Sesin 5 Aplicaciones en cromatografa instrumental (HPLC& CG)

Introduccin:
La cromatografa lquida (CL) es el nombre usado para describir cualquier
procedimiento cromatogrfico en el cual la fase mvil es un lquido.
En cromatografa lquida clsica, la columna rellena de partculas grandes (~150250mm), permite la separacin de los componentes de la mezcla por el paso del
eluyente a travs de la misma; la separacin se alcanza por la distribucin diferencial
de los componentes de la muestra entre las fases mvil y estacionaria.
El principal factor que limita el funcionamiento de la columna en la cromatografa
lquida clsica de lecho abierto, es la disminucin de la velocidad de difusin de las
molculas de soluto entre las fases debido al uso de un eluyente lquido. La clave para
mejorar la eficiencia de la columna en CL es aumentar la velocidad de transferencia de
masas y el equilibrio de las molculas del soluto entre las fases mvil y estacionaria.
Esos objetivos pueden alcanzarse usando columnas rellenas con partculas de
pequeo tamao, pero al disminuir el tamao de partcula del relleno dificultad
grandemente la elucin por gravedad aplicada en las separaciones clsicas, pues es
necesario presurizar la fase mvil para que pueda atravesar la fase estacionaria.
Debido a esta necesidad a finales de los aos 60, que ya se contaba con la tecnologa
necesaria, surge una tcnica cromatografica que en sus inicios se nombr
Cromatografa Liquida de Alta Presin o High Pressure Liquid Chromatography,
trmino que ms tarde fue sustituido por el actualmente empleado Cromatografa
Liquida de Alta Resolucin o High Performance Liquid chromatography (HPLC), la cual
consiste en hacer pasar una muestra contenida una mezcla de solventes (fase movil) a
travs de una columna que contiene un slido (fase estacionaria) con un tamao de
partculas de 3 40 m segn el tipo de relleno, la fase mvil es impulsada por una
bomba que regula el flujo y a la salida de la columna se coloca una detector que sigue
el paso de los solutos y permite obtener el cromatograma en un registrador.

El esquema principal de un equipo de HPLC ser el siguiente:

Al realizar una separacin por HPLC se deben de conocer algunos aspectos

importantes que abordaremos a continuacin:
-

Propiedades de los solventes para ser utilizados en HPLC

No todos los solventes son adecuados para HPLC ya que la condicin de estado
lquido no es suficiente por s misma para que una sustancia se pueda emplear
como fase mvil, por lo que un solvente ser apropiado para HPLC cuando cumpla
con los siguientes requisitos:
-

Alto poder solubilizante de las muestras.

Baja reactividad.

Compatibilidad con el detector.

Adecuado punto de ebullicin

Baja viscosidad

Alto grado de pureza.

Forma en que se realiza la separacin segn la composicin de la fase mvil:

Elucin Isocrtica: La composicin de la fase mvil no vara durante la

separacin cromatografica.

Elucin por Gradiente: La composicin de la fase mvil vara durante la

separacin cromatogrfica, mediante un gradiente de concentracin de uno
o varios de los componentes de la misma. Ejemplo: En una mezcla de
acetonitrilo/H2O a un 5% de acetonitrilo se varia

de forma lineal la

concentracin de este hasta un 50% en 25 minutos.

Sistema de inyeccin de muestra:

Jeringuilla y Septum: La aguja de la jeringuilla atraviesa un septum elstico y la

muestra se inyecta a una capa de vidrio pulverizado para evitar disturbios en el borde
superior del empaquetamiento de la columna que podra causar una seria afectacin a
la resolucin al dispersar la muestra sobre una pequea parte de la seccin de la
columna. La inyeccin con jeringuilla es econmica y la cantidad de muestra puede
variarse, segn se requiera; la tcnica es sencilla de operar, pero no puede ser usada
a presiones superiores a 750 psi, adems de terne una muy baja reproducibilidad
(alrededor de un 3%).

Vlvula Rotatoria: Estas vlvulas constan de dos pasos o posiciones mediante

las cuales se logra una mejor introduccin de la muestra a la columna, resultan

precisas y permiten una cantidad de muestra exacta con una interrupcin mnima en el
flujo del solvente. Pueden usarse hasta presiones en la columna de 7000 psi y la
cantidad de muestra a inyectar depender del volumen del lazo el cual puede
cambiarse variando 5ul 2ml segn el tipo de separacion a realizar (preparativa,
semipreparativa, analtica).

Como el HPLC es un tipo de cromatografa lquida en columna son aplicables todos

los mecanismos de separacin existentes:

Exclusin Molecular.

Adsorcin

Distribucin

Intercambio inico

Afinidad

De acuerdo al tipo de mecanismo de separacin ser el tipo de relleno que se

emplear en la columna cromatogrfica.

Detector

Es conveniente usar detectores continuos localizados a la salida de la columna. Se

han usado varios diseos y pueden ser clasificados como los que registran una
propiedad especfica del soluto o por aquellos que detectan cambios en alguna
propiedad del eluyente de la columna.
Un ejemplo del primero es el espectrofotmetro UV, el cual puede ser de longitud de
onda fija (usualmente 254 o 280nm) o de diseo de longitud de onda variable. El
detector funciona registrando los cambios en la absorbancia al pasar el soluto a travs
de la celda del detector, o sea, l utiliza la propiedad especfica del soluto para
absorber radiacin UV.
Un ejemplo del segundo tipo de detector es el registro del ndice de refaccin, el cual
funciona registrando los cambios refractivos en el eluyente a medida que pasa a travs
de la celda del detector. Los detectores de la propiedad de la solucin, aunque ms
verstiles, son en general varios ordenes de magnitud menos sensibles que los
detectores de la propiedad especfica y la seleccin, para una aplicacin particular, es
frecuentemente dictada por las caractersticas del soluto.

Separacin y determinacin de hidrocarburos policclicos aromticos mediante

HPLC
Tcnica Operatoria.

1. Encender el equipo y cargar en la computadora el software CXTH-3000.

2. Fijar los parmetros para la separacin, velocidad de flujo 1ml/min., longitud de
onda del detector 254 nm, tiempo de adquisicin 20 minutos.
3. Inyectar la muestra colocando la vlvula en la posicin load y llevando la a la
posicin de inyeccin inject sin retirar la jeringuilla de la vlvula.(una muestra
para cada pareja)
4. Retirar la jeringuilla y esperar que transcurra el tiempo de adquisicin
establecido.
5. Guardar el cromatograma en la carpeta HPLC en la computadora y repetir los
pasos del 3 al 5 para los 3 patrones de identificacin de los componentes de la
muestra.
6. Una vez identificados los componentes de la muestra, seleccionar la curva de
calibracin multielemental correcta de acuerdo con el resultado del anlisis
cualitativo.
7. Repetir los pasos de 3 al 5 para cada uno de los patrones de la curva.
Trabajo con los Resultados:

Construya dos curvas de calibracin una de altura del pico vs

concentracin y otra de rea del pico vs concentracin, para cada
componente.

Calcule la concentracin de cada componente de la muestra.

Calcule el nmero de platos terico para cada componente de la

muestra.

Determine la resolucin de la separacin cromatogrfica.

Identificacin y cuantificacin de los componentes de la tableta de Cotrimoxazol (sulfaprim) mediante HPLC.

Introduccin
La industria farmacutica cubana en el afn de mejorar la calidad de los
medicamentos y su disponibilidad produce numerosas formas farmacuticas
entre las que se encuentran las tabletas. Dentro de estas uno de los grupos
farmacolgicos de mayor importancia estn los antibiticos de amplio espectro
como las sulfas, de aqu que identificar y cuantificar los principios activos
antibiticos presentes en la tableta de co-trimoxazol sea de inestimable
importancia para garantizar su potencia y efecto. Este antibitico consiste en
una mezcla de sulfametoxazol (400 mg), trimetoprim (80 mg) y otros
excipientes acompaantes. Uno de los mtodos ms empleados para este
caso es el HPLC en la variante isocrtica con deteccin UV, la que ser
empleada en esta prctica utilizando adems diferentes criterios de
identificacin y cuantificando por el mtodo del estndar externo.

Materiales necesarios:
1. Tabletas de Co-trimoxazol (2).
2. Patrones de sulfametoxazol y trimetoprim.
3. Mortero y pistilo.
4. Balanza analtica.
5. pHmetro
6. Volumtricos de 10 mL
7. Volumtrico de 500 mL
8. Equipo de Ultrasonido
9. Beaker de 1000 mL
10. Beaker de 100 mL
11. Agitador de vidrio.
12. Pipetas de 1 mL aforadas
13. Papel para pesadas
14. Cucharilla
15. Solventes: Trietilamina (0,5 ml), Acetonitrilo (100 mL), agua destilada
(500 mL), disolucin de cido actico (1 en 100 mL), NaOH (2 mol/L).
16. Papel de filtro.

17. sistema de filtracin para fase mvil.

18. HPLC y aditamentos necesarios.

Preparacin de la fase mvil:

1. En un beaker de 100 mL adicione 350 mL de agua destilada, 0,5 ml de
trietilamina y 100 mL de acetonitrilo, mezcle y ajuste a pH 5,9 empleando
disolucin de cido actico (1 en 100) o NaOH segn convenga.
2. Trasvase a volumtrico de 500 ml, enrase y homogenice.
3. Filtre y desgasifique la fase mvil usando el sistema de filtracin.

Preparacin de la muestra.
1. Pese dos tabletas de Co-trimoxazol y calcule el peso promedio (Pp)
2. Triture ambas en un mortero y pese el equivalente al 10 % del Pp.
3. Determine la masa en mg tericos que debe tener de cada Principio
activo el 10 % pesado (P terico sulfametoxazol) y (P terico
trimetoprim)
4. Trasvase la pesada a volumtrico de 50 ml, aada 30 ml de metanol y
sonifique o agite por 5 minutos segn le indique el profesor.
5. Enrase con metanol, Homogenice y filtre en un beaker de 100 ml.
6. Realice una dilucin de 1 ml (a partir del filtrado) en volumtrico de 10
mL enrasando con fase mvil. Homogenice al final.

Preparacin de los patrones de referencia.

Patrn de Sulfametoxazol 80 g/mL.
Pese exactamente 8,0 mg (anote la pesada exacta) y disuelva en 10 ml de
metanol, tome una alcuota de 1 ml y lleve a 10 ml enrasando con fase mvil.
Se obtiene una disolucin de 80 g/mL.
Patrn de Trimetoprim 16 g/mL.

Pese exactamente 16,0 mg (anote la pesada exacta) y disuelva en 10 ml de

metanol (disolucin 1), tome una alcuota de 1 ml (de disolucin 1)y lleve a 10
ml enrasando con fase mvil (disolucin 2), tome nuevamente 1 ml (de
disolucin 2)y lleve a 10 ml enrasando con fase mvil (disolucin patrn). Se
obtiene una disolucin de 16 g/mL.
Condiciones del HPLC
Sistema isocrtico, flujo 1 ml/min, detector UV-visible con = 254 nm,
inyectando 20 L en columna C8.
Procedimiento de trabajo:
1. Determinar cul de los picos corresponde a sulfametoxazol y cual a
trimetoprim empleando el tiempo de retencin como criterio de
identificacin (
2. Cuantificar

ambos

analitos

partir

del

rea

correspondientes por el mtodo de patrn externo

de

sus

picos