UBIQUITINAO

A ubiquitina uma protena com

funes fundamentais para a
regulao de processos biolgicos.
Ela funciona como uma espcie de
bandeira, indicando que algo deve
acontecer ao substrato ao qual
est ligada. Pode sinalizar, por
exemplo, que as protenas-alvo
devem ser degradadas pelo
proteassomo, uma espcie de
"triturador" da clula.

Depois de mapear e estudar a

funo de genes que codificam as ubiquitina-ligases, componentes do sistema
ubiquitina-proteassomo, uma equipe internacional coordenada por um cientista
brasileiro mostrou que essas protenas tm um papel ainda mais importante e
diversificado do que se imaginava.
Alm de descobrir que mais de 600 genes codificam ubiquitina-ligases no
genoma humano, os pesquisadores utilizaram as informaes do mapeamento
para gerar novas ferramentas de genmica funcional.
Ao tentar demonstrar o potencial dessas ferramentas, fizeram ainda uma
descoberta inesperada: uma nova ubiquitina-ligase que controla a dinmica das
mitocndrias. O estudo foi publicado na semana passada na revista PLoS One.
A parceria envolveu cientistas do Brasil, Estados Unidos, ndia, Rssia e China.
O autor principal do estudo Cludio Juazeiro, professor de biologia celular do
Instituto de Pesquisa Scripps, na Califrnia, Estados Unidos, cujo laboratrio
trabalha com ubiquitina-ligases h quase dez anos.
"Elas nos interessam porque, alm de conferir especificidade ao sistema,
determinando quais protenas sero marcadas ou no com ubiquitina, esto
implicadas em diversas doenas", disse Joazeiro Agncia FAPESP.
Entre as doenas relacionadas est a de Parkinson: dos poucos genes
conhecidos cuja mutao est relacionada ao mal, um deles codificador da
ubiquitina-ligase. Em oncologia, algumas mutaes eliminam a funo de

ubiquitina-ligases como ocorre com o gene BRCA1, que acarreta o cncer de

mama.
A descoberta da degradao regulada de protenas pelo sistema ubiquitinaproteassomo foi feita no incio da dcada de 1980 pelos israelenses Aaron
Ciechanover e Avram Hershko Technion e pelo norte-americano Irwin Rose. A
importncia do processo para a regulao de processos biolgicos e a sua
relevncia para a compreenso de vrias patologias garantiu aos trs o
Prmio Nobel de Qumica de 2004.

Mais surpresas vista

No estudo, os autores combinaram informaes de cinco bancos de dados
pblicos do genoma humano, eliminaram as repeties, gerando um
superconjunto de protenas entre as quais buscaram aquelas que exibiam
caractersticas de ubiquitina-ligase.
"Essa notao genmica j nos trouxe vrias informaes importantes. Uma
delas que existem mais de 600 genes codificando ubiquitina-ligases. Isso
indica que elas devem ser to importantes quanto as protenas quinases, mas
estimamos que pouco mais de cem delas tenham sido estudadas", disse
Joazeiro.
Os pesquisadores fizeram, ento, diversas anlises de bioinformtica com a
finalidade de transformar os resultados em ferramentas para investigao das
funes das ubiquitina-ligases, procurando determinar funes ainda no
caracterizadas.
"Essas ferramentas de genmica funcional incluarm a gerao de colees de
cDNA e RNAi destinadas a interrogar a funo de cada gene da famlia
individualmente", disse o pesquisador. O cDNA, ou DNA complementar, o
DNA sintetizado por uma molcula de RNA mensageiro em uma reao
catalisada pela enzima transcriptase reversa. Quando inseridos em clulas,
cDNAs podem levar ao aumento dos nveis da protena codificada.
O RNAi, ou RNA de interferncia, uma nova tcnica que permite inibir a ao
de um gene escolhido. Por exemplo, o RNAi pode suprimir genes que causam
tumores diminuindo o desenvolvimento de cncer.

De acordo com outro autor brasileiro do estudo, Mario Bengtson, psdoutorando de Joazeiro no Instituto Scripps, "o uso sistemtico dessas
tecnologias ir inevitavelmente acelerar a compreenso das funes dessa
importante classe de protenas na regulao celular".
"O estudo abre portas para muitas oportunidades de descobertas
interessantes. O mais impressionante que, embora conheamos apenas uma
frao desses 600 genes, sabemos que muitos esto envolvidos em doenas.
Ou seja, provavelmente outras surpresas surgiro", comentou Joazeiro.
Segundo o cientista, a via de ubiquitinao, que determina as protenas a
serem "marcadas", composta de trs etapas, cada uma envolvendo uma
enzima: E1 (enzima ativadora da ubiquitina), E2 (enzima conjugadora) e E3
(ubiquitina-ligase).
"No genoma humano existem apenas dois genes codificando a E1 e menos de
40 genes codificando a E2. H alguns anos sabamos que havia centenas
deles codificando as E3. Avaliamos que entre 1% e 2% de todos os genes
humanos so destinados codificao de ubiquitina-ligases", afirmou.

Mulan e a mitocndria
Para demonstrar o potencial das ferramentas desenvolvidas, os autores do
estudo incluram um experimento cujo objetivo foi apontar quais ubiquitinaligases controlam a morfologia e a funo das mitocndrias nas clulas.
"Esses processos de interao entre as ubiquitina-ligases e as mitocndrias
foram pouco estudados at agora, mas so importantes para doenas como a
neurodegenerao", explicou Joazeiro.
Durante o experimento, os cientistas descobriram uma nova ubiquitina-ligase,
localizada nas prprias mitocndrias, sugerindo que seu efeito na morfologia
das organelas era direto. A protena foi batizada como Mulan, a partir das
iniciais de Mitochondrial Ubiquitin Ligase Activator of NF-kappaB.
"Em 30 anos de estudo do sistema ubiquitina-proteassomo, essa apenas a
segunda ubiquitina-ligase a ser descoberta associada organela. Ns
demonstramos que a Mulan controla a distribuio e a dinmica das

mitocndrias, alm de seu papel j reportado de ativadora da expresso

gnica nuclear", disse Joazeiro.
A descoberta, segundo o cientista, abre portas para que a cincia compreenda
como essas organelas "conversam" com o ncleo celular e coordenam suas
funes.
O artigo Genome-Wide and Functional Annotation of Human E3 Ubiquitin
Ligases Identifies Mulan, a Mitochondrial E3 that Regulates the Organelle's
Dynamics and Signaling, de Claudio Joazeiro e outros, pode ser lido
em www.plosone.org.

O sistema proteoltico dependente de ATP e ubiquitina estimulado em

diversas situaes como o jejum, o diabetes e a desnervao muscular. Alm
do efeito inibitrio de insulina e dos IGFs h que se considerar que
glicocorticoides e hormnios tireoideanos estimulam a protelise dependente
de ATP e ubiquitina. Algum fator hipofisrio tambm estimula a protelise (o
hormnio do crescimento no o faz).
Em resumo, as clulas possuem diversas vias proteolticas que podem ser
ativadas ou inibidas de acordo com as suas necessidades em diferentes estados
nutricionais e patolgicos. A existncia de diversas fases temporais desde o
estabelecimento de determinada condio um indicativo de que as diferentas
vias proteolticas podem atuar em mecanismos adaptativos mediados por ao
hormonal. Ainda pouco se sabe sobre os mecanismos bioqumicos envolvidos
nessas situaes, mas a prpria existncia de diferentes vias, algumas delas
exibindo um elevado grau de complexidade nos permite dizer que a
degradao proteica intracelular um processo vital extremamamente bem
regulado por diversos fatores internos e externos s clulas.
O proteassoma, complexo que faz parte da principal via responsvel pela protelise de
protenas desenoveladas na sntese proteica, uma protease multicataltica composta de
protenas catalticas e protenas regulatrias e contm de trs a quatro atividades de
peptidases diferentes - atividades hidrolticas tipo tripsina, tipo quimotripsina e tipo peptidilglutamil hidrolase. Est presente em todas as clulas eucariticas, em archea e algumas
bactrias. Existem dois tipos de proteassomas distinguveis pelo seu coeficiente de
sedimentao: o proteassoma 26S dependente de ATP e tem massa molecular em torno
de 2000 kDa; o proteassoma 20S independente de ATP e tem massa molecular em torno
de 750 kDa. Antes da degradao pelo proteassoma, a maioria das protenas so
ubiquitinadas.

Figure 1. Representao esquemtica do sistema proteasoma-ubiquitina. Figura adaptada de NIAAA,

NIH.

Os inibidores de proteassoma podem atuar em doenas como cncer e vrias aplicaes

em outras pesquisas. Bortezomib, tambm conhecido pelo nome comercial Velcade, um
medicamento aprovado pela FDA e pela ANVISA e utilizado contra mieloma mltiplo e
linfomas de clulas do manto. Tambm utilizado em pesquisas como inibidor
proteassmico [1]. Existem outros inibidores de proteassomas com potencial teraputico e
que esto em fase de estudos clnicos, como Disulfiram, Epigalocatequina-3-galato,
Salinosporamida A, Carfilzomib, ONX0912 (Oprozomib), CEP-18770 (Delanzomib) e
MLN9708 (Ixazomib).

Inibidor

nu
m

MG132

22

Lactacistina

Inibidor
proteassoma I

de

Tabela 1. Inibidores de proteossoma e o nmero de publicaes referentes a cada um.

Desde 16 de Outubro de 2012, a Labome j revisou 10096 artigos que utilizaram

anticorpos. E em 2117 artigos dos 10096, o uso e aplicao dos reagentes foi analisada,
sendo que 29 artigos conteram referncias explcitas sobre inibidores de proteassoma. A
tabela 1 lista o nmero de publicaes dos principais inibidores, sendo o MG132 a escolha
predominante dos laboratrios. As principais caractersticas dos trs inibidores esto
listadas na tabela 2.

Inibidor

Mecanis

Aplica

Armazename

Observao

mo

MG132

Lactacistina

nto

-20oC

Mais barato <150

USD/5
mg,
tambm inibe a
ativao de NF-KB
(IC50 = 3 uM) e
calpana

Irreversve ~10 uM,

-20oC
l
2- hrs

Mais
caro,
tambm inibe a
NF-KB,
com
atividade
mais
especfica
que
MG132

Reversvel

~10uM,
1- hrs

Inibidor de
proteassom
aI
Tabela 2. Principais caractersticas dos inibidores proteassmicos

MG132
MG132, tambm chamado de carbobenzoxi-L-leucil-L-leucil-L-leucinal, Z-LLL-CHO, um
peptdeo aldedico capaz de inibir diferentes tipos de proteases incluindo serina-proteases,
calpana, etc. Outros peptdeos aldedicos tambm mostraram forte poder de inibio na
atividade de peptidases mltiplas de proteassomas e de calpana [2].
Algumas das aplicaes de MG132 foram postadas na tabela 3, junto de sua referncia
respectiva. As publicaes citadas fizeram o tratamento usando concentraes de 1, 10,
25 e 50 uM, incubando de um a vrios dias.

Tipo celular

293T, EFM 192A

Tratamento

10 uM, 1 h

Refernc
ia

[3]

A.
polyphaga, 0,1 uM, 1h antes da infeco e mantida
[1]
HEK293
ao longo
A431

10 uM

[4]

COS-7, HeLa

20 uM, 24 h

[5]

COS-7

25 uM, 5 h

[6]

H1299, U2OS, HeLa 10 uM, 12 h

[7]

HeLa

20 mM(?), 24 hrs

[8]

HEK293

25 uM, 4 h

[9]

HEK293

1 uM, 16 hrs

[10]

HEK-293T

50 uM, de 4 a 7 h

[11]

Tabela 3. Aplicaes de MG132 (tempo de tratamento e concentrao) na literatura

O proteassoma faz parte da funcionalidade celular, ento inibidores protessmicos como o

MG132 so txicos para clulas e tecidos e podem causar morte celular em altas
concentraes ou aps um tratamento prolongado. aconselhvel titular a concentrao
tima com uma faixa significante. Esta concentrao tima no depende apenas do tipo
celular, mas tambm dos parmetros de cultura como a confluncia celular, concentrao
srica e composio do meio.
O MG132 deve ser armazenado a -20 oC, pode ser dissolvido em DMSO (10 mg/ml) ou
metanol (1 mg/ml), aliquotado e armazenado a -20 oC ou -80oC. Se o MG132 dissolvido em
DMSO precipitar ao ser adicionado ao meio de cultura, a soluo estoque pode ser
aquecida a 40oC. Dentre os vrios fornecedores de MG132 citados nas publicaes
revisadas, a EMD Millipore (nmero de catlogo 474790) da marca Calbiochem e EMD
Biosciences, e a Merck foram os principais.
O MG132 da EMD Millipore/Merck/Calbiochem foi utilizado no estudo do papel das
protenas quinases ativadoras de mitognio (MAPK) e de NF-B em clulas monocticas
humana [12], na interao entre as junes aderentes e a via de sinalizao WNT [4], no
mecanismo de ao de A20 na inibio da sinalizao de NF-B [13], na associao da
aquaporina AQP1 com a deposio das placas beta-amilides no Alzheimer [14], na
sinalizao via BMP no cncer de colo [15], na via de degradao de IkappaBalpha [16],
na regulao da estabilidade de DNMT1 em clulas mamferas [5], no papel de RanBP2 e
SENP3 na regulao da SUMOilao da Borealina [17], e na autoubiquitinao de clAP1
induzida por antagonistas [3].
O MG132 produzido pela Boston Biochem (atual R & D System) foi utilizado como inibidor
proteassmico em clulas cultivadas para estudar a regulao da expresso de COMMD1
[18].
O da BIOMOL (agora Enzo Life Sciences, nmero de ctalogo BML-PI102-0005) foi
utilizado para estudar o papel da ubiquitina-ligase na homeostase do ferro [9].
O MG132 da Sigma foi utilizado em vrios estudos [7, 8, 10, 19-23]. O da Biovision [1],
Peptide Institute [6], e VWR International [11] tambm foram citados.

Figure 2. Estrutura qumica de MG132

Lactacistina
A lactacistina um antibitico isolado de Streptomyces e pode ser sintetizado
quimicamente. Ela se hidrolisa em clasto-lactacistina-beta-lactona, o inibidor ativo, e vai
modificar covalentemente a treonina do N-terminal da subunidade X do proteassoma 20S

de mamferos. A ligao covalente altamente especfica e no afeta a cistena ou a

serina protease, agindo de forma mais especfica que os peptdeos aldedicos.

Figure 3. Estrutura qumica da lactocistina

A lactacistina foi utilizada em concentraes de 10 uM e 25 uM por 4 horas em culturas

celulares.

Tipo
celular

Tratamento

Refernc
ia

BxPC-3

10 uM, 12, 24 e 48
[24]
hrs

HEK-293T

25 uM 4 a 7 hours

[11]

RAW 264.7

10 uM, 2 h

[25]

Tabela 4. Aplicaes da lactacistina (tempo de tratamento e concentrao) na literatura

A lactacistina da EMD Millipore/Merck/Calbiochem foi utilizada para estudar o efeito da

toxina de edema de Bacillus anthracis na glicognio-sintase-quinase 3beta (GSK- 3beta)
nuclear [25] e para investigar a regulao da ubiquitinao e degradao de LRRK2 [26].
A clasto-cistina--lactona da BIOMOL (Enzo Life Sciences) foi utilizada para estudar o
papel da funo de ativao 1 (AF-1) na regulao da mobilidade nuclear dependente de
proteassoma e no recrutamento da protena E6 associada ubiquitina-ligase para o
receptor de estrognio beta [10].
A lactacistina da Bio-Connect [11] e Sigma [19, 24] tambm foram citadas.
Outros inibidores proteassmicos
Inibidor proteassmico I

O inibidor proteassmico I da Calbiochem (PSI) foi utilizado para incubar clulas

transfectadas [27], O PSI da Peptide Institute (N-carbobenzoxi-L-isoleucil-L--t-butil-Lglutamil-L-alanil-L-leucinal) foi utilizado para tratamento celular [28].
PS-341, MG-341, Velcade

O Velcade (sinnimo: PS-341 ou MG-341) foi utilizado para inibir atividade proteassmica
[1]. A toxicidade celular de Velcade tambm foi verificada. As clulas HEK-293 tratadas
com 50 umol/L de Velcade por 8 horas no tiveram perda celular significativa. Uma
incubao prolongada (24 horas) com 0,5 a 50 umol/L causou cerca de 40% de morte
celular [19].
XAV 939

A ADP-ribosilao de PI131 pela tanquirase (TNKS) inibiu a represso da 20S e promoveu

a atividade proteassmica da 26S. XAV939, uma pequena molcula, inibe a TNKS
bloqueando a ADP-ribosilao de PI131.
Verificao da inibio proteassmica.

Ao utilizar um inibidor de proteossoma, necessrio garantir que a atividade

proteassmica seja realmente atenuada, e algumas abordagens podem ser realizadas.
Uma delas a utilizao do Suc-LLVY-AMC (N-succinil-L-leucil-L-leucil-L-leucil-7-amido-4metilcumarina), um indicador de atividade proteassmica fluorescente [29]. Outra forma
analisar por western blot os nveis de mono e poli ubiquitina quando h inibio da
atividade do proteassoma, h um menor nvel de mono ubiquitina.