UMF "GR.T.

POPA" Facultatea de Bioinginerie Medicala An IV

N.1
Regulations for the care and use of laboratory animals in various countries
Country / Institutions Legislation
AUSTRALIA

National Health and Medical Research Council

Commonwealth Scientific and Industrial
Research Organisation
Australian Agricultural Council
Australian Government Publishing Service (ed.):
Australian code of practice for the care and use of
animals for scientific purposes Canberra 1991
AUSTRIA
Tierversuchsgesetz, Januar 1990
BELGIUM
Arrts Royaux
Law of 4 May 1995
CHINA
(Peoples Republic of China):
State Science and Technology Commission, Beijing
Regulations for the Administration of Affairs Concerning
Experimental Animals, Nov. 1988
Implementing Regulations of the Administration on
Medical Experiments on Animals, June 1989
DENMARK
Lov nr. 382 om dyreforsg som aendret ved, 10. juni 1987
Lov nr. 374, 7. juni 1989
Lov nr. 405, 13. juni 1990
Lov nr. 386. 6. juni 1991
Legislation revised in 1993 in conformity with EU directives
EUROPEAN UNION
Council of Ministers Directive 86/609/EEC (1986) on
the Approximation of Laws, Regulations and Administrative
Provisions of the Member States Regarding the
Protection of Animals Used for Experimental and other
Scientific Purposes.
European Convention for the Protection of Vertebrate
Animals used for Experimental and other Scientific
Purposes. December 15, 1990.
FEDERAL REPUBLIC OF GERMANY Tierschutzgesetz vom 20. August 1986, gendert am
20. August 1990.
Richtlinie vom 24. November 1986 zur Annherung der
Rechts- und Verwaltungsvorschriften der Mitgliedstaaten
zum Schutz der fr Versuche und andere wissenschaftli-che
Zwecke verwendeten Tiere (86/609/EWG).
Gesetz zu dem Europischen bereinkommen vom
18. Mrz 1986 zum Schutz der fr Versuche und andere
wissenschaftliche Zwecke verwendeten Wirbeltiere vom
11. Dezember 1990
FINLAND
Finnish Law on Animal Welfare
Statutes Laboratory animals and their use in scientific
research, 1986
Legislation in Finland meets the EU demands
FRANCE
Loi la protection de la nature, 10 juillet 1976
Dcret aux expriences pratiques sur les animaux
19 octobre 1987
Arrts interministriels (3 arrts), 19 avril 1988
ITALY
Legislative Decree no. 116 of January 27, 1992, enforcing
European Recommendations contained in Directive
86/609/EEC
Specific Law of October 12, 1993.
JAPAN
Prime Minister authorized to set standards for minimum pain provision
Law Concerning the Protection and Control of Animals,
October 1973
NORWAY
Ministry of Agriculture Animal Protection Law, 1974
REPUBLIC OF CZECHIA
Czech National Assembly
Law for the Protection of Animals no 246 Sb, 15. April
1992 inclusive the amendments no. 162 Sb, 19. May 1993
1

UMF "GR.T.POPA" Facultatea de Bioinginerie Medicala An IV

SOUTH KOREA

1) Ministry of Agriculture, Fishery and Forestry

2) Ministry of Health and Welfare
1) Animal Protection Act, May 1991
2) Pharmaceutical Affairs Law
Korean Good Laboratory Practice
Guidelines for Breeding and Caretaking of Test Animals
SWEDEN
The Swedish National Board for Laboratory Animals (CFN)
Ministry of Agriculture, Stockholm
National Board for Laboratory Animals Ordinance
Amending the Boards Ordinance (LSFS 1988:45)
Containing Regulations and General Recommendations
Concerning Ethical Examinations of the Use of
Laboratory Animals for Scientific Purposes, etc.,
December 29, 1989
SWITZERLAND
Tierschutzgesetz, 9. Mrz 1978
Tierschutzverordnung, 27. Mai 1981
TAIWAN
Council of Agriculture,
In future: Provincial/Municipal Governments
No legislation, regulations or policies in place; animal protection law drafted
UNITED KINGDOM
Protection of Animals Act, 1991
Animals (Scientific Procedures) Act, 1986
U.S.A.
U.S Department of Health and Human Services
United States Department of Agriculture (USDA)
Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, NIH
Publication No. 86-23, revised 1985, Animal Welfare Act, 1992
MOST COUNTRIES Local ethical commisions at universities and other institutions of biomedical research.

1.
Tehnici de recoltare a singelui la animale de laborator
1.1
Introducere
La animalele de laborator, singele este colectat in scopuri stiintifice diverse, de exemplu, pentru a studia efectele unui drog
asupra unor costituienti variati cum ar fi hormoni, substrate sau celule sanguine. In domeniul farmacocineticii si metabolismului
drogurilor, esantioanele de singe sunt necesare pentru determinari analitice ale medicamentului si metabolitilor. Singele este de
asemenea necesar pentru unele studii in vitro utilizind celule sanguine sau fractii proteice plasmatice definite. Tehnicile pentru
recoltarea singelui depind de factori specifici care difera de la un experiment la altul. Este o diferenta intre tehnicile de recoltare
terminal si non-terminala. Conditiile colectarii singelui la sfirsitul unui experiment care include decesul animalelor (experiment
terminal), sunt total diferite (anestezia, volumul de singe) de colectarea unica sau repetata a singelui de la animalul constient.
Colectarea "terminala" a singelui sub anestezie permite utilizarea tehnicilor ce nu sunt acceptabile pentru colectarile sanguine
non-terminale.

1.2
Aspecte ale proteciei animalului
Minimizarea oricrei dureri sau disconfort la animalele de laborator pe durata procedurilor experimentale trebuie s fie la fel de
important ca obinerea rezultatelor dorite. Acest aspect este important nu numai din raiuni umanitare ci i ca parte a unei bune
practici tiinifice. Colectarea sngelui poate fi stresant pentru animal datorit manipulrilor i disconfortului asociat unei tehnici
anume. Multe modificri biochimice i fiziologice sunt asociate cu stress-ul ceea ce afecteaz rezultatele, de exemplu, creterea
nivelului catecolaminelor din snge, prolactinei i glucocorticoizilor ce pot influena anumii parametri metabolici cum ar fi glucoza
ca i numrtoarea eritrocitelor, celulelor albe i volumul celular total. De aceea stress-ul trebuie redus la un minimum posibil
dac nu se poate evita cu desvrire; aceasta este nu numai n interesul binelui animalului ci i n interesul binelui tiinific
(acela de a obine date reprezentative). Pentru a minimiza stress-ul pe durata colectrii sngelui (de ex. de la cini sau pisici),
poate fi util pentru animal, ca i pentru operator, efectuarea unor "giumbulucuri" i atribuirea unor "recompense" animalului.
Pe durata colectrilor non-terminale este important de a nu recolta o cantitate prea mare ce ar putea duce la reducerea
volumului total de snge i n final la rezultate false. Un volum total de snge redus se acompaniaz de un coninut n
hemoglobin i o capacitatea de transport a oxigenului reduse (Gainer i col. 1955) ca i de o cdere a presiunii sanguine i o
cretere a concentraiei "hormonilor de stress". Mai mult acestea se pot acompania n continuare de alte probleme cum ar fi
necroza mucoasei gastrice. Binele animalului nu trebuie primejduit prin recoltarea unui volum prea mare de snge sau recoltri
prea frecvente. Cel mai adesea aceasta se ntmpl cnd sunt folosite ca animale de experien animale mici (oarece, obolan,
hamster). n aceste cazuri, protocoalele de studiu vor fi adaptate s utilizeze mai multe animale pentru a minimiza disconfortul
pentru animalul individual.
2

UMF "GR.T.POPA" Facultatea de Bioinginerie Medicala An IV

1.3
Volumul total de snge
Acesta este foarte dificil de determinat (McGuill et al 1989) i depinde de specie, sex, vrst i sntate ca i de starea de
nutriie.Volumul total de snge este mai mic la animalele mai mari dect la animalele mici din aceeai specie, n relaie cu
greutatea corporal. Este de asemenea mai la animalele n vrst i obeze comparativ cu animalele tinere i cu greutate
normal. Volumul total de snge circulant este n limitele de 55-70 ml/kg greutate corporal.

1.4
Colectarea terminal a sngelui
Colectarea terminal a sngelui poate fi: (i) exsanguinarea, ca singur proces de ndeprtare a sngelui prin care se colecteaz ct
mai mult snge posibil i (ii) eantioane de snge, multiple, recoltate pe durata unui experiment terminal, sub anestezie general.
Exsanguinarea va fi efectuat numai dup ce, printr-o alt metod, animalul a devenit incontient, de exemplu oc fizic sau
anestezie general. Trebuiete ndeplinit aceast condiie deoarece stress-ul apare odat cu hipovolemia sever iar accesarea
vaselor profunde provoac durere. Datorit condiiilor particulare la animalul anesteziat i naturii "terminale" a experimentului,
metodele ce pot fi utilizate pentru exsanguinare nu vor fi nicodat recomandate pentru colectarea sngelui non-terminal (condiii
n care se urmrete i recuperarea animalului).
Aceste metode includ:
recoltarea sngelui din vena cav caudal sau aort dup laparotomie cnd se colecteaz ct mai mult snge posibil n condiii
sterile;
- exsanguinarea dup decapitare, incizia venei jugulare sau arterei carotide, condiii n care se colecteaz sngele non-steril;
sngerarea retro-orbital a animalelor mici de laborator (oareci, hamsteri i obolani), poate fi de asemenea o metod de
exsanguinare.

1.5
Colectarea sngelui non-terminal
Colectrile de snge non-terminale pot fi difereniate recoltare unic sau multipl. Venele periferice utile pentru recoltarea
sngelui sunt trecute n tabel.
Specia

Vena
Vena
coccigian
auricular
+ tt
{oarece
cc + cc

Hamster

{obolan
ccc + cc
Cobai

c
Iepure

ccc
Pisic

Cine

Maimu

Porc

iii
Oaie

Capr

Vite
cc
c
Cal

c/cc/ccc
=
animal contient
i/ii/iii
=
animal imobilizat
a/aa/aaa =
animal anesteziat
ccc/iii/aaa = cale recomandat
cc/ii/aa
=
cale acceptabil
c/i/a
=
alternativ posibil

=
nerecomandat sau imposibil
Repetiia literelor indic condiia experimental preferat.

Plex
orbital

Vena
jugular

a
aa
a
cvc
tt

=
=

Vena
Vena
Vena
cefalic,
femural
mamar
safena
a
aa
a
c
cc
ccc
a
ccc
ccc
a
aa/c
ccc
cc
iii/cc(cvc)
ccc
c
c
ccc
c
c
ccc
c
cc
ccc
vena cav cranial
coad amputat ("Amputation tail tipe")

1.5.1
Recoltare sanguin unic
O singur recoltare de pn la 15% din volumul sanguin total nu influeneaz binele animalului. Oricum, recoltarea de 15-20% se
poate acompania de efecte secundare cum ar fi o scdere a debitului cardiac sau presiunii sanguine. {ocul hemoragic poate fi
indus de recoltarea a 30-40% din volumul sanguin total iar pierderea a 40% cauzeaz mortalitate la mai mult de 50% dintre
animalele unor specii (obolan, porc) (McGuill et al 1989).
Cte o singur recoltare de snge sub 15% din volumul total de snge poate fi repetat dup 3-4 sptmni (de la un animal
normal i sntos), fr efecte adverse detectabile.
Aceasta nu nseamn c animalul nu are experiena unor efecte adverse ci numai c nu le manifest n mod evident.
Simptomele ocului hipovolemic sunt: puls accelerat, membrane mucoase palide, hiperventilaie, temperatura corporal
subnormal inclusiv piele i extremiti reci. La aceste animale, intervenia terapeutic const n substituirea volumului sanguin
cu perfuzie intravenoas izoton i cald.
3

UMF "GR.T.POPA" Facultatea de Bioinginerie Medicala An IV

1.5.2
Recoltri de snge multiple
Recoltrile de snge multiple nu vor depi 1% din volumul sanguin total n 24 ore (0.6 ml/kg corp/zi). Recoltri mai frecvente
i/sau a unor cantiti mai mari de snge pot cauza anemie.
Simptomele anemiei sunt: mucoasa conjunctival i bucal palid, intoleran la exerciii fizice i o cretere a frecvenei
respiratorii n anemiile severe. Anemia poate fi uor detectat prin determinarea numrului de eritrocite, a hematocritului, a
nivelelor hemoglobinei precum i prin numrtoarea reticulocitelor n eantioanele de snge. n caz de anemie animalul va trebui
s fie tratat cu fier i vitamina B12 i va fi monitorizat n legtur cu parametrii sanguini menionai mai sus, pe durata terapiei,
pn cnd valorile revin la normal.

1.6
Aspecte tehnice ale recoltrii sngelui
O metod comun de colectare a sngelui capilar n volum de 0.1 ml (la oarece i obolan), este de a ndeprta vrful cozii
animalului. Pentru eantioane de snge (repetate), chiagul de snge de pe coad trebuie ndeprtat, pentru a obine snge capilar
proaspt.
Aceast metod este bun i suficient pentru determinarea glucozei sanguine, sau radioactivitii totale (dup administrarea
medicamentelor radiomarcate).
La animalele fr coad (cobai sau hamster), este preferat puncia cardiac, sub anestezie general.
Pentru colectarea sngelui de la animalele mari se prefer abordarea unei vene superficiale. Persoana care ine animalul i
evideniaz vena, are un rol cheie n colectarea smgelui (nu trebuie s induc stress animalului ci trebuie s-i vorbeasc i s
maseze animalul). Unele animale (cini i unele primate), pot fi antrenate s prezinte un picior pentru recoltarea de snge fr a
utiliza vreo constrngere fizic. Este important de a localiza cu acuratee vasul nainte de inseria acului sau cateterului. n cele
mai multe cazuri, este necesar obstrucia returului venos pentru distensia vasului i inseria cu succes a acului. Lumenul acului
trebuie s fie ct mai larg posibil pentru a asigura o recoltare a sngelui rapid cu risc minim de obstrucie a acului. Cnd sngele
este aspirat prea rapid cu o sering, vena se colabeaz. Dup ce acul a fost retras, se va aplica imediat o presiune continu, de
cel puin 30 secunde durat, la locul de puncie. Animalul va fi monitorizat apoi timp de 15 minute n ceea ce privete sngerarea.

1.6.1
Canularea venoas permanent
Pentru recoltri de snge multiple se recomand adesea accesul venos prin canulare cronic. n cele mai multe cazuri (i n
particular la obolani), este necesar de a restrnge activitatea animalului (cu o "jachet"), pentru a preveni deteriorarea sau
smulgerea canulei. n aceste cazuri semnele de stress sunt evideniate frecvent de o cretere a niveleleor serice ale hormonilor
de stress. Oricum, dup cteva zile dup implantarea cateterelor, nivelele acestor hormoni devin normale la obolanii
contenionai (Tsukamoto et al 1984, Wiersma & Kastelijn 1985). Astfel de animale sunt, n mod obinuit, cazate singure iar
"ncperea" restrnge unele micri normale cum ar fi culcatul pe spate sau rostogolirea. Astfel de restricii pot fi considerate
totui ca surse poteniale de stress. Acest lucru poate fi prevenit prin poziionarea ieirii cateterului pe spatele animalului;
cateterul trebuie s aib o lungimea exterioar de cel mult 2 cm i captul reprezentat de un ac de sering (metalic). n timpul
experimentului, pentru recoltarea sngelui se ataeaz un cateter mai lung. Trebuie echilibrat foarte atent stress-ul i disconfortul
animalului cu canulare permanent (n condiii de "restricie") ntr-o perioad mai lung cu recoltrile de snge multiple fr
canulare permanent. n primul caz, pot fi obinute valori multiple de la acelai animal evideniind, poate, diferene individuale
ntr-un grup de animale. n ultimul caz poate fi necesar utilizarea unui numr mai mare de animale (iar disconfortul animalului
luat individual este mai redus).
Canularea pe termen scurt (mai puin de o zi), a unui vas sanguin periferic la animalele mari este uor de realizat. Un ac
"flutura" poate fi plasat n condiii aseptice iar probele de snge multiple pot fi recoltate rapid. Canularea pe termen lung (mai
mult de dou zile) la animalele mici sau mari prezint adesea complicaii, n special blocarea canulei cu trombi. Infuzarea i
administrarea substanelor via canul permanent este mult mai facil dect recoltarea sngelui (trombii ataai la captul canulei
funcioneaz ca u valv cu un singur sens). Coagularea poate fi prevenit prin umplerea cateterului cu soluie salin coninnd
heparin.

1.6.2
Sngerarea retro-orbital
Recoltarea sngelui prin puncie orbital este o tehnic destul de controversat. Aceast tehnic este adesea aplicat la animalele
fr coad (de ex. hamster). Aceast tehnic este de asemenea utilizat, la obolani i oareci, cnd sunt necesare volume mari
ce nu pot fi obinute din vena cozii. Sngerarea retro-orbital se efectueaz totdeauna sub anestezie general. Sunt utilizate
pipete Pasteur, micropipete sau tuburi microcapilar ce sunt mpinse prin micri de rotaie prin conjunctiva lateral, dorsal sau
medial a ochiului spre peretele posterior al orbitei. n general, reaciile inflamatorii histologice pot fi vzute pe traiectul de
puncie patru zile dup puncie. Dup patru sptmni, leziunile sunt vindecate fr cicatrici detectabile (van Herck et al 1992).
Oricum, nu pot fi excluse complet efecte secundare severe cum ar fi hematomul retro-orbital cu presarea consecutiv a ochiului.
Aceast presiune poate leza nervul optic. Animalul poate fi incapabil de a nchide ochiul. Sngerarea din plexul venos orbital cu
recuperarea animalului se va efectua numai n condiii excepionale, cnd alte metode nu sunt posibile. Tehnica va fi aplicat
doar de ctre personalul foarte bine antrenat n astfel de manevre (tehnici); se va utiliza numai un singur ochi.
4

UMF "GR.T.POPA" Facultatea de Bioinginerie Medicala An IV

1.6.3
Puncia cardiac
Colectarea sngelui prin puncie cardiac a fost efectuat la cobai i hamsteri. La aceste specii este dificil colectarea sngelui
prin metode alternative (cu excepia sngerrii retro-orbitale). n general, puncia cardiac se va efectua sub anestezie general,
cu premedicaie cu atropin (pentru prevenirea aritmiei cardiace). Dac puncia cardiac este utilizat pentru recoltarea sngelui
non-terminal (cu recuperarea animalului). animalultrebuie separat de celelalte pn cnd acesta este contient deplin. Va fi atent
supravegheat n ceea ce privete efectele adverse i sacrificat dac se remarc tulburri datorate complicaiilor (cum ar fi
sngerarea intrapericardic sau intra-toracic).