Documenti di Didattica
Documenti di Professioni
Documenti di Cultura
Nucleasas
Enzimas que degradan el cido nucleico hidrolizando el
enlace fosfodiester que une un nucletido al siguiente
siguiente.
Pueden actuar en hebra doble hebra sencilla.
Exonucleasas: actan sobre los extremos del DNA,
habitualmente de forma no especfica de secuencia.
Endonucleasas: actan sobre enlaces internos de la
molcula de DNA. Tambin pueden ser especficas de una
secuencia concreta. En este caso, se denominan
endonucleasas de restriccin.
Nucleasas
DNAsa I Endonucleasa que hidroliza DNA de hebra doble
hebra sencilla mediante corte en p
pirimidinas ((C T).
)
Utilizada para experimentos en donde slo debe haber RNA
p.ej.: retrotranscripcin, ensayos de interaccin DNAsProtena (footprinting).
Nucleasa S1 de Aspergillus oryzae degrada DNA de forma
exonucleoltica, procesiva y no especfica de secuencia.
Ribonucleasa A: Endoribonucleasa que acta sobre el RNA
de cadena sencilla degradndolo mediante corte en
pirimidinas (C T). Usada para eliminar RNAs de minipreps.
Exonuclease III
(E. coli)
Nuclease BAL 31
(Alteromonas)
Functions as an exonuclease to digest both 5' and 3' ends of double-stranded DNA. It also acts as a singlestranded endonuclease that cleaves DNA at nicks, gaps and single stranded regions. Does not cleave internally
in duplex DNA.
Used for shortening fragments of DNA at both ends.
Nuclease S1
(Aspergillus)
The substrate depends on the amount of enzyme used. Low concentrations of S1 nuclease digests singlestranded DNAs or RNAs, while double
double-stranded
stranded nucleic acids (DNA:DNA, DNA:RNA and RNA:RNA) are
degraded by large concentrations of enzyme. Moderate concentrations can be used to digest double-stranded
DNA at nicks or small gaps.
Used commonly to analyze the structure of DNA:RNA hybrids (S1 nuclease mapping), and to remove singlestranded extensions from DNA to produce blunt ends.
Ribonuclease T1
(Aspergillus)
An endonuclease that cleaves RNA at 3' phosphates of guanine residues, producing oligonucleotides terminal
guanosine 3' phosphates.
Used to remove unannealed regions of RNA from DNA:RNA hybrids.
Enzimas de
Restriccin
Corte cohesivo
Corte romo
Eco RI
HaeIII
Enzimas de Restriccin
Vista lateral
Vista Superior
Enzimas de Restriccin
Extremo 5 protuberante
Extremo 3 protuberante
Extremo romo
Enzimas de Restriccin:
Nomenclatura
Gnero
Especie
Cepa
Orden
E RI
EcoRI
Secuencias de reconocimiento palindrmicas
d
de
nucletidos en la secuencia reconocida). Esto sera 1/256,
1/1024 y 1/4096 para n= 4, 5 y 6.
Se observa que el nmero de sitios de corte es menor: fago
(49Kb) tiene 6 sitios BgII, 5 sitios BamH1 y solo 2 sitios SalI.
Se demuestra que los nucletidos no se distribuyen al azar.
Mapas de Restriccin: mediante digestin con varias
endonucleasas de restriccin se puede caracterizar un ADN.
2 fragmentos (1 corte)
2 fragmentos (1 corte)
3 fragmentos (2 cortes)
3 fragmentos (2 cortes)
4 fragmentos (3 cortes)
Xba1
Xho1
Kpn1
Xba1+Xho1
Xba1+Kpn1
24.0, 24,5 Kb
15.0, 33.5 Kb
1.5, 17.0, 30.0 Kb
9.0, 15.0, 24.5 Kb
1.5, 6.0, 17.0, 24.0 Kb
XhoI XbaI
9.0
XhoI XbaI
15
9.0
24.5
Kb
17
Kb
KpnI
KpnI
15
6.0 1.5
Restriccin
completa
A) Digestiones sencillas
B) Digestiones sencillas
y dobles
KpnI
KpnI
2 cortes
1 corte
1 corte
1 corte
1 corte
0 cortes
1.5 Kb
17.0 Kb
18.5 Kb
30.0 Kb
31.5 Kb
48.5 Kb
Construccin de un mapa de
restriccin en DNA circular
(digestin parcial de PstI)
DNA Ligasas
En la clula (eucariota y procariota), tienen como funcin
corregir las discontinuidades en la hebra de DNA causadas en
el mecanismo de replicacin de la hebra retardada del DNA,
por la reparacin de errores en la replicacin o bien por
agresiones externas al DNA: qumicas, fsicas, etc.
Su papel en la biotecnologa es el de catalizar la unin de
fragmentos distintos de DNA, tanto si son romos, como si son
cohesivos. Favorecen la formacin del enlace covalente
fosfodister entre 3-OH y 5-fosfato.
10
Si la T de la reaccin es mayor
que la Tm de los extremos
cohesivos, no hay ligacin: T y
t de reaccin habitual: de 16C
2h a 4 C O/N.
11
Electroforesis en gel de
agarosa
Fosfatasa alcalina
A) Defosforilacin del vector
OH
OH
OH
OH
OH
OH
B) Ligacin inserto-vector
OH
OH
OH
OH
OH
OH
12
Reaccin preferente
Reaccin minoritaria
Propsito:
Fosforilacin de adaptadores.
Marcaje radiactivo de oligonucletidos.
13
EcoRI
EcoRI
14
T7 RNA polimerasa
Escherichia coli
TAATACGACTCACTATAGGG
T3 RNA polimerasa
Escherichia coli
AATTAACCCTCACTAAAGGG
Salmonella typhimurium
AATTTAGGTGACACTATAGAA
Expresin dirigida de
protenas in vivo (bacteria)
Transcripcin-traduccin
acopladas in vitro (sistema
libre de clulas)
15
1.- Sntesis 5-3 de DNA de doble hebra a partir de DNA de hebra sencilla:
Generacin de sondas marcadas.
3.- delecin de extremos 3 protuberantes para generar extremos romos (exo 3-5).
16
DNA Polimerasas
termoestables
Polimerasa
3'->5'
Exonucleasa
Fuente y Propiedades
Taq
No
Pfu
Si
De Pyrococcus furiosus.
furiosus Tiene la menor tasa de error
de todas las DNA polimerasas termoestables
conocidas. Menor tasa de error (10-6).
Vent
Si
1.-Generacin de cDNAs
de doble hebra para
construir genotecas de
expresin.
2.-Generacin de cDNAs
de cadenas sencilla con
los que realizar RT-PCR.
17
Propiedad de
soga rgida
(soluciones
viscosas)
Desnaturalizacin
del dsDNA e hipercromicidad
Desnaturalizacin
reversible
DNA rico
en G+C
DNA rico
en A+T
18
Concepto de Hibridacin
Hibridacin In Situ
Estudio de cromosomas
19
20
TRANSFERENCIA
Tcnica Southern:
Transferencia e
hibridacin
21
Interpretacin de
un experimento
de Southern
Northern
22
Western: Transferencia
23
Western: Resultado
Gel SDS-PAGE
Filtro nitrocelulosa
24
Secuenciacin
enzimtica
Secuenciacin enzimtica
(con nucletido radiactivo)
25
Secuenciacin Automtica
(con cebador marcado con fluorocromo tetrametilrodamina)
Secuenciacin Automtica
(
(con
cuatro fluorocromos
fl
diferentes)
dif
)
26
Cromatograma
27
E
Ecuacin
i del
d l
Componentes de la PCR:
1.
2.
3.
4
4.
DNA molde.
Oligonucletidos.
DNA dep.-DNA polimerasa.
Desoxinucletidos
Desoxinucletidos.
28
Diseo de oligonucletidos
RT-PCR
mRNA completo
(variante larga)
Variante
V
i
de
d splicing
li i
(variante corta)
M C+ C- T1 T2 T3 T4
Completo
Variante 1
Variante 2
29
30
31
Filtro de
Nitrocelulosa
Serie pUC
(Universidad de California)
32
-COMPLEMENTACIN
Genoma Bacteriano o bien Plsmido F
Plsmido pUC
RNApol
p
o
33
Seleccin Blanco/
Azul con X
X-Gal
Gal
Clonacin en
extremos cohesivos
(Eco RI)
34
Clonacin en extremos
romos (HaeII)
5 ACGATGGCCACGAT 3
3 TGCTACCGGTGCTA 5
HaeIII
5 ACGATGG
3 TGCTACC
CCACGAT 3
GGTGCTA 5
DNA ligasa
5 ACGATGGCCACGAT 3
3 TGCTACCGGTGCTA 5
35
TRANSFORMACION
CON VECTORES DE
EXPRESION
Vectores de expresin
procariticos (T7) y
eucariticos (CMV)
36
Vectores pET de
expresin
Genoma bacteriano
modificado
Protena
Vector
37
38
Vector recombinante
Stuffer
R: diana de restriccin
Bacterifago : ciclos
ltico y lisognico
39
Bacterifago
20 Kb
9 Kb
Stuffer
40
Csmidos
41
Vectores de Clonacin:
Estudio de genes aislados (Lambda, cos) y construccin de mapas fsicos (ACs)
Vector
Tamao
mximo
inserto
N Aprox. de
clones necesarios
en la genoteca
Ventajas
Desventajas
Facilidad p
para construir
genotecas.
Insertos relativamente
estables.
Requiere
R
i muchos
h clones.
l
Dificultad para obtener
DNA de los clones.
lambda
20 kb
5 x 10
csmido
45 kb
2 x 105
No siempre estable.
YAC
1 Mb
104
Muy propenso al
reordenamiento
reordenamiento.
Dificultad para construir.
PAC
~120 kb
105
Origen de replicacin en
copia nica, por lo que es
difcil obtener DNA.
BAC
> 500 kb
5 x 104
Origen de replicacin en
copia nica, por lo que es
difcil obtener DNA.
42
Seleccin negativa
Resistencia a cloranfenicol
Bajo n de copias
Origen de Replicacin
Bajo n de copias
Replicacin direccional
Inserto
43
Cromosoma
artificial de
levadura (YACs)
Seleccin
levadura
CEN: secuencia
centromrica
TEL: secuencia
telomrica
Seleccin
bacteria
Seleccin
levadura
ori
bacteria
Seleccin
levadura
44
Genoteca de
DNA genmico
1er paso:
construccin de una genoteca
representativa.
2do paso:
aislado de clones de nuestro
inters (screening).
Genoteca de
cDNA
45
46
cDNAds
Ligacin
Amplificacin
Titulacin
cDNAds
47
Genotecas:
Titulacin
48
Ligacin
Genotecas de
DNA genmico
i ( y Cos):
C )
Amplificacin
Titulacin
Empaquetado preferente de
los recombinantes con
tamao adecuado
49
Genotecas:
Titulacin
50
51
52
53
54
55
Clonacin in silico
Bibliografa
Banco de datos
Previamente
descrita
Secuencia
Generada en el
laboratorio
Genotecas,
Productos de
PCR, Segmentos
aislado por ERs
y clonados, etc
Anlisis
Algoritmos y filtros
Fiabilidad estadstica
Prediccin
Diseo experimental
Contraste prediccin-resultados
Aplicabilidad
56
57
58
Transposicin
Directa (Simple)
Salta desde un sitio en el
ADN a otro sitio distinto.
Mecanismo de cortar y
pegar
59
Transposones sencillos
Secuencias de insercin o elementos IS
De tamao < 2,000 bp, E. coli contiene 8 copias de IS1 y 5 copias
de IS2.
Repeticiones
terminales cortas
e invertidas
Repeticiones directas
en el ADN husped
Transposones Compuestos
Contienen genes en la regin central, mas dos mdulos del
tipo IS (tanto en la misma orientacin como invertidas)
Los transposones compuestos pueden transportar todo tipo de
secuencias de ADN en su region central
60
Transposones Compuestos
61
1. Transposicin Conservativa
(~corta
(~
corta--y-pega
pega))
El e
elemento
e e to se desp
desplaza
a a de u
un ssitio
t o a ot
otro.
o
Transposable Element
Target
Excision & Integration
Donor
Recipient
http://www.public.iastate.edu/~jzhang/Transposition.html
2. Transposicin replicativa
(~copia
(~
copia--y-pega
pega))
El elemento transponible es copiado, de
modo que una copia queda en el lugar de
origen y la otra es desplazada.
Transposable
El
Element
t
Replication
Target
Integration
Donor
Recipient
62
Retrotransposones
1. El DNA del elemento mvil es transcrito para
dar RNA.
2. Este RNA se retro-transcribe para dar cDNA,
que se inserta en el nuevo sitio.
Transcription
Target
RNA
Reverse Transcription
cDNA
Integration
Donor
63
PCR
Mutagnesis dirigida
64
65
66