Coliformes Totales y Fecales

Introduccin
Los microorganismos patgenos que pueden ser transmitidos por agua
son bacterias, virus y protozoarios. Ellos habitan en el sistema digestivo y son
desalojados a travs de las heces; por lo que la contaminacin fecal del agua
puede ocurrir, resultando en la transmisin de microorganismos infecciosos y
en enfermedades tales como Salmonellosis, Colera, Shigelosis, Hepatitis A y E,
Miocarditis, Meningitis, Criptosporidiosis y otras.
El examen rutinario de patgenos entricos es difcil y algunas veces
imposible; es mucho ms fcil demostrar la presencia de algunos tipos de
microorganismos no patognicos que habitan en el sistema digestivo tales
como el grupo de Coliformes Totales.
Las bacterias Coliformes Totales estn frecuentemente asociadas a
organismos patognicos entricos y por muchos aos han sido utilizadas como
indicadores de contaminacin fecal en agua y alimentos; este grupo incluye
Escherichia coli, Enterobacter, Klebsiella y Citrobacter. Coliformes Fecales las
cuales son ms claramente de origen fecal. Este grupo esta integrado por
Escherichia coli y Klebsiella que se distinguen por fermentar lactosa a 44.5 oC
en 24 h con produccin de gas.
Habilidades y actitudes
Manejo de la tcnica de filtracin, medir con precisin y exactitud, identificar
unidades formadoras de colonias, respeto al medio ambiente, seguimiento de
la normatividad de seguridad e higiene y liderazgo.
Desarrollo de la Prctica
Principio del mtodo
El mtodo se basa en filtrar un volumen determinado de muestra a
travs de una membrana de nitrocelulosa de 0.45 m de tamao de poro y 47
mm de dimetro que atrapa la bacteria en su superficie. La membrana se
coloca sobre una placa de un medio de cultivo diseado para el crecimiento de
la bacteria en forma diferencial, es decir, la bacteria crecer desarrollando una
caracterstica distintiva; por ejemplo, color de la colonia, que permitir su
identificacin y enumeracin. El mtodo ms tradicional en la identificacin de
coliformes es el del Numero Mas Probable. Este mtodo estadstico est basado
en el hecho de que entre ms grande el numero de bacterias en la muestra
mayor numero de diluciones son necesarias para reducir su densidad a tal
punto que ningn crecimiento es observado en los tubos de dilucin.

El mtodo de filtracin rene una serie de ventajas en comparacin con el

mtodo de Numero Mas Probable como lo es el ser ms rpido, sencillo y
volmenes ms grandes de muestra pueden ser probados; sin embargo, es
necesario realizar diluciones en aguas con alto contenido de slidos
suspendidos para evitar obstruir la membrana.
Equipo e Instrumental
a. Bomba de vaco.
b. Manifold con embudos de filtracin.
c. Membranas de 0.45 m de tamao de poro y 47 mm de dimetro.
d. Pipeta estril de 10 ml.
e. Pinzas de diseccin.
f. Pipeteador.
g. Mechero
h. Plancha de calentamiento.
g. Cajas petri de 100 x 15.
Medios de cultivo
a. Coliformes Totales: mezcle 51g de Emendo Agar Less (Difco, Detroit, MI)
y 20 ml de alcohol etlico en 1 L de agua destilada, caliente hasta la
ebullicin y vacie de 12 a 15 ml por caja petri, permita que solidifique,
rotule, empaque y conserve a 4oC.
b. Coliformes Fecales: prepare una solucin 1N de Hidrxido de Sodio con
1% de cido resolico. Posteriormente, mezcle 51 g de Agar de mFC
(Difco, Detroit,MI) en agua destilada, caliente hasta la ebullicin, retire,
agregue 10 ml L-1 de la solucin de NaOH y cido roslico y caliente
nuevamente permitiendo hervir por 1 min. Vacie de 12 a 15 ml del
medio de cultivo por caja petri, permita que solidifique, rotule, empaque
y conserve a 4C.
Procedimiento
a. Esterilice en seco, humedeciendo en alcohol etlico y flameando en el
mechero, un par de pinzas de diseccin y colquelas en cajas petri estriles.
b. Ensamble el manifold de filtracin al matraz de vaci y coloque el embudo
de filtracin.
c. Separe la parte superior del embudo y coloque la membrana de filtracin
con la cuadricula hacia arriba y centrndola en la superficie de filtracin.
d. Agregue 50 ml de agua destilada estril sobre la membrana de filtracin y
aada 1 ml de muestra.

e. Aplique vaci. A medida que el nivel del agua se aproxime al filtro, lave las
paredes del embudo con agua destilada estril. Permita que el vaci drene
completamente el agua del embudo.
f. Retire la parte superior del embudo con el vaci todava aplicado sobre la
membrana. Con las pinzas de diseccin retire la membrana y colquela sobre
una placa de mEndo Agar Less para coliformes totales. Rotule la caja petri con
1 ml, la fecha, sus iniciales y CT (coliformes totales).
g. Repita los incisos a) a f) pero ahora para coliformes fecales.
h. Repita los pasos de los incisos a) a f) con 10 ml para coliformes totales y
fecales y posteriormente con 100 ml para ambos grupos de bacterias.
i. Incube por 24 h a 37 oC las cajas petri con los ensayos de coliformes totales y
a 44.5 oC las coliformes fecales.
j. Las Unidades Formadoras de Colonia (UFC) de coliformes totales sern
cuantificadas enumerando aquellas colonias de color verde metlico. Mientras
que las UFC para coliformes fecales se cuantificaran enumerando las colonias
de color azul formadas sobre la membrana.
CALCULOS

UFC / 100 ml

UFC enumeradas
Volumen de muestra ensayado

NOTA:

* Muestras de agua potable/pozo limpias filtrar 1 ml, 10 ml y 100 ml

por duplicado
** Muestras de agua residual hacer diluciones de la muestra y filtrar 1
ml. Si la muestra de va a distribuir con varilla de vidrio, inocular .1 ml de
la dilucin.