1.1.3.5.

Cromatografia
La cromatografa puede definirse como una tcnica que separa una mezcla de
solutos basada en la velocidad de desplazamiento diferencial de los mismos que se
establece al ser arrastrados por una fase mvil (lquida o gaseosa) a travs de un
lecho cromatogrfico que contiene la fase estacionaria, la cual puede ser lquida o
slida. Las propiedades de los componentes de una mezcla determinan su movilidad
entre s y con respecto a la fase mvil. La base de la separacin cromatogrfica ser,
por tanto, la diferencia en la migracin de los mismos.
1.1.3.5.1. Notas Histricas
El botnico ruso Mijail Tswett estableci las ventajas de la tcnica,
adopto la terminologa y defini los procedimientos experimentales
bsicos para esta tcnica, se considera que es el Padre de la
Cromatografa. En los aos 30 y 40 empez su desarrollo y aplicacin
en diferentes procedimientos de experimentacin.
1.1.3.5.2. Principios
La palabra Cromatografa significa EscribirenColores, porque cuando fue
desarrollada los componentes separados eran colorantes. Se define como una
tcnica o mtodo fsico de separacin basado en las diferentes velocidades con que
se mueven los solutos disueltos en un disolvente llamado eluente (fase mvil) a
travs de un medio estacionario o fijo. Los componentes a separar se distribuyen
entre la fase estacionaria y la fase mvil o fluido que pasa a travs o a lo largo de la
fase estacionaria. Como los componentes de la mezcla presentan diferente
tendencia a permanecer en cualquiera de las fases, la separacin se da por el
movimiento de la fase mvil en relacin con la estacionaria y de la distribucin de
las sustancias entre las dos fases. Las molculas que "prefieren disolverse" en la fase
mvil sern eludas ms rpido que las que son preferencialmente solubles en la fase
estacionaria y que tienden a quedar retenidas. En resumen se fundamenta en la
separacin entre la fase estacionaria slida o liquida y la fase mvil liquida o
gaseosa
Los fenmenos rectores del proceso de retencin y separacin son la adsorcin y
la absorcin. El primero queda delimitado a la superficie interfacial es decir se
refiere a la fijacin o retencin de la sustancia entre la superficie de las dos fases; se
relaciona con fuerzas qumicas y fsicas que dependen de la naturaleza de la
sustancia absorbida, temperatura, naturaleza del absorbente y concentracin. El
segundo fenmeno determina la retencin de una especie qumica por parte de una
masa y depende de la tendencia que tiene sta a formar mezcla o reaccionar
qumicamente con la misma.

1.1.3.5.3. Clasificacin de la Cromatografa

Existen muchas maneras de clasificar los mtodos cromatogrficos, segn su fase
mvil se clasifica en Cromatografa de gases que puede ser a travs de dos
sistemas, gas- lquido y gas-slido y Cromatografa lquida donde el eluente es un
lquido y puede ser lquido-liquido, liquido-slido. Por el mecanismo de retencinseparacin, es decir el tipo de equilibrio implicado en la transferencia de los solutos
entre las fases se encuentra la Cromatografa de reparto, de adsorcin y de
exclusin. Segn la forma de contacto entre las fases se denomina de columna o
superficie plana. Tambin se puede clasificar teniendo en cuenta la fase
estacionaria, la dimensionalidad, escala fsica y gradientes.

Tcnicas cromatogrficas
Segn el dispositivo utilizado para conseguir el contacto entre la fase mvil y la
estacionaria, se distinguen dos tcnicas:

Columna

Se usa un tubo cilndrico

Plana: El soporte es una placa

plana o los intersticios de un
papel

Capa fina
Papel (particin)

3.1 Cromatografa en capa fina.

Por este mtodo se pueden analizar mezclas de aminocidos. La muestra para
anlisis se aplica por medio de un tubo capilar en la superficie de una capa fina
adsorbente en forma de banda, punto o mancha y es adsorbida en la superficie por la
accin de fuerzas electrostticas (Fuerzas de Van der. Waals, puentes de hidrogeno,
efectos inductivos, etc). Los adsorbentes ms utilizados son gel de silica, alumina,
tierra silcea, celulosa y poliamidas. Como soportes del adsorbente se utilizan
laminas o placas de vidrio, plsticas o metlicas, algunas placas tienen indicador de
fluorescencia : f254 f366.
La placa seca se coloca en el tanque cromatogrfico o cmara, en el cual debe

encontrarse saturado el eluente (Fase Mvil lquida).El eluente ascender o

desplazara por capilaridad en la placa y arrastrar los componentes a lo largo de
sta produciendo manchas que representan a los componentes, la separacin se
da por migracin diferencial, es decir que la fase mvil arrastra a las substancias
apolares y aquellas ms polares son retenidas por la fase estacionaria dando lugar a
la separacin. Posteriormente se evapora el eluente y la placa se analiza por medio
de mtodos qumicos en el que por inmersin o rociado se obtienen derivados
coloreados o fluorescentes (Adicin de Ninhidrina a aminas, cido sulfrico para
carbonizar compuestos orgnicos, etc), o por medio de mtodos fsicos pticos
utilizando radiacin UV o luz visible.
El anlisis es de tipo cualitativo, semicuantitativo o cuantitativo. En el primero
se hacen comparaciones visuales de color e intensidad y propiedades UV entre
otras. En el semicuantitativo se observa dimetro y comparacin visual e intensidad
del color de la mancha contra manchas patrones de concentracin conocida. Y en la
forma cuantitativa se pueden realizar medidas de transmisin a travs de la
sustancia y medidas de emisin o medida de luz reflejada desde la sustancia, y
espectrofotometra por fluorescencia.
1.1.3.5.3.2 Cromatografa en papel.
El proceso es bsicamente el mismo, solo que
se usan tiras de papel cromatogrfico en el
tanque cromatogrfico.
1.1.3.5.3.3. Cromatografa en Columna.
Se utilizan columnas de vidrio rellenas de
Almina (Al2O3), Slica u Oxido de Magnesio. La
fase estacionaria esta constituida por un slido
poroso, el cual queda soportado en el interior de
una columna generalmente fabricada en plstico o
vidrio. La fase mvil se encuentra formada por la
solucin que lentamente va atravesando la fase
estacionaria. La solucin que sale al final de la
columna se reemplaza constantemente por nueva
solucin que se suministra desde un contenedor
por la parte superior de la columna.
La migracin de las sustancias de la mezcla a travs de la columna se encuentra
retardada en diferente grado por las interacciones diferenciales que cada una de
ellas pueda ejercer con la fase estacionaria. Las sustancias se separan gradualmente
formando bandas dentro de la banda total, la separacin, y por tanto la resolucin,
aumenta con la longitud de la columna. La banda individual de cada sustancia
puede ensancharse con el tiempo debido a procesos difusinales, disminuyendo por
tanto la resolucin.

1.1.3.5.3.4. Cromatografa de gases.

Se utiliza para la separacin de sustancias gaseosas. La Fase Mvil es un Gas
(llamado Gas Portador) y la Fase Estacionaria puede ser un slido (Cromatografa
Gas-Slido) o una Pelcula de lquido de alto punto de ebullicin (Generalmente
Polietiln-Glicol o Silicn) recubriendo un slido inerte (Cromatografa Gas-Lquido).
El cromatgrafo de gases esta constituido normalmente por un suministro y una
entrada del gas portador, un puerto de inyeccin, una columna normalmente
localizada en el interior de una cmara termostatizada (horno), un detector y un
sistema computarizado para analizar, registrar e imprimir el cromatgrama.
La muestra se introduce a travs del sistema de inyeccin dentro de la columna
que es el sitio donde ocurre la separacin. La columna de aluminio, acero
inoxidable, vidrio o tefln contiene la fase estacionaria slida o lquida y esta
sujeta a la superficie por un soporte que es generalmente de slice. La fase mvil o
gas portador transporta los componentes de la muestra a travs de la columna, por
esta razn debe ser inerte para evitar interacciones con la muestra o la fase
estacionaria, y ser capaz de minimizar la difusin gaseosa. Al final de la columna
existe el detector que permite la deteccin y cuantificacin de las sustancias,
midiendo conductividad trmica y electronegatividad de las sustancias eludas. Se
produce una seal tipo elctrico, que posteriormente se amplifica por un registrador
grafico o un integrador permitiendo indicar el momento en que salen de la columna
los componentes. La salida de la sustancia se registra en un cromatgrama en
forma de picos y se determinan medidas como la altura
y el rea del pico.
1.1.3.5.3.5.Cromatografa Liquida de alta eficiencia o
rendimiento (HPLC).
Es una Cromatografa de alta presin es decir se
aplica el flujo a presin (entre 1500 a 2200 psi). El
tamao de partcula es entre 3 y 10 micras, la longitud
de la columna es entre 5 y 25 cm. y requiere de equipo
sofisticado. Se pueden analizar muestras proteicas. La
reduccin del tiempo en que la sustancia se encuentra

en el interior de la columna, limita el ensanchamiento por difusin de las bandas,

aumentando por tanto la resolucin.
El sistema HPLC requiere una mezcladora de solventes, un inyector, y una bomba
que inyecte el lquido a la columna. Generalmente las columnas de slica requieren
alta presin para que el flujo de lquido sea adecuado, la mezcladora se requiere
para variar la proporcin de solvente en la fase mvil y el inyector permite la
aplicacin de la muestra. A la salida de la columna se coloca un detector
generalmente de absorcin ultravioleta o de fluorescencia y si se desea recuperar
las molculas que eluyen de la columna, se requiere un colector.
En los sistemas modernos el anlisis de la informacin obtenida se realizan
mediante una computadora acoplada al equipo; lo que permite estandarizar la
cromatografa, identificar la naturaleza los picos eludos y cuantificar su contenido.
Los picos se relacionan segn su "tiempo de retencin" con estndares, que
permiten identificar los aminocidos presentes en la mezcla. La cantidad relativa de
cada uno de ellos se determina calculando el
rea la curva del pico correspondiente.
1.1.3.5.3.6. Cromatografa de intercambio
inico.
La Fase Estacionaria es una resina de
intercambio inico que contiene grupos
cargados, teniendo la propiedad de separar
especies ionizadas (Cationes o Aniones); la Fase
Mvil es generalmente una solucin
amortiguadora de pH. En protenas la
cromatografa de intercambio inico se basa en
las diferencias en signo y magnitud de la carga
elctrica neta de las protenas a un valor de pH
determinado. La afinidad de cada protena a los
grupos cargados de la columna esta influenciada
por el pH y por la concentracin de iones en
solucin (concentracin salina) que compiten
con la protena en la interaccin con la matriz. La separacin de la protena de la
matriz cargada puede obtenerse gradualmente cambiando el pH y/o la
concentracin salina de la fase mvil, de tal forma que se genere un gradiente de
concentracin.

1.1.3.5.3.7.
Cromatografa por
Permeabilidad en Gel.
Es til para la
separacin de
protenas. La
Cromatografa de
exclusin molecular,
tambin llamada de
filtracin en gel,
separa en funcin de
su tamao. La matriz
de la columna esta
formada por un
polmero
entrecruzado con
poros de tamaos determinados. Las protenas de mayor tamao migran ms
deprisa a lo largo de la columna que las de pequeo tamao, debido a que son
demasiado grandes para introducirse en los poros de las bolas de polmero y por
tanto siguen una ruta ms corta y directa a lo largo de la longitud de la columna.
Las protenas de menor tamao, entran en los poros y su marcha a lo largo de la
columna es ms lenta.
1.1.3.5.3.8. Cromatografa de Afinidad.
La Cromatografa de Afinidad permite la
separacin de mezclas proteicas por su afinidad o
capacidad de unin a un determinado ligando. En
este caso, las protenas que se retienen en la
columna son aquellas que se unen especficamente a
un ligando que previamente se ha unido
covalentemente a la matriz de la columna. Despus
de que las protenas que no se unen al ligando son
lavadas o eluidas a travs de la columna, la protena de inters que ha quedado
retenida en la columna se eluye o libera mediante el empleo de una solucin que
contiene bien ligando libre u otro compuesto que rompa la interaccin entre el
ligando y la protena.

Tipos de cromatografa
Naturaleza de fase
estacionaria
Naturaleza de
fase
estacionaria

Slido

Adsorcin
Exclusin
Cambio inico
Afinidad

Naturaleza de
fase mvil

Lquido

Particin

Liquido

Lquido-lquido
((particin)
Lquido-slido)adsorcin,
cambio inico, exclusin,
Afinidad.

Gas

Gas-lquido (CGL)
Gas-slido (CGS)

Cromatografa de afinidad
Se trata de un tipo especial de cromatografa de adsorcin slido-lquido en la
que la sustancia de naturaleza bioqumica (anticuerpos, cofactores, inhibidores
enzimticos, lectinas y otras molculas) denominadas ligandos de afinidad y
enlazados qumicamente en soportes slidos adecuados, retienen a los solutos
(analitos), tambin de naturaleza bioqumica, de manera reversible y selectiva. Las
separaciones se basan en el acoplamiento llave-cerradura tpico de la biologa
molecular.

Fundamento de la cromatografa de afinidad

En la figura se muestra de forma esquemtica el fundamento de las
separaciones mediante cromatografa de afinidad. Un volumen no excesivamente
grande de muestra de naturaleza biolgica se introduce en la columna que
contienen un soporte polimrico inerte que retienen a la sustancia activa enlazado
covalentemente y que se denomina ligando de afinidad. Slo existe interaccin
especfica entre este ligando y un soluto-analito (protena) de la muestra insertada
que queda retenido (adsorbido). Se procede a la elucin de los dems componentes
de la muestra mediante una primera fase mvil que no influye en el acoplamiento. A
continuacin se introduce una nueva fase movil que desactiva el acoplamiento por
alteracin reversible de los sitios activos del inhibidor-ligando, del soluto (protena)
o de ambos; generalmente se utiliza un cambio de pH que modifica las
caractersticas de los sitios activos; se eluye as el soluto de inters. Una vez
finalizada la separacin, se procede a la regeneracin de la columna, lo que
generalmente se hace mediante el empleo de la primera fase mvil y constituye una
etapa rpida.
La cromatografa de afinidad tiene una serie de caractersticas generales que la

distinguen de otros tipos de cromatografa lquidas

Alta selectividad en el mecanismo de retencin

Campo de aplicacin restringido
Separacin de un solo soluto analito
Empleo de sistema de baja presin
Columnas cortas de escasa eficacia cromatogrfica

Ligandos de afinidad
Son las molculas bioqumicas que se encuentran ancladas qumicamente
sobre el soporte slido inerte, y son las responsables de la adsorcin especfica de
los solutos-analitos. Pueden considerarse dos clasificaciones de los mismos: Segn
su naturaleza, pueden ser macromolculas biolgicas o bien moleculas de bajo peso
molecular de biomolculas pequeas o macromolculas bioqumicas,
respectivamente. Y segn su actuacin. Que se fundamenta en la selectividad en la
retencin que condiciona las caractersticas de la cromatografa de afinidad; se

distinguen dos grandes grupos: Ligandos especficos , como los anticuerpos , que se
enlazan reversiblemente a un solo soluto, y los ligandos generales enlazados con un
determinado grupo de compuestos bioqumicos, como las lectinas y nucletidos.

Esquema de un cromatograma de afinidad.

Soportes
El material sobre cuya superficie activada se establece el enlace covalente con
el ligando de afinidad. Debe poseer propiedades como tener una gran superficie,
tamao del grano controlable, porosidad controlable, carcter suficientemente
hidroflico para evitar adsorciones no especficas de protenas u otras molculas,
estabilidad mecnica, en especial para trabajar a alta presin.
El material utilizado generalmente para el soporte son geles orgnicos
derivados de los polisacridos como la agarosa (sepharosa), polmeros de acrilamida,
fractogel TSK y slices CPG.
Inmovilizacin de ligandos
La inmovilizacin de los ligandos de afinidad es un proceso complejo que en
cada caso tiene connotaciones especficas.
El general, los ligandos de afinidad se inmovilizan mediante el establecimiento
de enlaces qumicos covalente con el soporte slido activado y un grupo reactivo del
ligando que est lo ms lejos posible de la zona activa de bioadsorcin.
El objetivo de la inmovilizacin consiste en obtener una capa estable y densa
del ligando bioqumico que conserve su actividad especfica con plenitud.
La inmovizacin del ligando de afinidad se realiza en general mediante dos
etapas secuenciales:

- Activacin del soporte, que consiste en el ataque qumico con diferentes reactivos
de la superficie de los soportes antes mencionados, que se caracterizan por poseer
grupos hidroxilos superficiales. De la gran variedad de procedimientos el ms
comn es el ataque con bromuro de ciangeno sobre la matriz de polisacrido.
Segn el pito de matriz se originan grupos diferentes: steres cianato en agarosa e
imidocarbonatos en dextranos, segn reacciones uno o dos grupos hidroxilos de la
matriz. Esta etapa produce en un disolvente orgnico o en mezclas con agua. Luego
sigue el anclaje qumico del ligando que se da mediante la reaccin de grupos amino
del mismo, fundamentalmente con el soporte activado.
Metodos de elucin
Segn la naturaleza de los ligandos de afinidad y la de los solutos-analitos, y
teniendo en cuanta la forma de eliminar los solutos de la columna, cave distinguir
los procedimientos generales de elucin como:
Elucin bioespecfica: La fase mvil desplazante contiene a un modificador
(generalmente llamado inhibidor) que en realidad se trata de un ligando de afinidad
no ligado de bajo peso molecular que interacciona con el sitio activo de la
macromolcula biolgica que puede ser soluto-analito o bien el ligando de afinidad
para solutos de bajo peso molecular, producindose en todos los casos una elucin
por desplazamiento o competencia entre los componentes de bajo peso molecular
ligados o no, con el sitio activo de la macromolcula biolgica ligada o libre. Se
distinguen 2 tipos de elucin bioespecfica la normal y la invertida.
La elucin normal se basa en la interaccin inhibidor-analito, que es la
situacin ms frecuente. El analito es una biosustancia macromolecular que es
retenida por un ligando de afinidad de bajo peso molecular, y eluida con un
inhibidor que es tambin de bajo peso molecular y que tiene preferencia por el sitio
activo del analito, por lo que es retirada del slido y eluida. Ejemplo, la purificacin
de la lectina.
La elucin invertida, se basa en la interaccin inhibidor-ligando de afinidad. El
cual es una biomacromolcula que retienen especficamente el analito. La presencia
del inhibidor en la fase mvil provoca un desplazamiento anlogo al anterior y se
eluye el analito. Se usa lectina para purificar glucoprotena.
En la elucin no bioespecfica, la fase mvil provoca la denaturacin del
ligando inmovilizado, del soluto-analito o de ambos mediante el cambio suave y
reversible de los correspondientes sitios activo, de tal manera que se interrumpe la
adsorcin bioespecfica mediante eliminacin de una o varias de las causas que la
provocan.
NOMENCLATURA IUPAC PARA CROMATOGRAFIA
TERMINO
Cromatografa. La cromatografa es un mtodo fsico de separacin en el que los
componentes a separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales est en
reposo (fase estacionaria) mientras que la otra (fase mvil) se mueve en una

direccin definida.
Cromatgrafo. El instrumento empleado para realizar una separacin
cromatogrfica.
Cromatgrama. Una grfica u otro tipo de presentacin de la respuesta de un
detector, la concentracin de un analito en el efluente u otra magnitud usada como
medida de la concentracin en el efluente, frente al volumen de efluente o al
tiempo. En la cromatografa plana, "cromatgrama" puede referirse al papel o capa
con las zonas separadas.
Fase Ligada. Una fase estacionaria que est unida de forma covalente a las
partculas de soporte o a la pared interior de la columna.
Fase Inmovilizada. Una fase estacionaria que est inmovilizada sobre las partculas
del soporte o sobre la pared interior de la columna, por ejemplo por polimerizacin
in situ (entrecruzamiento qumico) tras un recubrimiento.
Fase Mvil. Fluido que se filtra a travs o a lo largo del lecho estacionario, en una
direccin definida. Puede ser un lquido (Cromatografa Lquida), un gas
(Cromatografa de Gases) o un fluido supercrtico (Cromatografa con Fluido
Supercrtico). En la cromatografa de gases se uede usar la expresin Gas Portador
para la fase mvil. En la cromatografa de elucin se usa tambin para la fase mvil
la expresin Eluyente.
Eluir. Aplicar la cromatografa de elucin. El proceso de elucin se puede detener
mientras todos los componentes de la muestra estn an en el lecho
cromatogrfico, o continuarse hasta que lo hayan abandonado. Nota: Se prefiere el
trmino "Eluir" a "Desarrollar", trmino usado en nomenclaturas anteriores de
cromatografa plana.
Efluente. La fase mvil que abandona la columna.
Muestra. Mezcla consistente en cierto nmero de componentes, cuya separacin se
pretende en el lecho cromatogrfico al ser arrastrados o eluidos por la fase mvil.
Componentes de la Muestra. Los constituyentes qumicamente puros de la muestra.
Pueden no ser retenidos por la fase estacionaria (es decir, no retardados), retenidos
parcialmente (es decir, eluidos a tiempos diferentes) o retenidos permanentemente.
Se aceptan tambin los trminos Eluito y Analito para un componente de la muestra
Mtodos principales
Cromatografa Frontal: Procedimiento en el que la muestra (lquida o gaseosa) se
alimenta de forma continua al lecho cromatogrfico. No se utiliza ninguna fase
mvil adicional
Cromatografa de Desplazamiento: Procedimiento en el cual la fase mvil contiene
un compuesto (el desplazarte) que es retenido ms fuertemente que los
componentes de la muestra analizada. La muestra se alimenta al sistema en forma
discreta, como una pequea cantidad en un intervalo breve.
Cromatografa de Elusin: Procedimiento en el que la fase mvil se pasa de forma
continua a travs o a lo largo del lecho cromatogrfico y la muestra se suministra al
sistema de forma discreta, como una pequea cantidad en un tiempo breve.

Clasificacin de acuerdo al lecho cromatografico

Cromatografa en Columna: Tcnica de separacin en la que el lecho estacionario
est contenido dentro de un tubo. Las partculas de fase estacionaria slida, o de
soporte recubierto con una fase estacionaria lquida, pueden llenar por completo el
tubo (Columna Empaquetada) o estar concentradas sobre o a lo largo de su pared
interna, dejando una ruta abierta, no restringida, para el paso de la fase mvil por el
centro del tubo (Columna Tubular Abierta).
Cromatografa plana: Tcnica de separacin en la que la fase estacionaria est en
forma de plano o sobre un plano. ste puede ser un papel, que sirva como tal o que
est impregnado con una sustancia que acte de fase estacionaria (Cromatografa en
Papel), o una capa de partculas slidas extendida sobre un soporte, tal como una
placa de vidrio (Cromatografa en Capa Fina, TLC). A veces a la cromatografa plana
se la llama tambin Cromatografa de Lecho Abierto.

Literatura recomendada

Valcarcel, M. 1988. Tcnicas analticas de separacin. Editorial Revert. Espaa. pp 335-336, 597-613.
Lawrence, A., Kaplan, y Pesce, J. 1986. Quimica clinica: Tcnicas de laboratorio, fisiopatologia, mtodos de
anlisis. Teora, anlisis y correlacion. Editorial Medica Panamericana. Junin, Buenos Aires. 1739 p.
http://www.utoronto.ca/krause/affinity.html (protocolo)
http://www.sdk.co.jp/shodex/english/dc010801.htm ( columnas)
http://ull.chemistry.uakron.edu/chemsep/affinity (generalidades)
Murray p. Deutscher. 1990. Methods in enzymology volume 182, Guide To protein Purification. Academic Press.
Inc. San Diego California, United States of America. 309-380
Lehninger Principles of Biochemistry. (3 Ed.). D.L. Nelson and M.M. Cox. Worth Pub.. New York. (2000). Edicin
en castellano. Principios de Bioqumica. (2002).
C.K. Mathews, K.E. van Holde, K.G. Arhen. Prentice Hall, Pearson. Bioqumica. (3 Ed.). Educacion, Madrid.
(2002).
Ruben Dario Cortez. Tcnicas de separacin, cromatografa. [En lnea] Seccin de La Red Latinoamericana de
Qumica. Barquisimeto Lara 301. Ultima versin 21 de enero de
1.998.<http://www.relaq.mx/RLQ/tutoriales/cromatografia/hplc.>[Consulta: 9 agosto.2003
Linda Amrica Serrano Falcon. Apuntes qumica cromatografa [En lnea] Sitio de estudiantes y docentes
universitarios Copyright 1999-2001 <http://www.lafacu.com/apuntes/quimica/cromatografia/default/.htm.>
[Consulta: 9 agosto.2003
Victoria Kennedy. RN, A,D.AM editorial. Definicin de cromatografa [En lnea] Actualizado 13 agosto 3003.
.>[Consulta: 14 agosto.2003
<http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/arrticle/002325.htm>
<http://www.ub.es/biodel/wbc/tecnicas/cromatografia.htm>
Servicios tcnicos de Investigacin. Cromatografa de alto rendimiento. [En lnea] Universidad de Alicante.
Ultima actualizacin 1 oct 1996 <http://www.ua.es/es/investigacin/sti/cliq.htm .>[Consulta: 9 agosto.2003

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