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RECUENTO DE ENTEROBACTERIAS

Alejandra Llamuca
Laboratorio de Microbiologa de Alimentos II
FACULTAD DE CIENCIA E INGENIERA EN ALIMENTOS (FCIAL)
UNIVERSIDAD TCNICA DE AMBATO (UTA)
RESUMEN
El recuento de enterobacterias se utiliz un medio diferencial (agar VRBG), las
cuales fueron sembradas en dos tipo de medios con capa simple y capa doble,
por ser las enterobacterias anaerobias facultativas tuvieron mayor crecimiento
en medio anaerobio. La caracterstica de este medio es la formacin de
colonias de color violeta con halos rosados o rojos debido a la degradacin de
la glucosa. Las muestras analizadas correspondi a la muestra de queso
obtenido de un mercado de la cuidad de Ambato, con el objetivo de determinar
el grado de contaminacin de los mismos, de esta manera comprobar si la
muestra de queso cumple con las normas establecidas para cada tipo de
alimento. Al realizar el conteo de enterobacterias en capa simple dio como
resultado
10-1 fue

1,37 x 106 Ufc/g en la dilucin de 10-1 y en capa doble en la dilucin


1,58 x 106 Ufc/g, y en la dilucin 10-2 fue

3,96 x 105 Ufc/g, notando

una clara disminucin de bacterias, de todo ello se podra concluir que el queso
no es apto para el consumo humano ya que la norma para queso es de 2x10 3
Ufc/g.
INTRODUCCIN
La familia Enterobactereacea comprende un nmero muy variado de gneros y
especies bacterianos cuyo hbitat natural es el tubo digestivo del hombre y los
animales. No todos los bacilos Gram negativos que tienen este hbitat forman
parte de la familia Enterobacteriaceae. Se los encuentra en el suelo, agua,
frutas, vegetales y otras plantas y en los animales desde los insectos al
hombre. La familia est definida por un conjunto de caractersticas
fenotpicas(bioqumicas, fisiolgicas e inmunolgicas) a las que se han
agregado posteriormente otros elementos establecidos por tcnicas de
hibridizacin de cidos nucleicos que miden distancias evolutivas y han
definido mejor la interrelacin de todos los microorganismos integrantes de la
familia. Son bacilos Gram negativos rectos, con un dimetro de 0.3 a 1.5
micras. Si son mviles, presentan flagelos pertricos. No forman esporas.
Desarrollan en presencia o en ausencia de Oxgeno (aerobios-anaerobios
facultativos). Desarrollan rpidamente en medios simples, no siendo exigentes

desde el punto de vista nutricional. Algunos desarrollan en glucosa como nica


fuente de carbono, mientras otros requieren el agregado de vitaminas y/o
minerales en el medio de cultivo. Son quimio organtrofos, poseen
metabolismo fermentativo y respiratorio. Son catalasa positivos y oxidasa
negativos; reducen los nitratos a nitritos. El contenido de Guanina + Citosina
del DNA total es de 38 a 60 moles %. En los medios de cultivo forman colonias
lisas, convexas y circulares de bordes definidos. Algunas especies desarrollan
colonias ms mucoides que otras.(Cabello, 2007)
El queso puede ser definido como un producto de la concentracin de los
slidos de la leche, por medio de la coagulacin. En general, la produccin de
quesos, involucra dos fases, primero el desarrollo de un pH adecuado y
posteriormente el desarrollo de caractersticas fsicas y organolpticas
deseables (FAO, 1983)
El objetivo de la prctica es determinar el grado de contaminacin del queso
mediante un anlisis microbiolgico en el recuento de enterobacterias con la
utilizacin de Agar VRBG.
MATERIALES Y MTODOS
Para realizar el recuento de enterobacterias en la muestra de queso,se inicio
con la preparacin de agar de VRBG (OXOID, Inglaterra) el cual es un medio
que no se autoclava sino que se lo funde en un agitador magntico (Corning
PC420D, Mxico), cuando se encuentre traslucida se lleva a cabo a una
plancha hasta que hierva para que no se gelifique. El siguiente paso, para sus
diluciones se pes 10 gr de la muestra de queso, se coloco en la funda y se
disolvi en 90 ml de agua de la llave estril y luego se realiz diluciones
seriadas de cada muestra, desde 10 -1 hasta 10-3, para ello se agit en un
agitador de vortex (Labnet, USA), siendo la muestra de la funda la dilucin 10 1
. Se inocul la dilucin por siembra en profundidad, se verti 20ml del medio y
se incub en el flujo laminar a 30C por 7 das. Este procedimiento se lo
emplea tanto para el proceso de capa simple y capa doble.
CALCULOS Y RESULTADOS
Tabla N 1: Numero de colonias en Agar en las capas

Elaborado por: Llamuca, A; (2014)


Fuente: Laboratorio de Microbiologa I; FCIAL

CLCULOS
N= nmero de colonias
FD= factor de dilucin
Vi= volumen inoculado
Vt= volumen de la dilucin 1/10 en ml
s= Cantidad de muestra para preparar la dilucin 1/10

UFCs/ g=

NFDVt
ViS

UFCs/ g=

152100090 ml
1 ml10 g

UFCs
6
=1,37 x 10
g
Tabla N2: (UFCs/g) de la muestra del queso

Dilucin
10-1
10-2

QUESO (UFCs/g)
Capa Simple
Capa Doble

1,37 x 10

1,58 x 10

3,96 x 105

Elaborado por: Llamuca, A; (2014)


Fuente: Laboratorio de Microbiologa I; FCIAL
DISCUSION
Se pudo aislar precisamente enterobacterias en las muestras, por lo que se
emple un medio selectivo (Agar VRBG), ya que dicho medio permite solo el
aislamiento y recuento de enterobacterias en alimentos, el cual contiene cristal
violeta y sales biliares que inhiben el crecimiento de la flora Gram positiva
(Vandevenne & Ribes, 2002).La sobrevivencia y el crecimiento de los

microorganismos en queso, depende entre otros parmetros, de la actividad de


agua del mismo. Las bacterias crecen generalmente entre valores de aw de 1,0
y 0,90. Debido a que el queso Gouda tiene un valor de aw de 0,95, ste se
encuentra dentro del rango de posible crecimiento de bacterias (SPAHR y URL,
1994). LIMSOWTIN (1992), indica que la sobrevivencia y crecimiento de
algunos microorganismos depende adems, de los compuestos inhibidores
producidos por los cultivos lcticos, como son los cidos producido por stos, y
la flora lctica que se desarrolla durante la maduracin. Por ejemplo, en una
investigacin realizada por CASADO (1985), los recuentos de S. aureus
disminuyeron en 3,7 log durante 75 das de maduracin en queso Feta,
fabricado con 2% de cultivos. Por lo tanto, varios factores pueden influenciar la
presencia y sobrevivencia de patgenos en quesos, como por ejemplo, la
capacidad de tolerar el calor, al cido y la sal, adems, depender de la
cantidad de patgenos presentes en la leche y despus de la pasteurizacin,
de los cultivos lcticos y la adicin de aditivos, entre otros (MADRID,1989).
La presencia de bacterias coliformes en los quesos, puede deberse a
condiciones deficientes de manufactura, como por ejemplo, manipuladores con
presencia de coliformes en las manos agua no clorada, entre otras. Las
bacterias coliformes pueden estar solamente activas durante las etapas
iniciales de fabricacin (prensado y salado). Ello debido a la produccin de
cido lctico durante el primer da dejando sin sustrato (lactosa) a los
coliformes para formar gas a partir de sta. Adems, estas bacterias se inhiben
por el descenso del pH en el rango 5,0 a 5,2 (ALAIS, 1985)
CUESTIONARIO

Indicar

dos

mtodos

normalizados

para

el

recuento

de

enterobacterias
ISO 7402 Directiva general para el recuento, sin revivificacin, de las
Enterobacteriaceae. Tcnica del NMP y mtodo por recuento de colonias
Esta directiva expone dos mtodos para el recuento de enterobacterias. El
primero de ellos se recomienda utilizar en muestras que se sospecha que
presentan contaminacin baja (1 100 por mililitro o gramo de muestra).
Para ello se siembran en tres tubos de medio de doble concentracin, una
cantidad determinada de la muestra problema si la muestra es lquida o una
cantidad determinada de la suspensin madre en el caso de los otros
productos. Despus y en las mismas condiciones, se siembran tres tubos
con medio de concentracin simple con la primera dilucin decimal
obtenida a partir de la muestra problema o de la suspensin madre. Los
tubos se incuban a 35 C 37 C (segn acuerdo) durante 24 horas. A partir
del nmero de tubos positivos confirmados se calcula el nmero ms
probable de Enterobacteriaceae por mililitro o por gramo de muestra de
ensayo mediante la tabla NMP. El segundo mtodo se basa en la siembra en

profundidad con el medio agar biliado cristal violeta glucosa, en placas de


Petri, con una cantidad determinada de la muestra a examinar, si el
producto es lquido o una cantidad determinada de la suspensin madre en
el caso de los otros productos. En las mismas condiciones siembra de
diluciones decimales obtenidas a partir de la muestra problema o de la
suspensin madre. Incubacin de las placas a 35 C 37 C durante 24
horas +/- 2 horas. Clculo del nmero de Enterobacteiaceae por mililitro o
por gramo de muestra, a partir del nmero de colonias caractersticas
confirmadas obtenidas en las placas de Petri
NF V 08-054 Mtodo de rutina para la enumeracin de Enterobacteriaceae
mediante el recuento de colonia. Este mtodo se basa en la siembra en
profundidad con el medio agar biliado cristal violeta glucosa, en una placa
de Petri, con una cantidad determinada de la muestra a examinar, si el
producto es lquido o una cantidad determinada de la suspensin madre en
el caso de los otros productos. Se recubre la placa con una segunda capa
del mismo medio. En las mismas condiciones siembra de diluciones
decimales obtenidas a partir de la muestra problema o de la suspensin
madre. Incubacin de las placas a 30 C durante 24 horas +/- 2 horas.
Clculo del nmero de Enterobacteiaceae por mililitro o por gramo de
muestra, a partir del nmero de colonias caractersticas confirmadas
obtenidas en las placas de Petri

Qu indica la presencia d enterobacterias en un alimento?

La presencia de Enterobacteriaceae dentro del organismo es anormal y


determina la aparicin de infecciones, cuya gravedad depende del punto de
entrada. Introducidas por los alimentos, provocan problemas intestinales al
adherirse y atravesar la barrera de la mucosa gastrointestinal, manifestada
por diarreas y deshidratacin

Cmo

se

definen

coliformes

coliformes

fecales?.

Establezca las diferencias.


Coliforme: este grupo de microorganismos comprende varios gneros de la
familia Enterobacteriaceae, capaces de fermentar la lactosa, estn
ampliamente difundidos en la naturaleza, agua y suelo. Tambin son
habitantes nrmales del tracto intestinal del hombre y animales de sangre
caliente. Pueden fermentar la lactosa a 35Ccon produccin de gas. Dentro
de los coliformes totales se puede distinguir dos tipos, los coliformes
fecales, que provienen del tracto intestinal del hombre y animales, que
seran los mejores indicadores de riesgo de infecciones y los coliformes
residentes naturales del suelo y del agua.
La denominacin

genrica coliformes designa a un grupo de especies bacterianas que tienen


ciertas caractersticas bioqumicas en comn e importancia relevante
como indicadores de contaminacin del agua y los alimentos
Coliformes fecales: son coliformes totales que adems fermentan la
lactosa con produccin de cido y gas en 24-48 horas a temperaturas
comprendidas entre 44 y 45C en presencia de sales biliares. Los coliformes
fecales
comprenden
principalmente E.coli y
algunas
cepas
de
Enterobacter y Klebsiella. Su origen es principalmente fecal y por esos se
consideran ndices de contaminacin fecal. Pero el verdadero ndice de
contaminacin fecal es E.coli tipo I ya que su origen fecal es seguro. Desde
el punto de vista metodolgico E.coli es el coliforme ms es positivo a la
prueba del Indol

Cules son los gneros y especies ms representativos de


enterobacterias?

Qu

factores

determinan

la

patogenicidad

de

las

enterobacterias?
La cpsula tiene propiedades de adhesinas y es antifagoctica
Las fimbrias permiten la adherencia a la clula husped e impiden el
barrido por las barreras mecnicas de defensa del organismo
Debido a que el hierro es indispensable para ciertas funciones de las
bacterias, estos microorganismos producen aerobactinas que permiten
la captacin de hierro desde el medio.

Todas las enterobacterias poseen el lipopolisacrido de pared, el cual


tiene accin de endotoxina, la cual se libera al destruirse la bacteria.
Exotoxinas: no todas las especies la producen. Slo son producidas por
las patgenas obligadas y poseen efectos especficos

Cmo explica la patogenicidad de algunas enterobacterias a


pesar de que estas forman parte de la flora normal del tracto

digestivo del hombre y los animales?


La presencia de enterobacterias dentro del organismo es normal, pero
puede determinar la aparicin de infecciones, cuya gravedad depende
principalmente de la capacidad patolgica o de la virulencia de la
especie en cuestin y de las caractersticas del hospedador. Introducidas
por los alimentos, provocan problemas intestinales al adherirse y
atravesar la barrera de la mucosa gastrointestinal, manifestada
por diarreas y deshidratacin.
Ciertas especies provocan patologas especficas:
La especie Salmonella typhi es responsable de la fiebre tifoidea.
La especie Shigella dysenteriae es el agente responsable de
la disentera bacilar.
La
especie Escherichia
coli es
responsable
de
la gastroenteritis infantil.
La especie Yersinia pestis es responsable de la peste.
La especie Serratia marcescens usualmente causa infecciones
nosocomiales como resultado del tratamiento en un horpital.
Las enterobacterias incluyen a organismos que resultan patgenos para el ser
humano como la Escherichia coli o la Salmonella, especialmente importantes
en la mortalidad infantil en pases en desarrollo 3 y patgenos para las plantas
como Erwinia,
en
la
mayor
parte
de
los
casos
causando infecciones oportunistas. Todos los bacilos de Enterobacteriaceae son
resistentes a antimicrobianos comunes, tales como la penicilina, la meticilina y
la clindamicina, entre otros
CONCLUSIONES
Se determin el grado de contaminacin del queso mediante un anlisis
microbiolgico en el recuento de enterobacterias con la utilizacin de Agar
VRBG, en el cual se observ el crecimiento de colonias, sin embargo las
muestra de queso no se encuentra en un rango para el consumo humano,
teniendo en la salud un riesgo para el consumidor, en donde cuya
contaminacin pudo haber sido por la mala conservacin del producto o a la
vez por la falta de higiene en la manipulacin.
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