Escuela de Tecnologa mdica

Tecnologa mdica

Informe laboratorio n 6-7

Estudio cintico de la -galactosidasa; Influencia del pH y la
temperatura en la reaccin enzimtica

Asignatura:
-

Mtodos de anlisis en
bioqumica

Integrantes:
-

Mara Aguilar
Ignacio Candia
Felipe Castillo
Marcela Castro
Vanesa Michaga

Docente:
-

TM Nilo Carvajal

Introduccin
Las enzimas son protenas de alto peso molecular con propiedades capaces
de cumplir funciones catalizadoras con el objetivo de acelerar reacciones en
el metabolismo del ser vivo. Son altamente especficas dado que poseen un
centro activo con los componentes responsables para cada catlisis. Por
esto, es fundamental estudiar el comportamiento de las enzimas a nivel del
organismo con el objetivo de comprender como este trabaja.
La cintica enzimtica es el mtodo ms antiguo para estudiar mecanismos
de reaccin enzimticos y consiste en la determinacin de la velocidad de la
reaccin y el modo en que sta cambia en respuesta a cambios en los
parmetros experimentales (Lehninger, 1223). Para que una reaccin se
lleve a cabo, se debe contar con sustrato, la enzima, un cofactor y la
formacin de producto.
Michaelis y Menten propusieron un modelo simple para explicar la mayora
de las reacciones catalizadas por enzimas. En este modelo la enzima se
combina reversiblemente con su sustrato para formar el complejo enzimasustrato (ES) que subsecuentemente se rompe para formar el producto,
hecho que regenera a la enzima.

Existen factores naturales que pueden alterar la velocidad de la reaccin

catalizada por la enzima, estos corresponden a; Temperatura, PH del medio,
presencia de inhibidores y la concentracin de sustrato. La modificacin que
realizan en la reaccin se relaciona considerando que la enzima es una
protena y tiene propiedades como tal, pudiendo llegar siempre a la
desnaturalizacin en condiciones no favorables.
En este laboratorio se presentar una demostracin experimental de las
alteraciones de la temperatura y pH en la actividad enzimtica utilizando la
enzima -galactosidasa proveniente de la bacteria E.coli K12. Esta enzima
se clasifica como hidrolasa y su sustrato natural es la lactosa, sin embargo,
se utilizar el O-nitrofenil--galactosido como sustrato (en presencia de
agua), con el objetivo de obtener como producto Galactosa y ortonitrofenol.

Procedimiento
Para el estudio cintico (laboratorio n6)
1. Se preparan un tubo de volumen final 10 mL con los siguientes
componentes.
Enzima B-galactosidasa
Buffer fosfato 0.06 M, pH 7,4

 Agua
2. Se prepara ONPG y una solucin blanco (sin sustrato) para uso
posterior.
3. Se pre incuba el tubo a 37C por 5 minutos.
4. Se prepara un set de 8 tubos con carbonato de sodio 0.2 M en
volumen final 2.5 ml, completando con agua destilada.
5. Se adiciona ONPG al tubo preincubado e inmediatamente se extraen
0.8 ml de este hacia el primer tubo del set con carbonato de sodio.
6. Luego de un minuto se adiciono 0.8 ml del incubado al siguiente tubo
del set hasta completar los 8 tubos.
7. Finalmente se midi la absorbancia el set de tubos a 405 nm.
Para la influencia del pH 8,5(laboratorio n7 parte 1)
1. Se preparan un tubo de volumen final 10 mL con los siguientes
componentes.
Enzima B-galactosidasa
Buffer fosfato 0.06 M, pH 8,5
Agua
2. Se prepara una solucin blanco (sin sustrato) y una solucin de ONPG
para uso posterior.
3. Se pre incuba el tubo a 37C por 5 minutos.
4. Se prepara un set de 8 tubos con carbonato de sodio 0.2 M en
volumen final 2.5 ml, completando con agua destilada.
5. Se adiciona ONPG 10 mM al tubo preincubado e inmediatamente se
extraen 0.8 ml de este hacia el primer tubo del set con carbonato de
sodio.
6. Luego de un minuto se adiciono 0.8 ml del incubado al siguiente tubo
del set hasta completar los 8 tubos.
7. Finalmente se midi la absorbancia el set de tubos a 405 nm.
Para la influencia de temperatura 56C (laboratorio n7- parte 2)
1. Se preparan un tubo de volumen final 10 mL con los siguientes
componentes.
Enzima B-galactosidasa
Buffer fosfato 0.06 M, pH 7,4
Agua
2. Se prepara ONPG y una solucin blanco (sin sustrato) para uso
posterior.
3. Se pre incuba el tubo a 56C por 5 minutos.
4. Se prepara un set de 8 tubos con carbonato de sodio 0.2 M en
volumen final 2.5 ml, completando con agua destilada.
5. Se adiciona ONPG al tubo preincubado e inmediatamente se extraen
0.8 ml de este hacia el primer tubo del set con carbonato de sodio.
6. Luego de un minuto se adiciono 0.8 ml del incubado al siguiente tubo
del set hasta completar los 8 tubos.
7. Finalmente se midi la absorbancia el set de tubos a 405 nm.

Resultados
LABORATORIO 6

Preparar buffer Fosfato de Sodio 0,06M, pH 7.4.

pH= pKa + log [B]
[A]

7,4= 6,82 + log [B]

3,8018[A] = [B]
[A]

0,58= log [B]

anti log
[A]
[A] + [B] =

0,06 M
[A] + 3,8018[A]=0,06
[A] (1 + 3,8018) = 0,06 M
0,0124 M

[A] = 0,06 M

[A] =

4,8018
[B] + 0,0124 M = 0,06 M
0,0476 M
[A] NaH2PO4

[B]= 0,06 0,0124

156,01

Mol

0,0124 M =

[B]=

156,01 g/mol 0,5 L

X= 0,9672 gr
[B] Na2HPO4

141,96

Mol

0,0476 M =

141,96 g/mol 0,5 L

X= 3,3786 gr
R// Para preparar un Buffer Fosfato de Sodio 0,06 M a pH 7,4 se necesitan
0,9672 gr de NaH2PO4 y 3,3786 gr de Na2HPO4 para luego ser aforado hasta
los 500 mL con agua destilada.

Preparar solucin de o-nitrofenol B galactsido (ONPG) a

10 mM.

1 mol
= 0.0025 mol
X

1000 mM
10 mM

0,01 M =

X
0,25 L

0,0025 mol 301,26 g/mol

0,753 gr

R// Para prepara la solucin de ONPG a 10 mM se necesitan 0,753 gramos y

luego aforar hasta los 250 mL.

Preparar solucin de Carbonato de Sodio (Na2CO3) al 0,2 M

0,2 M =

X
0,25 L

= 0,05 moles 105,98 = 5,299 gramos

R// Se necesitan 5,299 gramos de carbonato de sodio para tener una

molaridad de 0,2 M en 250 mL.
Tabla 1

7 Tubos
Blanco
Solucin
madre
Tubos

1
2
3
4
5
6
7

Carbona
to de
sodio
(ml)
1
2
x

Agua
destilada
(ml)

Sustrat
o ONPG
(ml)

0,7
1
2

x
x
4

Solucin madre (ml)

(INCUBADO a 37
C)
0,8
0,8
0,8
0,8
0,8
0,8
0,8

Enzima

galactosidasa
(L)
X
x
80

Buffer
(pH
7,4)
(ml)
x
2
4

Absorbancia
(415 nm)
1,9954
0
0
0
0
0
0

NOTA:
POR NO PRESENTAR ABSORBANCIAS EN LA MAYORIA LOS TUBOS,
DECIDIMOS CAMBIAR LAS PROPORCIONES DE ESTOS.
Tabla 2 (REPITICION DEL EXPERIMENTO)

8 Tubos
Tubos
Blanco
Solucin
madre
1
2
3
4
5
6
7
8

Carbona
Agua
to de
destilada
sodio
(ml)
(ml)
0,5
3,5
Solucin
madre
0,5
5
(ml) 5
x
(INCUBADO a 37
C)
0,8
0,8
0,8
0,8
0,8
0,8
0,8
0,8

Sustrat
o ONPG
(ml)

Enzima

galactosidasa
(L)
x
x
Absorbancia
x
10
(415 nm)
1,2
10

0,4558
0,8884
0,8566
1,0459
0,8868
0,8463
0,8331
0,8494

Buffer
(pH 7)
(ml)
X
3,8
3,8

Graficas

Curva de calibracin ONP

0.03
f(x) = 0.94x

0.02
0.02
Absorbancia 0.01
0.01
0
0

0.01

0.01

0.02

0.02

0.03

0.03

Concentracin ONP / mM

Tubos
1
2
3
4

Cal. Concentracin
Con ecuacin punto
pendiente
0,4558= 0,9403x
0,8884= 0,9403x
0,8566= 0,9403x
1,0459= 0,9403x

Concentracin
mM
0,4847
0,9448
0,9109
1,1123

5
6
7
8

0,8868=
0,8463=
0,8331=
0,8494=

0,9403x
0,9403x
0,9403x
0,9403x

0,9431
0,9000
0,8859
0,9033

Curva de Progreso B- Galactosidasa

1.2

f(x) = 0.16x
R = 0.83

1
0.8
Concentracin (uM) 0.6
0.4
0.2
0
0

Tiempo (minutos)

Al tiempo igual a 4 minutos la enzima alcanza su mayor capacidad

cataltica a pH 7.4 y 37C de temperatura, habiendo utilizado 0.01
mg de enzima.
LABORATORIO N 7: INFLUENCIA DEL PH SOBRE LA VELOCIDAD DE
LA REACCIN ENZIMATICA QUE CATALIZA LA B - GALACTOSIDASA

Preparar buffer Fosfato de Sodio 0,06M, pH 8.5.

pH= pKa + log [B]
[A]

8,5= 6,82 + log [B]

47,86[A] = [B]
[A]

1,68= log [B]

anti log
[A]
[A] + [B] =

0,06 M
[A] + 47,86[A]=0,06
[A] (1 + 47,86) = 0,06 M
1,2279 x 10-3 M

[A] = 0,06 M

[A] =

48,86
[B] + 1,2279 x 10-3 M= 0,06 M
[B]= 0,0587 M

[B]= 0,06 1,2279 x 10-3 M

[A] NaH2PO4

= 1,2279 x 10-3 M =

156,01 g

Mol

156,01 g/mol

0,25 L
X= 0,0478 gr
[B] Na2HPO4

141,96

0,0587 M =

Mol

141,96 g/mol 0,25 L

X= 2,0832 gr
R// Para preparar un Buffer Fosfato de Sodio 0,06 M a pH 8,5 se necesitan
0,0478 gr de NaH2PO4 y 2,0832 gr de Na2HPO4 para luego ser aforado hasta
los 250 mL con agua destilada.

Preparar solucin de o-nitrofenol B galactsido (ONPG) a

10 mM.
Preparar solucin de Carbonato de Sodio (Na2CO3) al 0,2 M

Tabla 3

8 Tubos
Blanco
Solucin
madre
Tubos
1
2
3
4
5
6
7
8
Graficas

Carbona
to de
sodio
(ml)
0,5
0,5
x

Agua
destilada
(ml)

Sustrat
o ONPG
(ml)

3,5
5
5

x
x
1,2

Solucin madre (ml)

(INCUBADO 37 C)
0,8
0,8
0,8
0,8
0,8
0,8
0,8
0,8

Enzima

galactosidasa
(L)
x
10
10

Absorbancia
(415 nm)
0,1740
0,3885
0,6121
0,7852
0,8824
0,2999
0,9056
0,8988

Buffer
(pH
8,5)
(ml)
X
3,8
3,8

Curva de calibracin ONP

0.03
f(x) = 0.94x

0.02
0.02
Absorbancia 0.01
0.01
0
0

0.01

0.01

0.02

0.02

0.03

0.03

Concentracin ONP/ mM

Tubos
1
2
3
4
5
6
7
8

Formula
0,1740=0,9403x
0,3885=0,9403x
0,6121=0,9403x
0,7852=0,9403x
0,8824=0,9403x
0,2999=0,9403x
0,9056=0,9403x
0,8988=0,9403x

Concentracin/ mM
0,1850
0,4131
0,6509
0,8350
0,9384
0,3189
0,9630
0,9558

Curva de progreso B-Galactosidasa con influencia de pH (8,5)

1.2
1

f(x) = 0.13x

0.8
Concentracin (uM) 0.6
0.4
0.2
0
0

Tiempo (minutos)

LABORATORIO N7 : INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA SOBRE LA

VELOCIDAD DE REACCION ENZIMATICA QUE CATALIZA LA B GALACTOSIDASA

Preparar buffer Fosfato de Sodio 0,06M, pH 7.4.

Preparar solucin de o-nitrofenol B galactsido (ONPG) a
10 mM.

Preparar solucin de Carbonato de Sodio (Na2CO3) al 0,2 M

Tabla 4

8 Tubos
Blanco
Solucin
Tubos
madre
1
2
3
4
5
6
7
8

Carbona
Agua
to de
destilada
sodio
(ml)
(ml)
0,5
3,5
0,5
5
xSolucin madre
5 (ml)
(INCUBADO 56 C)
0,8
0,8
0,8
0,8
0,8
0,8
0,8
0,8

Sustrat
o ONPG
(ml)

Enzima

galactosidasa
(L)
x
x
x
10
1,2
10
Absorbancia
(415 nm)
0,0043
0,0026
0,0034
0,0028
0,0030
0,0021
0,0003
0,0001

Graficas

Curva de calibracin ONP

0.03
f(x) = 0.94x

0.02
0.02
Absorbancia 0.01
0.01
0
0

0.01

0.01

0.02

0.02

0.03

0.03

Concentracin / mM

Tubos
1
2
3
4
5
6
7
8

Formula
0,0043=0,9403x
0,0026=0,9403x
0,0034=0,9403x
0,0028=0,9403x
0,0030=0,9403x
0,0021=0,9403x
0,0003=0,9403x
0,0001=0,9403x

Concentracin mM
4,5730 x 10-3
2,7650 x 10-3
3,615 x 10-3
2,977 x 10-3
3,1904 x 10-3
2,2333 x 10-3
3,1904 x 10-4
1,0634 x 10-4

Buffer
(pH
7,4)
(ml)
X
3,8
3,8

Curva de progreso B-Galactosidasa con influencia de Temperatura (56C)

0.01
0
0
Concentracin (uM)

f(x) = 0x

0
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Tiempo (minutos)

Discusin
En el laboratorio n6 se analiz la curva de progreso de la hidrolisis de ONPG
por la accin de la enzima B-galactosidasa (37C y PH 7.4), llegando al
resultado de que al transcurrir 4 minutos se alcanza la mxima actividad
cataltica de esta, habiendo utilizado 0.01 mg de enzima. Cabe recalcar que
las concentraciones de ONP fueron calculadas utilizando la curva de
calibracin a 405 nm en la experiencia prctica n3 de Laboratorio. Se
aprecia una curva hiperblica, la cual llegado el mximo punto de
concentracin desciende y comienza a tomar la forma de una constante
(Punto que indica la velocidad mxima). Esto puede deberse a razones
como: La creciente densidad de producto puede inhibir la actividad de la
enzima, el grado de saturacin de la enzima con sustrato disminuye por el
agotamiento del mismo a medida que progresa la reaccin o la reaccin
inversa se hace ms importante al aumentar la concentracin del producto.
En el laboratorio n7 se pone a prueba la actividad catalizadora de la
enzima frente a cambios de temperatura y grado de acidez. Utilizando un
pH de 8.5 se observa una curva de progreso regular, hiperblica,
alcanzando una actividad cataltica mxima a los 7 minutos. Puede
observarse que al minuto 6, la concentracin disminuye considerablemente,
esto se considera un error analtico que puede haber sido provocado por
haber agregado de manera inadecuada la alcuota de 0.8 ml al tubo n6 o
fuera del tiempo correspondiente. Sin embargo, analizando la curva puede
observarse un avance de la reaccin ms estable que a pH=7.4 retardando
el decaimiento de la actividad enzimtica, lo cual puede ser til para
prximas actividades prcticas en donde se requiera un tiempo de accin
mayor a 4 minutos. Esto puede deberse a que a pH 8.5 la enzima posee (por
arreglo espacial de grupos ionizados de la protena) un sitio activo distinto al
que contiene a pH 7.4, generando un lapso de tiempo entre uno y otra
molcula de sustrato, retardando la saturacin por sustrato o producto,

como ocurre en el pH ms acido. Finalmente, la actividad enzimtica en

relacin a una temperatura de 56C se puede concluir a travs de la curva
de progreso, que la accin enzimtica fue muy irregular o casi nula. En
general, los aumentos de temperatura aceleran las reacciones qumicas: por
cada 10C de incremento, la velocidad de reaccin se duplica. Las
reacciones catalizadas por enzimas siguen esta ley general. Sin embargo, al
ser protenas, a partir de cierta temperatura, se empiezan a desnaturalizar
por el calor. En este paso practico, se incub a 56C, casi 20 grados por
encima de la temperatura de la actividad N6. En general se considera que
llegando a los 50C las enzimas se desnaturalizan, perdiendo su actividad
cataltica. Se cree pertinente en otra actividad analizar el comportamiento
de la B-galactosidasa a 47C para observar si es que hay una duplicacin de
la velocidad de reaccin o si existiese algn impedimento para ello y su
posterior estudio.
Conclusin
En este procedimiento se actu con la enzima en su anlisis sobre los
cambios de regulacin de su actividad enzimtica en donde se puede
agregar que las enzimas son catalizadores de naturaleza proteica, el cual
realiza actividades celulares, donde tiene la capacidad de acelerar las
reacciones qumicas, sin alterarse en presencia de la reaccin y acta en un
solo tipo de reaccin, ya que estos son catalizadores que funcionan en una
concentracin molar menor a la del reactivo, en donde una molcula
enzimtica generalmente cataliza la conversin de 10 a 1000 molculas de
sustrato, provocando que su velocidad de reaccin sea mayor. A su vez se
desnaturalizan por calor al igual que las protenas, tambin se precipitan en
presencia de etanol o aumento concentracin de sales orgnicas. Ya que
para que una enzima acelere su reaccin, llevarla a rebajar el nivel de
energa de activacin necesaria para que tenga lugar una reaccin qumica,
la energa de activacin es la cantidad de energa necesaria para inducir en
una sustancia un estado de reactividad, la que se combina con la sustancia
S inducindole una situacin transitoria que requiere una menor energa de
activacin, para que tenga lugar la reaccin.
Para esto como se dijo anteriormente para una reaccin de la actividad
enzimtica, una molcula de enzima no tiene por qu actuar a la misma
velocidad, donde su actividad puede variar despendiendo del estado como
PH, temperatura, presencia de cofactores, concentracin de sustrato,
presencia de inhibidores o isoenzimas.
Lo que lleva a este estudio donde se utiliz la enzima -galactosidasa
proveniente de la bacteria E.coli K12, la cual se utiliz O-nitrofenil-galactosido como sustrato, la cual paso a hacer distintos procedimientos,
eso s utilizando la misma enzima y los dems componentes o soluciones
como el carbonato de sodio y el O-nitrofenil--galactosido, la cual se utiliz
una solucin madre y 8 tubos para cada laboratorio y as obtener la
colorancia esperada para cada procedimiento, donde solo se produjo
cambios tanto en su pH y temperatura, a partir de esto representamos el

primer laboratorio n6 como muestra estndar para la comparacin con los

siguientes laboratorios el cual tendrn cambios de temperatura y pH, donde
obtuvimos una alteracin donde no se encontr absorbancias y se volvi a
cambiar la proporcin de estos, la repeticin con un pH estable de 7,4 y una
Temperatura de 37C, mostro que la solucin madre mantuvo valores de
absorbancia en los tubos (ver anexo1) con una constante y en forma
gradiente tanto su concentracin con su absorbancia en donde los
parmetros para formar la curva de calibracin fue proporcional a la
preparacin de sus soluciones.
En tanto en el laboratorio n7 se procur actuar con el cambio de pH sobre
la velocidad de reaccin enzimtica de la -galactosidasa, donde se prepar
un pH de 8,5, el cual fue mayor al primer procedimiento, la cual se aadi
las mismas soluciones anteriores como en el carbonato de sodio y el Onitrofenol. Despus al obtener ya solucin madre tras su incubacin a 37C,
la incorporacin de los tubos de la solucin madre, mostro absorbancias
(ver anexo2) que fueron menor a las del laboratorio n6, donde su curva
de calibracin o la pendiente fue menor a la anterior, no obstante, las
concentraciones se mantuvieron similares entre ellas.

Por ultimo en el laboratorio n7 parte 2 se utiliz el cambio de temperatura

sobre la velocidad de reaccin enzimtica de -galactosidasa, lo cual se
formul una temperatura a 56C para la incubacin de la solucin madre,
pero usando los mismas concentraciones de las soluciones utilizadas y a su
vez con un pH a 7,4. Esto formo una absorbancia menor a la de los
anteriores laboratorios (ver anexo3), ya que la temperatura afecto a la
actividad de la enzima e hizo que su actividad decayera transcurrido el
tiempo, lo que llev a que las concentraciones del producto fueran mnimas
y descendentes.

Anexo
N1)

Se muestra la colorancia del laboratorio n6 de pH 7,4 y

temperatura a 37C, concentracin de carbonato de sodio a 0,2 M y ONPG
de 10mM

N2)

Se muestra la colorancia del laboratorio n7 de pH 8,5 y

temperatura a 37C, concentracin de carbonato de sodio a 0,2 M y ONPG
de 10mM

N3)

Se muestra la colorancia del laboratorio n7 parte 2 de pH 7,4 y

temperatura a 56C, concentracin de carbonato de sodio a 0,2 M y ONPG.