
associadas rea de avaliao, mas tambm ao sexo e perodo reprodutivo,
indicando forte influncia de estressores ambientais na fisiologia dos espcimes
analisados.

Discusso Geral

Os resultados gerados sugerem que as intensas flutuaes na

condio das fmeas analisadas esto em associao com o perodo de
nidificao, acasalamento e desova, apresentando os menores valores nos
perodos de produo de ovos e vitelognese. Alm disso, a relao inversa
entre peso/comprimento e K sugere que o esforo fisiolgico maior quando h
aumento do peso do corpo e possibilidade de aumentar o nmero de ovos a ser
produzido, indicando que animais mais novos, e que no possuem maturao
gonadal possuem maior condio por apresentarem menor depleo das
reservas energticas. Isto indica que modificaes no fator de condio em
fmeas e machos esto associadas principalmente com as mudanas
fisiolgicas

provocadas

pela

maturao

sexual,

relacionando-se

com

modificaes gonadais e presena de ovos.

A observao mais relevante desta anlise que o fator de
condio refletiu diretamente as anlises fsico-qumicas e o gradiente de
contaminao das reas avaliadas. Campanha et al., (2010) afirmam que estas
reas encontram-se altamente degradadas, afetadas principalmente pelo
lanamento de efluentes domsticos in natura. Os autores destacam que os
crregos Felicidade e rio Preto, apresentaram concentrao dos parmetros
avaliados em desacordo com os valores admissveis pela Resoluo CONAMA
357/05. O rio Preto um dos corpos aquticos mais impactados da bacia,
contaminados por efluentes domsticos da cidade de So Jos do Rio Preto e
cidades vizinhas, seguido pelo Crrego Felicidade, contaminado por efluente
agrcola e urbano.

Alm do impacto por poluentes, observa-se tambm a

influncia das modificaes no hbitat provocadas pelo represamento do rio. No

entanto, sugere-se que a espcie seja resistente a estressores ambientais,
mostrando, inclusive, grande biomassa e alta densidade populacional nestes
locais (BRITES, 2002; SOUZA; ABE, 2000; PIA et al., 2009).
Deste modo, o fator de condio mostrou-se um parmetro
importante para detectar influncia sazonal e modificaes ambientais no bemestar e sade dos espcimes estudados.

Discusso Geral

Microssatlites e estrutura gentica de populaes

Para
diversidade

gentica

avaliar
de

influncia

populaes,

das

atividades

marcadores

humanas

moleculares

do

na
tipo

microssatlite foram analisados em indivduos amostrados nas duas reas de

coleta (crrego Felicidade e rio Preto), e os resultados foram apresentados no
Captulo 3.
No entanto, no existem na literatura marcadores moleculares
descritos para a P.geoffroanus, apontando, ento, a necessidade de identificar
regies no genoma desta espcie para a realizao deste tipo de estudo. Para
tanto, como proposta inicial, foram construdas duas bibliotecas genmicas
parciais com repeties dinucleotdicas (CA15, CT15) enriquecidas com
microssatlites por meio da tcnica de hibridizao seletiva para a espcie de
interesse. Foram gerados aproximadamente 500 clones recombinantes que
foram submetidos sequenciamento direto. Entretanto, a tcnica de hibridizao
seletiva mostrou-se pouco eficiente para o isolamento de microssatlites para
cgado-de-barbelas, resultando em um nmero elevado de clones redundantes,
ou sem regies repetitivas, ou ainda sequencias desprovida das caractersticas
previamente estabelecidas (motivos repetidos por no mnimo trs vezes o
tamanho mnimo de 10 bases da sequencia de microssatlite).
Mesmo com essas dificuldades, foram desenhados dois pares
de oligonucleotdeos iniciadores a partir dos clones recombinantes; no entanto,
no foi possvel inclui-los na anlise por problemas na amplificao dos dois
locos, como excesso de bandas inespecficas, o que resultou na dificuldade em
genotip-los.
Deste modo, foram utilizados pares de oligonucleotideos
iniciadores desenvolvidos para duas outras espcies de quelnio brasileiro:
Podocnemis unifilis e P. expansa (SITES et al., 1999; FANTIN et al., 2007). A
utilizao

de

microssatlites

entre

espcies

relacionadas

depende

da

conservao dos stios de anelamento dos iniciadores dentro da regio

flanqueadora, a fim de possibilitar a amplificao e a manuteno do tamanho
das repeties (WEBER, 1990). A presena de regies flanqueadoras altamente
conservadas foi demonstrada para alguns microssatlites em cetceos
(SCHLTTERER et al., 1991), em tartarugas marinhas (FITZSIMMONS et al.,


Discusso Geral

1995), em jacars sul-americanos (ZUCOLOTO et al., 2006) e tartarugas

dulccolas (ALACS et al., 2009). Os estudos de amplificao cruzada de
microssatlites permitiram confirmar a possibilidade de amplificao de
microssatlites utilizando pares de iniciadores para PCR de espcies que
divergiram cerca de 470 milhes de anos atrs.
Os resultados do estudo de gentica de populaes indicaram
a no ocorrncia de duas populaes panmticas, mas que a estrutura gentica
entre as localidades semelhante. Esta pequena diferenciao gentica deve-se
especialmente a ocorrncia expressiva de fluxo gnico entre as reas,
impedindo a diferenciao gentica das duas populaes. Contudo, a anlise de
estrutura intrapopulacional indicou a existncia de agrupamentos populacionais,
sugerindo subestruturao gentica dentro das populaes estudadas.
De maneira geral, os dados sugerem que, apesar da alta
diversidade gentica apresentada, h sinais de vulnerabilidade gentica
provocada

por

alteraes

demogrficas.

Esse

impacto

na

demografia

possivelmente tenha ocorrido pelo processo de contaminao, modificao do

leito do rio (represamento), e assoreamento. O processo de alterao do leito do
rio implica em modificaes de curso dgua, construo de barreiras nas
encostas, ocasionando a perda de indivduos adultos e, em especial, na
destruio de ninhos e reas de desova, influenciando diretamente no nmero
de indivduos em fase reprodutiva e de novas geraes. A perda de hbitat um
dos elementos chave e determinante para processos de extino (SAX;
GAINES, 2003; EWERS; DIDHAM et al., 2006; BROOK et al., 2008), podendo
apresentar implicaes imediatas em alguns casos, mas geralmente necessita
de um perodo de tempo razovel para que populaes em declnio
desapaream em consequncia de alteraes ambientais (KUUSSAARI et al.,
2009).

Heterozigosidade-fitness

A interao entre diversidade gentica e fitness um elemento

chave para o processo evolutivo e entender esse processo para conservao de
espcies fundamental (DESALLE; AMATO, 2004). O Captulo 4 desta tese


Discusso Geral

teve como objetivo estimar a correlao entre o nvel mdio de heterozigosidade

e fitness nos indivduos das populaes avaliadas.
Os resultados sugerem a existncia de correlao negativa
entre heterozigosidade e fitness. Esta situao pode ser explicada por 1)
ocorrncia de depresso exogmica, isto , introgresso de genes no
adaptados localmente (LYNCH; WALSH, 1998), 2) codominncia ou vantagem
do alelo recessivo. Estas situaes ocorrem quando populaes de grande
tamanho efetivo so sujeitas a mudanas ecolgicas recentes ou forte seleo
flutuante (BELL, 2010; MELLER et al., 2010).
O perfil da correlao entre heterozigosidade e fitness reflete o
perfil de mudanas estruturais e ecolgicas nas populaes estudadas,
indicando a importante influncia do homem na biologia de populaes naturais.

Consideraes Finais

Este estudo no prov somente dados de biomarcadores de

contaminao, mas a utilizao de mtodos integrados com a finalidade de
avaliar o impacto acumulativo da exposio a contaminantes orgnicos e noorgnicos e modificaes em hbitat por meio do estudo de gentica de
populaes e efeitos evolutivos. Alm disso, os dados gerados aqui acrescentam
importantes informaes a respeito da biologia da espcie avaliada.
As perguntas aqui levantadas indicam a necessidade de
incluso de maior nmero de stios de referncia para avaliao e confirmao
dos padres de estrutura gentica e induo de elementos do metabolismo de
detoxificao em condies ambientais diferentes, dentro de toda a bacia
hidrogrfica. Contudo, pode-se verificar que a espcie apresenta alta capacidade
antioxidante

que

permite

sua

sobrevivncia

em

ambientes

altamente

contaminados por poluentes qumicos e orgnicos, mas que a diversidade

gentica pode estar sendo afetada pelas modificaes ecolgicas no hbitat. O
conhecimento das causas e processos do relacionamento entre estressores
ambientais e seus efeitos importante para o manejo efetivo e restaurao do
dano a ecossistemas aquticos e as comunidades associadas.

Concluses

1) Os sistemas relacionados com a biotransformao de xenobiticos e

capacidade antioxidante em Phrynops geoffroanus foram responsivos a
presena de contaminantes orgnicos e qumicos presentes no ambiente
pelo despejo de efluentes domsticos e industriais em comparao com
espcimes de ambiente controlado;

2) A atividade de GST e G6PDH mostrou-se mais elevada no ambiente

urbano, indicando aumento da capacidade antioxidante e controle do
dano oxidativo causado pela presena de poluentes;

3) A elevada capacidade antioxidante naturalmente existente em espcies

hipxia-tolerantes, como o caso de P. geoffroanus, confere proteo ao
dano oxidativo provocado pelos metablitos gerados pelos sistemas de
biotransformao de xenobiticos, e indicativo de elemento primordial
para a adaptao desta espcie a ambientes degradados;

4) A condio, indicativo de bem-estar e sade animal, dependente da

rea amostrada, gradiente de contaminao, perodo reprodutivo,
pluviosidade, temperatura e sexo em P. geoffroanus. Portanto, machos e
fmeas apresentam recrutamento e gasto energticos diferenciados;

5) A partir da avaliao da estrutura gentica entre populaes do rio Preto

e do crrego Felicidade, baseada em microssatlites, constatou-se que
no h diferenciao gentica entre as duas populaes, devido ao
extenso fluxo gnico entre elas e elevada diversidade gentica;

6) Com a anlise de estruturao intrapopulacional, observa-se a existncia

de cinco agrupamentos genticos, que reflete as alteraes no hbitat
gerados pelo represamento e assoreamento nas reas estudadas, que
esto iniciando processos de separao (barreira) de sub-populaes
existentes;

Concluses

7) A avaliao histrica e demogrfica no indica evento de gargalo da

garrafa;

8) A correlao negativa entre heterozigosidade-fitness reflete as mudanas

ecolgicas

recentes

associadas

contaminao

ambiental

represamento;

9) P. geoffroanus apresenta adaptao contaminao ambiental, mas

modificaes ecolgicas e possvel perda do hbitat esto alterando a
diversidade gentica das populaes estudadas.

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Anexos

A) Documento

de

Aprovao

para

experimentao

animal

pela

Comisso de tica na Experimentao Animal da Faculdade de

Medicina de So Jos do Rio Preto


Anexos

B) Licena para atividade com finalidade cientfica concedida pelo

IBAMA (2008-2009)

Anexos

C) Licena para atividade com finalidade cientfica concedida pelo

IBAMA (2009-2012)