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desarrolla en forma de cascada. Si bien con fines didcticos se describen dos
mecanismos de activacin, uno intrnseco y otro extrnseco, entre ambos
existen interconexiones y sistemas de retroalimentacin (positivos y negativos)
que lo hace un mecanismo complejo y nico. Este modelo de cascada se basa
en una serie de reacciones proteolticas que actan como amplificadores de la
reaccin.
El sistema intrnseco est compuesto por factores que se encuentran todos en
circulacin, mientras que el sistema extrnseco incluye el FT que, en
condiciones normales, no se encuentra en circulacin.
El sistema de coagulacin est constitudo por protenas plasmticas llamadas
factores de coagulacin, que circulan en la sangre en forma inactiva como
zimgenos o proenzimas. Los mismos se activan secuencialmente, al sufrir un
clivaje enzimtico, dando lugar a la formacin de enzimas activas que
culminan con la formacin de trombina, que al actuar sobre el fibringeno
forma la malla de fibrina.
Hasta ahora han sido reconocidos como factores de coagulacin diez
glicoprotenas plasmticas, que se designaron con nmeros romanos por el
Comit Internacional de Nomenclatura de Factores de la Coagulacin, pero
adems existen otras protenas que tambin intervienen en la coagulacin y
an no han sido designadas numricamente (ver Tabla N 1).
MECANIMO EXTRNSECO
El mecanismo extrnseco se inicia cuando la sangre entra en contacto con
elementos tisulares. El FT se combina en forma estequiomtrica con el FVII, en
presencia de calcio, y forma un complejo enzimtico capaz de activar al FVII
en FVIIa, que es ms activo que el FVII nativo (retroalimentacin positiva), y a
los factores X y IX formando FXa y FIXa.
MECANISMO INTRNSECO
En el modelo celular de la coagulacin se observ que en la llamada fase de
contacto slo interviene el FXI ya que el FXII y
precalicrenas no
desempean un papel importante en la coagulacin.
El FXIa acta sobre el FIX en una reaccin dependiente del calcio formando el
FIXa, el cual forma un complejo enzimtico con los fosfolpidos (factor
plaquetario 3), calcio y FVIII (complejo tenasa) para transformar el FX en FXa.
A partir de all se inicia la va final comn.
VIA FINAL COMN
Se inicia con la activacin del FX por el mecanismo intrnseco o extrnseco. In
vitro puede ser activado por otras enzimas proteolticas como tripsina o veneno
de vbora de Russell en presencia o no de fosfolpidos. El FXa forma el
complejo protrombinasa con fosfolpidos, calcio y FV, el cual acta sobre el
FII para generar trombina.
La trombina es la enzima coagulante por excelencia. Acta sobre el
fibringeno para formar la malla de fibrina, sobre los cofactores V y VIII
aumentando su actividad, y sobre el FXIII, estabilizador de la fibrina. Participa
adems en la adhesividad y agregacin plaquetaria.
El fibringeno es un dmero constitudo por tres pares de cadenas: 2A, 2B y
2. A y B son los fibrinopptidos con densidad de carga negativa que producen
3
repulsin entre las molculas de fibringeno. La trombina libera el
fibrinopptido A de la cadena alfa y luego el B de la cadena beta. As se
forman los monmeros que se polimerizan mediante uniones tipo hidrgeno
formando un gel soluble, la fibrina.
Los polmeros adquieren mayor cohesin y estabilidad cuando acta sobre
ellos el FXIII, previamente activado por trombina, introduciendo enlaces
covalentes entre los monmeros de fibrina.
Vida
Media
(horas)
FACTOR
SINONIMO
PROTEINA
FUNCION
Fibringeno
Estructural
300
50
72-120
II
Protrombina
Serinoproteasa vitamina K
dependiente
100
40
67-106
Proacelerina
Unin
Ayuda al FXa
activacin del FII
10
10-15
12-15
VII
Proconvertina
Serinoproteasa vitamina K
dependiente
0.1
10
4-6
VIII
Antihemoflico A
Unin
0.1
25
10-16
IX
Factor Christmas o
antihemoflico B
Serinoproteasa vitamina K
dependiente
Activa al FX
25-20
18-40
Factor Stuart-Prower
Serinoproteasa vitamina K
dependiente
Activa al FII
20
20-60
XI
Antecedente
tromboplstico
Serinoproteasa
Activa al FIX
15-20
48-80
XII
Factor Hageman
Serinoproteasa
30
50-70
XIII
Estabilizador de la
fibrina
Transglutaminasa o
transpeptidasa
10
10
FACTOR VON
WILLEBRAND
Unin
10
22-40
PRECALICREINA
Factor Fletcher
Serinoproteasa
50
FACTOR
TISULAR
Factor tisular
Unin
QUININOGENOS
DE ALTO PESO
MOLECULAR
Factor Fitzgerald ,
Williams o Flaujeac
Unin
Une la precalicrena y el
FXI al endotelio daado
70
en
la
Activa FIX y FX
Ayuda al FIXa
activacin del FX
en
la
100-200
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las plaquetas. La clave en la regulacin del proceso de coagulacin es
mantener los dos tipos celulares separados hasta que una injuria requiera la
activacin de la coagulacin.
El mecanismo hemosttico se desarrolla en tres etapas: iniciacin,
amplificacin y propagacin.
Fase de Iniciacin: La etapa de iniciacin de la coagulacin se localiza en
clulas que expresan FT en la circulacin sangunea. Dichas clulas
normalmente se encuentran fuera de la vasculatura y la injuria expone el FT.
Inmediatamente se forma el complejo FT-VIIa el cual activa pequeas
cantidades de FIX y FX. El factor Xa se asocia con el Va para formar el
complejo protrombinasa en las clulas que expresan el FT, lo cual genera
pequeas cantidades de trombina. El FXa unido a las clulas est
relativamente protegido de la inactivacin por inhibidores de proteasas;
cuando el FXa se libera de las superficies es rpidamente inhibido por el
Inhibidor del va del Factor Tisular (TFPI) o por Antitrombina. La presencia de
inhibidores circulantes localiza al FXa en el lugar de la lesin. Por el contrario,
el FIXa no es neutralizado por los inhibidores (la AT lo inhibe muy lentamente)
y se puede desplazar a las plaquetas cercanas y otras clulas, llevando la
activacin de la coagulacin de la clula endotelial a otras clulas
(principalmente plaquetas).
Fase de Amplificacin: Como consecuencia de la iniciacin se forman
pequeas cantidades de trombina que cumplirn al menos tres funciones: 1activar las plaquetas; 2- promover la activacin de los cofactores FVIII y FV en
las superficies de las plaquetas; 3- activar tambin al FXI en la superficie
plaquetaria. Al promediar el proceso de amplificacin se generaron las
condiciones necesarias para que en la propagacin de produzcan grandes
cantidades de trombina.
Fase de Propagacin: La finalidad de la fase de propagacin es generar
grandes cantidades de trombina de modo de llegar a la formacin del cogulo
de fibrina. La propagacin se lleva a cabo sobre la superficie de las plaquetas
activadas. En esta fase se incluyen tres conceptos: 1- El FIXa formado durante
la iniciacin se une al FVIIIa en la superficie plaquetaria formando el complejo
tenasa; 2- El factor XIa unido a plaqueta provee mayor cantidad de FIXa y 3Mediante el complejo FIXa/FVIIIa en la plaqueta se debe formar nuevo FXa ya
que el generado en la clula que presenta FT no se puede desplazar a las
plaquetas. De esta manera se forma el complejo protrombinasa (FXa/FVa) que
es generador de grandes cantidades de trombina.
INTERRELACIONES ENTRE MECANISMO INTRNSECO Y EXTRNSECO
El FIX es activado por el FVIIa
El FVII es activado por el FIXa , el FXIa
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GRAFICO N 1. Activacin de la coagulacin: a) va extrnseca in vitro (modelo
de cascada) y b) in vivo (modelo celular)
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Bicromato de potasio ................. 100 g
Acido sulfrico .......................... 500 mL
Agua destilada ...........................1000 mL
Disolver el bicromato de potasio en agua y agregar lentamente el cido
sulfrico en pequeos volmenes, enfriando la solucin. Llevar a volumen.
2) Anticoagulantes o descalcificantes
2-a) Citrato de sodio 0.11 M
Citrato de sodio (2 H 20) ........ 31,3 g
Agua destilada ....................csp. 1000 mL
2-b) Oxalato de sodio 0,1 M
Oxalato de sodio .................. 13,4 g
Agua destilada ..................csp. 1000 mL
2-c) Cloruro de calcio 0,1 M (Solucin Madre)
Cloruro de calcio anhidro ......... 11,1 g
Agua destilada ...................csp. 1000 mL
2-d) Cloruro de calcio 0,025 M (Solucin de trabajo)
Se preparan a partir de la solucin madre realizando una dilucin en
agua destilada.
3) Soluciones tampones
Tampn de Owren modificado pH 7,35
Tampn de Owren pH 7,35 .............. 200 mL
Citrato de sodio 0,025 M .................. 200 mL
TOMA DE MUESTRA
Consideraciones
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Para la extraccin de sangre se debe utilizar jeringas plsticas y agujas
descartables calibre 19 o 20 G. Los tubos para recoger la muestra deben ser
de plstico.
La puncin debe ser precisa y rpida, logrando una buena canalizacin.
La velocidad de salida de la sangre debe ser semejante a la del flujo
sanguneo. Evitar la entrada de aire y la formacin de burbujas, el stasis y la
contaminacin con tromboplastina tisular (evitar el uso prolongado de
torniquete). Ante una extraccin dificultosa se debe proceder al cambio de
jeringa luego de extraer 2-3 mL de sangre.
Transvase: retirar la aguja de la jeringa y verter la sangre por la pared de
los tubos suavemente, a igual velocidad que la extraccin, hasta la marca
prevista. Mezclar inmediatamente por inversin suave varias veces.
Anticoagulante: la proporcin de anticoagulante habitual es 1 parte para 9
partes de sangre. Tener presente que se deber ajustar la relacin
anticoagulante/sangre en caso de hematocritos superiores a 55% (Figura N1
y Tabla N 2).
Centrifugacin: Inmediata (antes de los 20 minutos de realizada la
extraccin). Para obtener:
Plasma rico en plaquetas (PRP): centrifugar a 900 r.p.m. durante 5 minutos.
Plasma pobre en plaquetas (PPP): se obtiene por doble centrifugacin
(primero de sangre entera y luego el plasma citratado y separado) a 3.000
r.p.m. durante 10 minutos cada vez.
Transvase: transferir el plasma inmediatamente a tubos plsticos con
pipetas plsticas. En caso de no poder realizar las pruebas dentro de las 2
horas posteriores a la extraccin, el plasma se mantendr a 4C. Si las
muestras no se procesan en el da, guardar el plasma en freezer (-20C).
FIGURA N1: La relacin del anticoagulante con el volumen plasmtico depende del
hematocrito
Alto
9
TABLA N 2. Relacin anticoagulante/sangre segn el hematocrito
HEMATOCRITO
(%)
10 mL
30
0,62
1,20
35
0,57
1,13
40
0,54
1,07
45
0,50
1,00
50
0,46
0,94
55
0,43
0,87
60
0,39
0,80
65
0,35
0,74
70
0,32
0,66
75
0,28
0,60
80
0,25
0,53
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Tromboelastografa: brinda una visin global del proceso de
coagulacin desde la formacin inicial de trombina hasta el proceso de
fibrinolisis incluyendo las plaquetas
b) Pruebas especficas: se analizan en forma selectiva los factores o
elementos que intervienen o forman parte del compartimiento que se hall
anormal con la realizacin de las pruebas globales.
1) Pruebas para el estudio de la va intrnseca de la coagulacin
Tiempo de coagulacin
Tiempo de coagulacin activado*
Prueba de generacin de tromboplastina*
Tiempo de tromboplastina parcial*
Tiempo de tromboplastina parcial activado
Consumo de protrombina*
Tromboelastografa*
TCNICAS
TIEMPO DE COAGULACIN (Modificado de Lee-White)
Fundamento: Es el tiempo que tarda en coagular la sangre in vitro, al ser
extrada sin mayor contaminacin con tromboplastina tisular.
Procedimiento: Obtener, mediante puncin venosa 3,5 mL de sangre.
Desconectar la aguja y vaciar 1,0 mL de sangre en cada uno de 3 tubos de
hemlisis, previamente colocados en un bao a 37 C. Poner en marcha el
cronmetro al aadir la sangre al primer tubo (al llegar el tercer tubo no deben
haber transcurrido ms de 5 segundos). Inclinar ligeramente el primer tubo e
investigar el deslizamiento de sangre por las paredes del tubo. Repetir la
operacin cada 30 segundos hasta que la sangre coagule (deja de escurrir por
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las paredes del tubo). Seguidamente observar el segundo tubo y se anota
como definitivo el tiempo obtenido en el tercer tubo.
Resultados
Valores de referencia: 5-15 minutos
Observaciones
Este tiempo de coagulacin in vitro reflejar mejor la eficacia del sistema in
vivo, cuanto menos se modifique o manipule esta sangre, pero al carecer de
sensibilidad slo se modifica ante deficiencias severas de factores de la
coagulacin. Entre los factores de orden tcnico que modifican esta prueba
podemos mencionar:
1) Contaminacin con lquidos tisulares (tromboplsticos).
2) Formacin de espuma.
3) Inadecuada limpieza del material.
4) Dimetro de los tubos (se recomienda usar tubos de 11 mm de dimetro)
5) Los movimientos de los tubos.
6) La temperatura.
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Resultados
Valores de referencia: 35-45 segundos.
Cada laboratorio debe establecer los valores de referencia de acuerdo al
reactivo y a la tcnica empleada (manual o automatizada).
El TTPa se usa para evaluar la va intrnseca de la coagulacin, y por lo tanto
se encontrar prolongado en:
Dficit congnito de los factores XII, XI, IX, VIII, X, II y V
Alteracin cualitativa de algn factor
Dficit adquirido de factores (hepatopata, antibitico-terapia,
alimentacin parenteral, etc)
Presencia de inhibidores (especficos o de interferencia)
Pacientes heparinizados
El acortamiento del TTPA puede ser tomado como un indicio de
hipercoagulabilidad.
MONITOREO DE LA ANTICOAGULACION CON HEPARINA
Introduccin
Las complicaciones tromboemblicas arteriales y venosas son susceptibles de
teraputicas preventivas y/o resolutivas por medio de medicamentos que
afectan alguno de los mecanismos normales de la hemostasia. Los
medicamentos que afectan la cintica de la coagulacin directa o
indirectamente son las heparinas y los anticoagulantes orales (dicumarnicos).
La heparina es el anticoagulante ms usado por va parenteral en medicina
clnica humana. Ejerce su efecto unindose a ciertas protenas plasmticas
llamadas serpinas, de las cuales la Antitrombina (AT) es la nica que expone
su sitio activo, normalmente inaccesible, por unin a heparina. El papel
fisiolgico de la AT es regular las serinoproteasas de la coagulacin,
incluyendo trombina y los factores XIIa, XIa, Xa y IXa. La accin de la heparina
consiste en unirse a la AT provocando cambios conformacionales en sta, que
hacen ms asequible su sitio neutralizante y por lo tanto acelerando
enormemente su capacidad inhibitoria sobre la trombina y FXa.
Las heparinas son glicosaminoglicanos sulfatados con fuerte carga negativa,
extrados de pulmn o mucosa intestinal de origen bovino o porcino, que se
presentan en forma de polmeros. Su efecto sobre la trombina y FXa vara de
acuerdo al peso molecular de las mismas.
En general, accin anticoagulante y antitrombtica no son trminos sinnimos,
ya que la accin anticoagulante puede ser observada in vitro; la sangre en
general es poco coagulable y los tiempos de coagulacin suelen estar
prolongados, siendo un proceso esencialmente plasmtico; mientras que el
efecto antitrombtico es un fenmeno primordialmente observable in vivo, los
tiempos de coagulacin podran ser normales an con buen efecto
antitrombtico, siendo un proceso multicelular en el que participan
componentes plasmticos junto a componentes celulares como endotelio,
plaquetas, eritrocitos y leucocitos. Las heparinas de bajo peso molecular (PM
entre 4.000 y 6.500) tienen reducida su capacidad antitrombnica (anti-IIa)
medida por el alargamiento del TTPA mientras que conservan su capacidad
antitrombtica medido por su accin inhibitoria sobre el FXa. En cambio las
heparinas no fraccionadas (HNF), de alto peso molecular o convencionales
tienen tanto efecto anti-IIa como efecto anti-Xa.
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Control de la teraputica con heparina
Se puede realizar por varios mtodos:
1. Tiempo de tromboplastina parcial activado
2. Tiempo de trombina
3. Determinacin del nivel de heparinemia
La prueba de eleccin ser aquella que tenga precisin, reproducibilidad y se
procese en un tiempo corto. El TTPA tiene la ventaja de poder ser realizado en
pocos minutos y su reproducibilidad dentro de los rangos teraputicos es
mayor que con el tiempo de coagulacin, que ha sido el mtodo ms usado en
el control. Si bien el tiempo de trombina es un mtodo rpido y reproducible,
tiene la desventaja de que el reactivo de trombina es inestable an conservado
a bajas temperaturas.
En el monitoreo de la terapia con HNF empleando el TTPA, se considera que
el tratamiento es adecuado cuando el APTT del paciente prolonga entre 1,5 a
2,5 veces los valores del APTT basal (esta relacin se denomina razn)
razn = TTPA paciente
TTPA basal
Debe establecerse el rango teraputico del sistema de TTPa usado (de
acuerdo al reactivo y sistema de deteccin), ya que para un mismo valor de
heparinemia el rango vara segn el sistema de TTPA empleado.
En la prctica lo que se hace es evaluar la respuesta del sistema de TTPA en
plasma de pacientes con diferentes dosis de HNF y adoptar la razn (rango
teraputico) que corresponda a una concentracin de heparina en sangre de
0,2 a 0,4 UI/mL. Por lo tanto, se debe ajustar la dosis de heparina de manera
de mantener el TTPA entre 1,5 y 2,5 del valor basal.
PRUEBA DE CORRECCIN CON PLASMA NORMAL
Un TTPA prolongado se debe corregir con plasma normal. La prueba consiste
en determinar el valor de TTPA en una mezcla constituida por 1 volumen de
plasma del paciente y 1 volumen de plasma normal (relacin 1/1). De esta
manera se podr evaluar si la alteracin es debida a un dficit de factores o a
la presencia de inhibidores.
P (paciente): PPP paciente
TTPA (M) - TTPA (N)
ndice de Rossner (IR) =
TTPA (P)
Interpretacin
IR < 0,1
Corrige. Por lo tanto hay dficit de factores de la va intrnseca.
IR > 0,1
No corrige. Hay un efecto inhibitorio.
Este valor tambin debe ser establecido en cada laboratorio. En nuestro
sistema se considera que corrige cuando es inferior a 0,1.
DETERMINACIN DEL NIVEL DE HEPARINEMIA
Se puede valorar la accin de la heparina de bajo peso molecular mediante
metodologa que mide directamente su capacidad de potenciar la inhibicin del
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FXa por la AT, para ello se desarrollaron mtodos coagulables y mtodos
amidolticos.
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CURVA DE CALIBRACIN
Preparar diluciones de un pool de plasmas normales (mezcla en partes iguales
de plasma fresco citratado, de por lo menos 20 dadores normales) en solucin
fisiolgica, segn se indica en la tabla y determinar el TP para cada dilucin.
Realizar cada determinacin por duplicado. Al usar solucin fisiolgica como
diluyente, se produce una dilucin progresiva del fibringeno, que afecta la
formacin y visualizacin de la malla de fibrina. Por ello, se aconseja mover
lentamente el tubo para observar la formacin del cogulo, luego de
transcurrido un tiempo equivalente al tiempo de coagulacin de la dilucin
anterior.
TUBO
N
1
2
3
4
5
6
7
SOLUCION
FISIOLOGICA (mL)
0,3
0,5
0,6
0,7
0,8
1,75
POOL NORMAL
(mL)
1
0,7
0,5
0,4
0,3
0,2
0,25
CONCENTRACION
(%)
100
70
50
40
30
20
12,5
Resultados
Se expresan en porcentaje de actividad en relacin a la mezcla de plasmas
normales, al cual se asigna por definicin 100% de actividad. Obtenido el
tiempo de coagulacin, extrapolar en la curva de calibracin e informar la
actividad del plasma analizado.
La curva se debe realizar para cada lote de tromboplastina, para cada aparato
y metodologa utilizada (una curva para el mtodo manual y una curva para
cada coagulmetro).
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Valores de referencia: 70-120 %
Cada laboratorio debe establecer su rango de referencia determinando el TP
en por lo menos 20 individuos sanos que incluyan mujeres y varones, con
edad entre 14-70 aos.
La prolongacin del TP puede deberse a:
Sntesis disminuida por alteraciones en la funcin heptica.
Alteraciones en el ciclo de la vitamina K (alteracin en la actividad
procoagulante pero con sntesis normal).
Deficiencia congnita de alguno de los factores.
Presencia de un inhibidor adquirido que interfiera en la va extrnseca.
Observaciones
Cuando el plasma se diluye en solucin fisiolgica, todos los factores estn
igualmente reducidos, en cambio, en los pacientes tan slo uno o algunos de
estos factores pueden estar disminuidos; por lo tanto el porcentaje global
obtenido no es reflejo proporcional del defecto presente.
La expresin del TP en porcentaje es til en los pacientes sin anticoagulacin
oral y es la ms indicada en los estudios de rutina.
PRUEBA DE CORRECCIN CON PLASMA NORMAL
Un TP prolongado se debe corregir con plasma normal, en una relacin 1/1,
para evaluar si la alteracin es debida a un dficit de factores o a la presencia
de inhibidores.
Si la prolongacin de la prueba es debida al dficit de uno o ms factores
intervinientes en el TP, el valor obtenido en el TP de la mezcla (TPM) tendr un
valor igual o superior al TP terico calculado. Es decir, la prueba CORRIGE
porque el plasma normal aporta el o los factores ausentes en el plasma del
paciente.
TPM TPterico calculado CORRIGE
Se considera que la prueba de correccin NO CORRIGE cuando la misma
exhibe tiempos prolongados, sugiriendo la presencia de un inhibidor.
TPM < TPterico calculado
NO CORRIGE
TP P : paciente
TP N : normal
Ejemplo:
TPP = 30 %
TPN = 100%
TP terico calculado = 65 %
Si el TPM obtenido es mayor o igual a 65% significa que la prueba corrige
(dficit de factores), mientras que si el valor obtenido es menor de 65%
significa que no corrige (presencia de un inhibidor).
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ISI = b x ISIr
El ISI de la tromboplastina de referencia es = 1
No deben utilizarse tromboplastinas que tengan ISI superior a 1,2
Resultados
Expresin del control de la teraputica anticoagulante oral en Razn
Internacional Normatizada (RIN)
Primero se calcula el cociente r:
r = TP del plasma del paciente anticoagulado
TP promedio de los plasmas normales
Luego, conociendo el ISI de la tromboplastina usada en la determinacin, se
calcula el RIN mediante la frmula:
RIN = rISI
TIEMPO DE TROMBINA
Fundamento: Esta prueba mide el tiempo de coagulacin del plasma citratado
en presencia de una cantidad fija de trombina. Permite evaluar la
transformacin del fibringeno en fibrina, excluyendo la participacin del
Factor XIII. Concentraciones de PDF/pdf mayores a 40 g/mL prolongan el
Tiempo de Trombina (TT), la prueba es alterada por trazas de heparina pero
con valores mayores de 60 segundos no se correlaciona con la heparinemia.
Reactivos y Procedimiento
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Solucin de trombina de origen humano o bovino (100 U/mL). Se diluye en
el momento de ser utilizada de modo tal que la prueba realizada con plasma
normal d un valor de 18 a 20 segundos (aproximadamente 5 U/mL).
En un tubo de vidrio previamente incubado durante 1 minuto en un bao de
agua a 37 C colocar:
- 200 L de PPP (normal o problema)
Incubar durante 30 segundos.
- 100 L de la solucin de trombina diluda.
A los 5 seg aproximadamente comenzar a investigar la formacin de la red de
fibrina y registrar el tiempo de coagulacin. Realizar la prueba por duplicado.
Resultados
Valores de referencia: entre 15-20 segundos.
Se informa el tiempo de coagulacin de la muestra expresado en segundos,
junto con el tiempo de trombina del plasma normal (control).
Esta prueba se ve alterada por anomalas cualitativas (el fibringeno fetal
presenta prolongacin de esta prueba por su contenido en cido silico) y
cuantitativas del fibringeno; inhibidores adquiridos del tipo antitrombina,
productos de degradacin de la fibrina y/o fibringeno; presencia de
paraprotenas. Si bien esta prueba se prolonga por la presencia de heparina,
no se utiliza para monitorear el tratamiento con este anticoagulante por su gran
sensibilidad. Los pacientes con tratamientos crnicos con dicumarnicos
presentan un TT 4 a 6 segundos mayor que el de referencia.
TIEMPO DE REPTILASA
Fundamento: Esta prueba mide el tiempo de coagulacin del plasma citratado
por accin de una enzima derivada del veneno de vbora Bothrops atrox, la
reptilasa. La enzima promueve la transformacin del fibringeno en fibrina, por
su accin proteoltica semejante a la de la trombina. La reptilasa escinde el
fibrinopptido A de la molcula del fibringeno y no es inhibida por la
antitrombina, por lo que el tratamiento con heparina no interfiere o afecta su
actividad.
Procedimiento
En un tubo de vidrio, incubado durante 1 minuto en un bao de agua a 37C,
colocar:
- 150 L de PPP (normal o problema)
Incubar durante 1 minuto.
- 50 L de reactivo (extracto purificado del veneno de Bothrops atrox)
Registrar el tiempo de coagulacin. La prueba debe realizarse por duplicado.
Resultados
Valores de referencia: 15-22 segundos
Se informan los tiempos de coagulacin expresados en segundos del plasma
problema y del plasma normal. Se considerar prolongado cuando la
diferencia con el control resulte mayor de 5 segundos.
Esta prueba es de utilidad para el estudio de las disfibrinogenemias congnitas
y adquiridas (hepatopatas, macroglobulinemias). El Tiempo de reptilasa no se
altera por la presencia de heparina ni de hirudina, pero s por niveles elevados
de PDF/pdf.
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TIEMPO DE STYPVEN
Fundamento: El reactivo de Stypven (veneno de vbora de Rusell) contiene un
complejo enzimtico con actividad sobre los factores de la coagulacin. Ha
sido demostrado que los componentes del veneno activan directamente el FX
a FXa sin la participacin de otros factores de la coagulacin. Esta propiedad
es empleada para diferenciar una deficiencia del FVII de una deficiencia de
FX.
El tiempo de coagulacin del plasma, desencadenado por el agregado del
reactivo de Stypven, es independiente de la concentracin del Factor VII en la
muestra.
Procedimiento
Colocar en bao de agua a 37 C un tubo de vidrio y agregar los siguientes
reactivos:
- 100 L de PPP (normal o problema)
- 100 L de Stypven-cefalina.
Incubar 30 segundos exactamente y adicionar
- 100 L de CaCl2
Registrar el tiempo de coagulacin de la muestra.
Resultados
Valores de referencia: 10-17 segundos
Se informan los tiempos de coagulacin expresados en segundos del plasma
problema y del plasma normal.
DETERMINACIN DE LOS FACTORES DE COAGULACIN
El estudio de los factores de coagulacin comprende:
1. La determinacin funcional.
2. La determinacin inmunolgica.
La determinacin funcional se puede realizar dosando la actividad coagulante
de los factores empleando para ello un sistema coagulable. Adems, se puede
determinar la actividad amidoltica, mediante la utilizacin de pptidos
sintticos (sustratos cromognicos), cuya secuencia de aminocidos es
semejante a los sustratos naturales.
En general, existe correlacin entre la actividad coagulante y la actividad
amidoltica, excepto en ciertas alteraciones moleculares. Cuando este defecto
implica cambios estructurales que alteran la interaccin con el sustrato natural,
aunque no afecten el sitio activo, ello disminuye la actividad coagulante y, en
cambio, no afectan la interaccin con el sustrato sinttico, mantenindose la
actividad amidoltica.
En la determinacin inmunolgica de la concentracin de protena plasmtica
completa, se pueden usar diversas tcnicas: radioinmunoensayo,
enzimoinmunoensayo,
inmunodifusin
radial,
electroinmunodifusin,
inmunoturbidimetra, inmunonefelometra, etc. El empleo de estas tcnicas ha
demostrado que factores con niveles antignicos normales (cantidad de
protena) pueden tener alteraciones moleculares de causa congnita o
adquirida, que disminuyen su actividad biolgica en los sistemas de
coagulacin o sustratos cromognicos. Estas modificaciones cualitativas de los
factores pueden ser evidenciadas por: inmunoelectroforesis cruzada, tcnicas
cromatogrficas, anlisis de secuencia de aminocidos, y otras.
21
22
Resultados: Los resultados se expresan en unidades por mililitro (U/mL) o en
%, deducidos de una curva de valoracin construda utilizando una mezcla de
plasmas normales (estndar de trabajo) de actividad conocida (0.1 U/mL o
100%).
Curva de calibracin
DILUCIN DEL PLASMA
DE REFERENCIA
1/2
1/4
1/8
1/20
1/40
1/80
%
100
50
25
10
5
1
23
Tampn de Michaelis pH 7,35 (ver reactivos) para realizar las diluciones
PPP
Procedimiento
Colocar en un bao de agua a 37C un tubo de vidrio y agregar los siguientes
reactivos:
- 100 L de plasma deficiente en FV
- 100 L de PPP diludo 1/10 en tampn de Michaelis
- 100 L de tromboplastina
Incubar exactamente 20 segundos
- 100 L de CaCl2 0,025 M
Registrar el tiempo de coagulacin de la mezcla.
Resultados
Los resultados se expresan en unidades por decilitro (U/dl en %) y se
deducen de una curva de calibracin construida empleando como calibrador
un plasma de referencia o un pool de plasmas normales. Cada nuevo lote de
reactivos debe ser controlado, trazando la curva correspondiente.
Curva de calibracin
DILUCIN DEL
PLASMA CONTROL
1/10
1/20
1/40
1/80
%
100
50
25
12,5
24
- 100 L de de la solucin de trombina (100 U/mL).
Mezclar suavemente y registrar el tiempo de coagulacin de la mezcla. La
prueba debe efectuarse por duplicado.
Resultados
Los resultados se expresan en gramos de fibringeno por 1itro de plasma La
concentracin se deduce de una curva, en escala logartmica, del tiempo de
coagulacin (segundos) en funcin de la concentracin de fibringeno (g/L).
Para realizar la curva se preparan diluciones (1/5, 1/10, 1/20, 1/40) del
estndar de fibringeno en tampn imidazol pH 7,5 y luego se determina el
tiempo de coagulacin por accin de la trombina para cada dilucin.
El tiempo de trombina de la muestra incgnita se interpola en la curva y se
obtiene la concentracin de fibringeno.
Valores de referencia: 1,7-4,0 g/L
Los siguientes algoritmos resultarn tiles en la interpretacin de las pruebas
de uso frecuente en el laboratorio de hemostasia.
No corrige
Corrige
Bsqueda de Inhibidor
Corrige
No Corrige
Dosaje de
precalicrenas
Corrige
Dosaje de factores
de la va intrnseca
No Corrige
Bsqueda de
inhibidor
25
Corrige
No Corrige
Dosaje de
Fibringeno
Tiempo de Reptilasa
Alterado
Normal
Disminuido
Hipo o afibrinogenemia
Congnita o adquirida
Disfrinogenemia
Congnita o adquirida
Inhibidor tipo
heparina
BIBLIOGRAFA
Manual de Hematologa de la Academia Nacional de Medicina. 1990.
Manual de Hemostasia y Trombosis - Grupo Cooperativo de Hemostasia y
Trombosis (Grupo CLAHT). 1990.
Hemostasia y Trombosis Tcnicas e interpretacin. Dr. Edgardo Iglesias 1978.
Gua de trabajos prcticos de Hemostasia. Universidad de Buenos Aires.
Departamento de Anlisis Clnicos 1987.
Wintrobes Clinical Hematology . 9 Edicin. 1993.
Trombosis. Tomo 1. Ral Altman y colaboradores. 2005.
Fundamentos para el Manejo Prctico en el Laboratorio de Hemostasia. Grupo
CAHT (Grupo Cooperativo Argentino de Hemostasia y Trombosis). 2003.
Guas de Trabajo Prctico del Curso de Posgrado Avances en Hemostasia 1999.
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. UBA.
Monroe D.M., Hoffman M. What does it to make the perfect clot? Arterioscler
Thromb Vasc Biol. 2006; 26:41-48.
Roberts H.R., Monroe D.M., Escobar M.A. Current concepts of Hemostasis.
Anesthesiology V 100, N 3, Mar 2004.
Collection, transport and processing of blood specimens for testing plasma based
coagulation assays and molecular hemostasis assays. Approved guideline- Fifth
edition. NCCLS 2012; 28(5).