Amplificao,DetecoeQuantificao

PCR em Tempo Real

PCRemTempoReal

Daniela Cochicho
Lus Martins
I curso de Virologia Molecular em Oncologia

PCR Clssico
PCRClssico
The polymerase chain reaction (PCR) is one of the most powerful technologies
in molecular biology
biology
Sistema aberto

SequnciasdeDNAoude
cDNA especificasdentrode
ummodelo p
podemser
copiadas,ou"ampliadas",

26112012

ADetecoequantificaodo
produtoamplificado
,
realizasenofinaldareaco,
apsoltimociclodePCR

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Aanliserealizadapela
interpretaodotamanho
defragmentosemdegel
g
g
deagarose

PCR Clssico
PCRClssico
Teoricamente,
A reaco

de PCR amplifica
p
o DNA de forma
exponencial, duplicando o nmero de molculas
presentes em cada ciclo de amplificao.
quantidade do p
produto
O nmero de ciclos e a q
final de PCR pode ser utilizada para calcular a
quantidade inicial de material gentico
(por comparao com um padro conhecido).

mas inmeros factores complicam este clculo

Nos primeiros ciclos de amplificao, a reaco no est na sua fase exponencial.
O que origina erros associados a amplificaes inespecficas que podem interferir no resultado final

Assim, para uma anlise mais precisa, da quantidade de DNA, esta deve ser medida no mesmo tempo que
a reaco est ainda em fase exponencial de amplificao.
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PCR Tempo Real

PCRTempoReal
Para lidar com estas adversidades, foi desenvolvida a tecnologia
de PCR em tempo real.
Sistema fechado
SequnciasdeDNAoude
cDNA especificasdentro
deummodelo so
copiadas
copiadas,ou
ou "ampliadas"
ampliadas

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Autilizaode
marcadores
fluorescentes,queso
incorporadosnoproduto
dePCR

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Aquantidadedeproduto
dePCRmedidaem
cadaciclo

PCR clssico vs PCR Tempo Real

PCRclssicovsPCRTempoReal
Detecoequantificaodoprodutoformado

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PCR Tempo Real

PCRTempoReal
Deteco e quantificao de fluorescncia
Flo
ouorescnccia

Patamar

FaseExponencial

N de Ciclos
NdeCiclos
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R
t G fi PCR
RepresentaoGrficaPCR

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PCR Tempo Real

PCRTempoReal
Deteco e quantificao de fluorescncia
ComodeterminadaaQuantidadedoDNA?
C
d t
i d Q
tid d d DNA?
y Estabelecimentodeumabaseline AnlisedoBackground
y EstabelecimentodeumThreshold
Estabelecimento de um Threshold
y OcicloaoqualesteThresholdultrapassado

Log
(
(Fluoresc
ncia)

Threshold

FluorescnciaBackground

Fase
Exponencial

CycleThreshold(Ct):cicloem
queaamostracruzao
Threshold.

N de Ciclos
NdeCiclos
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PCR
T
R l
PCRemTempoReal
VriasmetodologiasPCRemTempoReal:
y Corantesfluorescences:Detecoinespecfica
SYBRGreen

y Sonda:Detecoespecfica
SondasTaqMan(Hidrlise)
S d T M (Hid li )
MolecularBeacons
SondasdeHibridizao(LightCycler)
SondasMGB
SondasLNA
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MetodologiasemPCRTempoReal
g
p

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PCR
T
R l
PCRemTempoReal
SYBRGreen:
y LigasenominorgroovedoDNA
g
g
emcadeiaduplaeafluorescncia
aumentaapsestaligao.
y Duranteaextenso,oSYBRGreen
D
t
t
SYBR G
continuaaligarseaoDNAdecadeia
p q
p

q
duplaqueseformaporacodaTaq
Polimerase.
Em cada ciclo de amplificao, o sinal de
fluorescncia aumenta proporcionalmente
ao DNA produzido

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PCR
T
R l
PCRemTempoReal
y EmPCRTempoRealpodeassociarseaCurvadeDissociao(MeltingCurve):
Aps amplificao (40 a 50 ciclos), os fragmenos de DNA so aquecidos
at temperatura de 95
95 o que promove a sua desnaturao
Ocorre diminuio de Fluorescncia (libertao SYBR Green)
Definio de Temperatura de dissociao:
atingida quando temos 50% do DNA em cadeia simples e 50% em cadeia
dupla.
Esta especifica de cada fragmento que pretendemos amplificar:
y Tamanho do fragmento
y Quantidade de GC existentes

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C
d Di
i
CurvadeDissociao
VisualizaogrficadaCurvaDissociao:
Aquecimentolentoentre60e95C
DissociaodaCadeiadupladiminuiafluorescncia

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PCR
T
R l
PCRemTempoReal
Vantagens
e desvantagens
V t
d
t

y Ligaoinespecficapodeconstituirumadesvantagem
Ligao inespecfica pode constituir uma desvantagem
y Requerbastanteumaoptimizaodascondiesdoensaio
y Podemos usar este tipo qumica quando:
No h necessidade da especificidade conferida pela Sondas
Para ensaios de screening
screening, acoplados a ensaios Taqman ou de
Sondas de Hibridao

y No usar em:
Ensaios de descriminao de alelos
Reaces Multiplex (nem sempre!)
Deteco de patogeneos com baixo n de cpias

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PCR
T
R l
PCRemTempoReal
Sondas algunsconceitos:
Fluoroforo:
Fluoroforo:molculaqueemite
molcula que emite
luzaumdadocomprimentode
ondadepoisdeabsorverluz
noutrocomprimentodeonda
Quencher:molculaqueaceita
energia de um fluoroforo na
energiadeumfluoroforona
formadeluzedissipaaenergia
sobaformadeluzoudecalor
FRET:FluorescenceResonance
EnergyTransfer

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PCR
T
R l
PCRemTempoReal
SondasdeHidrlise:TaqMan
ApsligaodosprimersedaSondacadeia
complementar,aactividadeexonucleasedaTaq
PolimerasedegradaaSondaligadaacadeiaDNA
TemosumaSondacomdoisfluorofuros:
Temos uma Sonda com dois fluorofuros:
Quencher(extremidade3)
Reporter(extremidade5)

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S d T
SondaTaqman

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PCR
T
R l
PCRemTempoReal
SondasdeHidrlise:TaqMan
y Devidoproximidadedosdoisfluoroforos,noh
emissodefluorescncia(FRET)
y AdegradaodaSondalevaalibertaodo
Fluoroforo Reporter (extremidade 5))
FluoroforoReporter(extremidade5
y UmavezlibertooReporter,nohtransferncia
deenergia(FRET)entreesteeo Quencher
O Fluoroforo Reporter, por aco de uma fonte de
y OFluoroforoReporter,poracodeumafontede
luz(Laser,LEDouLmpada),passaaemitir
fluorescncia num dado comprimento de onda
fluorescncianumdadocomprimentodeonda
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PCR
T
R l
PCRemTempoReal
Dyes
6carboxyfluorescein
2,4,1,4tetrachlorofluorescein
2,4
2
4,5
5,7
7,1,4
1 4hexachlorofluorescein
hexachlorofluorescein
2,7dimethoxy4,5dichloro6carboxyrhodamine
2chloro5fluoro7,8fusedphenyl1,4dichloro6
carboxyfluorescein
2chloro7phenyl1,4dichloro6carboxyfluorescein
6carboxytetramethylrhodamine
6carboxyN,N,N,Ntetramethylrhoramine
(4(4'dimethylaminophenylazo)benzoicacid)
succinimidylester

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Nome
Comercial

Excitao

Emisso

6FAM
TET
HEX
JOE

494nm
521nm
535 nm
535nm
520nm

518nm
536nm
556 nm
556nm
548nm

NED

576nm

VIC
TAMRA
ROX

538nm
565nm
580nm

554nm
580nm
605nm

Dabcyl

NFQ

BlackHole1
BlackHole2

NFQ
NFQ

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PCR
T
R l
PCRemTempoReal

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PCR
T
R l
PCRemTempoReal
Primers em Reaces TaqMan:
y Tm de ter Tm entre 58 60C
y Tamanho entre 15 30 bases
y Contedo
C t d de
d G+C volta
lt de
d 30 80%
y No ter quatro ou mais Gs seguidos
y No ter mais do que dois G+C na extremidade 3
y No ter nenhum G na extremidade 5 (pref. A ou
C)
y O tamanho do fragmento a amplificar deve ter
entre 50 150 bp (max 400)
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PCR em Tempo Real

PCRemTempoReal
MolecularBeacons

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SondasHibridizao

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PCR
T
R l
PCRemTempoReal
AplicaesPCRemTempoReal:
PCRQuantitativo:
QuantificaoAbsoluta:

Exemplo:CargaViral

QuantificaoRelativa:
Quantificao Relativa:
Expressognica

PCRQualitativo:
PCR Qualitativo:
DiscriminaoAlelica
Presena/AusnciadeDNA

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