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Investigao Fitoqumica e Isolamento da Substncia Antibacteriana

Presente na Espcie Ananas erectifolius (curau)


Helen Cristiane Arajo Souza1, Wagner L. R. Barbosa1 , Jos Maria Vieira2
1Laboratrio de Fitoqumica, 2Laboratrio de Microbiologia, Departamento de Farmcia, Centro de Cincias
da Sade, Universidade Federal do Par. Bolsa PIBIC/CNPQ.CEP: 66075-110, Belm-PA, tel: (091)2111204,
e-mail:barbosa@ufpa.br

RESUMO
O Ananas erectifolius uma Bromelicea ainda pouco conhecida, sabe-se, no entanto de seu
uso popular na cicatrizao de leses cutneas. Este trabalho tem por objetivo propiciar
informaes sobre a espcie e investigar seus constituintes qumicos e propriedade
antibacteriana contra cepas de Sthaphylococcus aureus. O extrato etanlico bruto foi
fracionado por partio slido-lquido com hexano, acetato de etila e metanol. As fraes
foram submetidas CCD para determinao de seu perfil cromatogrfico e bioautografia
para anlise da atividade antibacteriana. O isolamento da substncia ativa a partir da frao
hexnica foi realizada em coluna LoBar de gel de slica de fase normal utilizando o sistema
CLAE a baixa presso (at 6 bar). Aps o isolamento do componente ativo procedeu-se nova
bioautografia, a fim de confirmar a atividade da substncia ativa. Esta substncia ativa foi
utilizada como referncia em experimentos posteriores. A fim de se identificar quimicamente
o componente ativo do vegetal procedeu-se ao preparo e fracionamento em coluna de uma
nova partida de extrato etanlico, com monitoramento de atividade, obtendo-se uma frao
rica em substncia ativa.
ABSTRACT
1-INTRODUO
O Ananas erectifolius uma Bromelicea pertencente ao gnero Ananas e popularmente
conhecida como curau [1]. O p de curau utilizado na medicina popular para a
cicatrizao de leses cutneas[2], enquanto que suas fibras podem ser utilizadas para a
fabricao de papel, na produo de componentes para bancos e revestimento de
automveis[3], alm de ser empregadas para confeco de cordas e barbantes[4]. Existem duas
variedades de Curau: o roxo e o branco (Fig.1). A variedade branca foi utilizada para a
realizao deste trabalho (Fig.2).
2- Objetivos
Produzir informaes a cerca da espcie;
Determinar o perfil fitoqumico e cromatogrfico da frao hexnica e do extrato
etanlico bruto;
Avaliar, isolar e identificar o componente com atividade antimicrobiana presente na frao
hexnica.

Revista Cientfica da UFPA http://www.ufpa.br/revistaic Vol 4, abril 2004

3- Material Vegetal
O material vegetal foi coletado na Empresa Brasileira da Amaznia Oriental
(EMBRAPA), onde procedeu-se a caracterizao do exemplar no laboratrio de Botnica
pela Dr. Silvane Tavares Rodrigues.

Fig.1: Variedades branca e roxa

Fig.2: variedade branca

4- METODOLOGIA
4.1- PREPARAO DO EXTRATO
O material vegetal fresco coletado pesou 1,4 Kg, foi lavado, fragmentado, seco a sombra
e a temperatura ambiente (27 C) por 3 semanas, por fim foi levado estufa a 50C por 2
dias.
Aps a secagem, o material vegetal foi triturado com etanol, usando-se para isso 2L do
solvente. O material foi submetido macerao por 6 dias, aps o que foi filtrado, resultando
no extrato etanlico, que foi concentrado, obtendo-se o extrato etanlico bruto seco (EEB),
para ser usado na abordagem fitoqumica e na cromatografia em camada delgada.

4.2- ABORDAGEM FITOQUMICA DO EXTRATO BRUTO E DA FRAO


HEXNICA
A abordagem fitoqumica do EEB e da frao hexnica dele obtida foi realizada para que
se pudesse estabelecer uma comparao quanto aos compostos presentes tanto no EEB
quanto na FHex. Os testes realizados foram baseados no Manual para Anlise Fitoqumica e
Cromatografia de Extratos Vegetais (2001)[5] e avaliou a presena dos seguintes metablitos
secundrios: cidos Orgnicos, Acares Redutores, Alcalides, Antraquinonas,
Carotenides, Catequinas, Esterides e Triterpenides, Fenis e Taninos, Flavonides,
Polissacardeos Protenas e Aminocidos e Saponina Espumdica.

4.3- PARTIO SLIDO-LQUIDO


O EEB foi fracionado por partio slido-lquido, lavando-se o extrato com 45 mL de
hexano. O filtrado foi recolhido e posteriormente concentrado.
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Atravs desta tcnica foi possvel obter a frao hexnica, que depois foram submetidos a
CCD e a bioautografia.

4.4- ANLISE CROMATOGRFICA


A cromatografia um mtodo moderno de anlise que permite efetuar a separao,
identificao e quantificao das espcies qumicas por si mesma ou em conjunto com outras
formas instrumentais de anlise [7].

4.4.1- Determinao do perfil da Frao Hexnica e do Extrato Etanlico Bruto por


Cromatografia em Camada Delgada
Para realizao da cromatografia foram utilizadas cromatoplacas padronizadas (Merck)
e placas manufaturadas de fase normal. O extrato etanlico bruto e a frao hexnica foram
redissolvidas com clorofrmio, e foi aplicada sobre as placas a 1cm da borda inferior e 0,5
cm da borda lateral.
As fases mveis utilizadas na cromatografia foram respectivamente hexano/acetona
(80:20), clorofrmio/metanol (90:10) e clorofrmio/metanol/gua (75:20:05), as quais foram
empregadas separadamente.
Aps o desenvolvimento dos cromatogramas, as placas foram secas e reveladas. Os
reveladores utilizados foram anisaldedo/cido sulfrico, soluo de cido sulfrico 10% em
etanol e cloreto frrico 10% em etanol.

4.4.2- Bioautografia
Para verificar a atividade antibacteriana da frao hexnica, esta foi submetida
bioautogarafia. A bioautografia consiste na asperso de uma suspenso de microorganismos,
no caso presente Staphylococcus aureus, sobre um cromatograma, no qual avalia-se a zona de
inibio, se houver, luz natural ou aps a aplicao de um corante [6]. Neste trabalho o
corante utilizado foi eosina na concentrao de 2mg/mL.
Para preparar o inculo de S. aureus, utilizou-se o seguinte procedimento: com o auxlio
da ala de platina transferiu-se algumas colnias, para um tubo contendo 3 mL de caldo
Mller-Hinton. Incubou-se por 24 horas 35 C (utilizando-se como base a escala de Mac
Farland para verificar a turvao no tubo que deveria estar entre 0,5 e 1,0 da referida escala).
Quando necessrio, fez-se diluio da suspenso com caldo Mller-Hinton, at a obteno da
turvao desejada.
A placa cromatografada foi borrifada com suspenso de cepas ativas de S. aureus,
acondicionada em placa de petri, e incubada por um perodo de 24 horas. Em seguida, a placa
foi corada com eosina (2mg/mL). A inibio do crescimento foi indicada por zona de
clareamento no cromatograma.

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4.4.3- Cromatografia em Coluna


A frao hexnica foi submetida cromatografia em coluna, utilizando-se gel de slica
como fase estacionria e clorofrmio e metanol , que foram misturados para compor 500 mL
de fase mvel, na proporo de 97:3.
A frao hexnica foi dissolvida numa quantidade mnima de clorofrmio e aplicada com
auxlio de uma pipeta Pasteur no topo da coluna de adsorvente.
As fraes, reunidas aps anlise cromatogrfica (CCD), foram submetidas anlise
biolgica (bioautografia) para a localizao de componentes ativos. Aps esta etapa, as
fraes ativas foram novamente cromatografadas em coluna, para o isolamento do
componente ativo.

4.4.4- Isolamento do componente ativo da Frao Hexnica por Cromatografia


Lquida de Baixa Presso (Lo Bar)
O isolamento foi realizado por Cromatografia Lquida de Baixa Presso, usando-se uma
coluna LoBar acoplada bomba do Sistema de Cromatografia Lquida de Alta Eficincia.

Mtodo Preparativo para Isolamento de Fraes de EEB de Ananas erecifolius.

O equipamento utilizado nas anlises foi o sistema MERCK HITACHI com Detetor de
Arranjo de Diodo (DAD). A parte fsica do equipamento composta por uma bomba dupla
modelo L-7100 dotada de quatro canais, um forno de coluna L-7300, DAD L-7455 e
interface D-7000, alm de um organizador de solventes. A retirada de ar dos solventes feita
por um degaseificador de solventes modelo L-7612, antes da mistura e da entrada deles na
coluna. A coluna usada foi uma LoBar 240-10 Lichroprep SI 60. Todo o equipamento
gerenciado pelo software HPLC SISTEM MANAGER que comanda o processo
automaticamente, analisa o resultado, que apresentado sob a forma de cromatogramas e
espectros das substncias separadas na coluna. Neste experimento utilizou-se a bomba, o
organizador de solventes e o degaseificador.
A amostra foi aplicada na concentrao 83mg do extrato hexnico por mL. Como as
substncias em questo so de polaridade muito baixa, o eluente utilizado na anlise foi
CHCl3/MeOH em gradiente de 1% a 2% de MeOH em 4 minutos e isocrtico a 2% por mais
130 minutos e aps o que a coluna foi lavada com CHCl3 /MeOH em partes iguais.

4.4.5 - Anlise da frao hexnica por CLAE


A frao no possui substncias que reajam radiao ultravioleta do detetor; passveis
de serem utilizadas como marcadores qumicos.

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5- RESULTADOS E DISCUSSO
5.1- RENDIMENTO DO EXTRATO
- 189,84 g de droga seca forneceu 4,67 g de EEB, observando-se que o rendimento foi de
2,46%.
5.2- RENDIMENTO DAS FRAES
Os rendimentos das fraes foram obtidos em relao massa de extrato etanlico bruto,
conforme mostra a tabela 1.
Tabela 1: Fraes e seus respectivos rendimentos.
FRAES
RENDIMENTO (%)

FHex
27,41

FAcOEt
4,50

FMeOH
47,32

5.3- ABORDAGEM FITOQUMICA


A prospeco fitoqumica foi realizada em triplicata de amostras na concentrao de
5mg/mL. Os testes realizados foram baseados no Manual para Anlise fitoqumica e
Cromatogrfica de Extratos vegetais (2001)[5] e avaliou a presena dos seguintes metablitos
secundrios: cidos Orgnicos, Acares Redutores, Alcalides, Antraquinonas,
Carotenides, Catequinas, Esterides e Triterpenides, Fenis e taninos, Flavonides,
Polissacardeos, Protenas e Aminocidos e Saponina Espumdica.
Tabela 2: Abordagem Fitoqumica
Classes Metablicas

EEB

FHex

Acares Redutores
Carotenides
Depsdeos e Depsidonas
Esterides e triterpenides
Fenis e Taninos

Positivo
Positivo

Positivo
Positivo
Indicativo
Positivo
-

5.4- DETERMINAO DO PERFIL CROMATOGRFICO DA FRAO


HEXNICA POR CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD).
Anlises cromatogrficas foram realizadas com os eluentes hexano/acetona (80:20),
clorofrmio/metanol (90:10), e clorofrmio/metanol/gua (75:20:05), sobre gel de slica
normal, procedendo-se em seguida a revelao dos cromatogramas com anisaldedo sulfrico.
Verificou-se que o melhor eluente para a separao das substncias foi CHCl3/MeOH
(90:10), que posteriormente foi ajustado para a realizao da bioautografia. A bioautografia
consiste na asperso de uma suspenso de microorganismos, no caso presente Staphylococcus
aureus, sobre um cromatograma, no qual avalia-se a zona de inibio, se houver, luz natural
ou aps a aplicao de um corante [6]. Neste trabalho o corante utilizado foi eosina na
concentrao de 2mg/mL.

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Bioautografia
Fase mvel: CHCl3/MeOH (97:3)
Concentrao: 40 mg/mL

Fig.3 :Bioautografia das fraes hexnica, acetato de etila,


metanol e EEB, antes e aps a aplicao do corante (eosina).

5.5- CROMATOGRAFIA EM COLUNA DA FRAO HEXNICA


Fraes reunidas de acordo com seu perfil cromatogrfico.
Cromatografia em coluna por via mida [7] de 550mg da FHex;
CCD e revelao com etanol a 10% de H2SO4 das fraes obtidas;

Tabela 3: Massa e rendimento das fraes obtidas por Cromatografia em Coluna da Fhex
Fraes

Total

158,20

6,20

13,20

102,30

77,80

9,80

7,50

24,10 98,80 26,50

524,40

28,76

1,12

2,40

18,60

14,14

1,78

1,36

4,38

95,31

Massa
(mg)
Rendimento

17,96

4,81

(%)

Bioautografia
- Hex/acetona (4:1)- A, D, E, F, G
- CHCl3/MeOH (95:5)- B, C, H, I, J
- Atividade: D, E, F, G, H
- Determinao do perfil das fraes D, E, F e FHex (Fig.4)
- Bioautografia das fraes D e E. Presena de halos inibitrios antes da borrifao da
eosina.(Fig.5)

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Fig.5: Bioautografia
das Fraes.

Fig.4: CCD das Fraes

Uso do reativo Liebermann-Bouchard [8]


- Teste das fraes D e E quanto presena de Terpenides (Fig.6).

Rf 0,43

5.6- ISOLAMENTO DO COMPONENTE ATIVO DA FRAO HEXNICA POR


CROMATOGRAFIA LQUIDA DE BAIXA PRESSO (LOBAR).
-

80mg da frao D foi dissolvida em eluente (CHCl3/MeOH), e aplicada em coluna


LoBar.

Tabela 4: Massa e rendimentos das fraes obtidas aps isolamento do componente ativo.
Fraes
1
2
3
4
5
Total

Massa (mg)
34,00
1,00
13,90
7,50
1,70
58,10

Rendimento (%)
40,62
1,19
16,60
8,96
2,03
69,04

Bioautografia das fraes 3 (D), 4 (D), E, F, G e H (Fig.7)

Fig.7:Fraes bioautografadas antes e aps a aplicao do corante.


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Tabela 5: Fraes bioautografadas e seus respectivos Rfs


Fraes
Rfs

3(D)
0,90

4(D)
0,90

E
0,89

F
0,30

H
0,42

Ajustou-se a polaridade da fase mvel, utilizando-se hexano/acetona (4:1), e procedeu-se a


CCD, revelao com iodo (Fig.9) e a bioautografia (Fig.10) com a substncia isolada e com
as demais fraes que apresentaram atividade, o que proporcionou a visualizao de um halo
de inibio com Rf 0,4.
Atualmente a substncia ativa encontra-se em fase de purificao atravs do fracionamento
por Cromatografia em Camada Delgada Preparativa.
CONCLUSO
O isolamento da substncia responsvel pela atividade antibacteriana do curau foi realizado
utilizando-se a tcnica de Cromatografia Lquida em Baixa Presso. A atividade
antimicrobiana do curau est presente nas fraes D, E, F, H da frao hexnica, e a
substncia ativa foi isolada nas fraes 3 e 4 oriundas da frao D. Anlises com a frao
hexnica demonstraram que o melhor eluente para separao dos constituintes qumicos foi
clorofrmio/ metanol (97:3). A determinao do perfil desta frao foi determinada pelas
tcnicas de bioautografia e cromatografia em coluna. Aps o isolamento a fase mvel foi
ajustada para hexano/acetona (4:1) para a realizao da bioautografia.
Quanto a composio qumica do extrato de curau, pode-se detectar a presena de
acares redutores, carotenides, esterides e triterpenides, fenis, taninos e indicou a
presena de depsdeos e depsidonas.
PALAVRAS CHAVES
Ananas erectifolius,Isolamento, Investigao Fitoqumica
AGRADECIMENTOS
instituio Universidade Federal do Par, e ao Pibic/CNPq
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
1- LEDO, I.A. de M. O cultivo do curau no lago grande de Franca. Belm: BASA, 1967.23 p. apud
LAMEIRA, O.A.; COSTA, M.R.; YOSHINO,V.C. BIOTECNOLOGIA. Cincia & Desenvolvimento.
Ano V nmero 26, maio/junho 2002, p.28.
2- FURTADO, E.C.C. Investigao fitoqumica com monitorao de extrato e fraes de Ananas
erectifolius. Belm, 1998. Trabalho de Concluso de Curso (Graduao em Farmcia)- Centro de Cincias
da Sade, Univedrsiadde Federal do Par.
3- FUJIHASHI, G.A. & DINIZ, M.C.B. Ananas erectifolius (curau): Padronizao do extrato,
fraes e do material vegetal. Belm, 2002. Trabalho de Concluso de Curso (Graduao em Farmcia)
Centro de Cincias da Sade, Universidade Federal do Par.

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4- BARROS, M.C. C & SILVA, S.M. Curau (Ananas erectifolius). Belm, 2001. Monografia
(Graduao em Farmcia)- Centro de Cincias da Sade, Universidade Federal do Par.
5- BARBOSA, W.L.R. et al. Manual para Anlise fitoqumica e Cromatografia de Extratos Vegetais.
Edio revisada, Belm, 2001.
6- COLLINS, et al. Introduo a mtodos cromatogrficos. UNICAMP, 7 ed., So Paulo, p.65,68,185,
1997.
7- MARTINI, M & ELOFF, J.N. The preliminary isolation of several antibacterial compounds from
Combretum erythrophyllum (Combretaceae). Journal of Ethnopharmacology 62 (1998), p.255 263.
8- WAGNER, H., BLADT,S. Plant Drug Analysis- A Thin Layer Cromatography Atlas- 2nd Editon
1996.

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