TOXICOLOGA

TEMA 16,17,18,19

Tema 16, 17, 18 & 19.TCNICAS DE EXTRACCIN

PARA EL ANLISIS TOXICOLGICO.
I-

INTRODUCCIN:
Tcnicas utilizadas en el anlisis toxicolgico:

II-

TCNICAS COLORIMTRICAS:

Aplicacin directa sobre la muestra (rpidas).

Bastante sensibles.
Se emplean en un primer momento del anlisis.
Problema: Inespecficas (Qu fenotiacina?).
Porque nos va a decir el grupo al que
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pertenecen, pero no me dir cul es la sustancia

en especial.
Intensidad de color proporcional.
A veces nos informa de lo que no tiene la
muestra.
Sencillas.
No instrumental.
Muy sensibles.
Rpidas.

Inconvenientes:
- Poco especficas.
- Cara.

III-

TCNICAS ESPECTROFOTOMTRICAS:

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Se basan en la capacidad que tienen los tomos y

molculas de absorber radiacin a diferentes
longitudes de onda.
La LEY DE LAMBERT BEER, nos permitir valorar la
densidad ptica.

R debe ser siempre 0,995.

Excepto la absorcin atmica e ICP, que se usan para
metales, el resto todas se utilizan para compuestos
orgnicos.
A. Espectrofotometra UV-Visible:

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En medio acido la longitud de onda es 279 nm,

mientras que en el medio alcalino es 299 nm.

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A veces, nos puede generar una duda, porque los

espectros se parecen. Entonces hacemos las
derivadas y salimos de dudas.
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B. Espectrofluorimetra:
La fluorescencia es el proceso de emisin de luz
que acompaa a la transicin espontnea de una
molcula o tomo desde el estado excitado al de
menor energa. Si la emisin es:
Tipos de ensayos:
- Medida de la fluorescencia nativa.
- Induccin qumica de la fluorescencia (la ms
usada).
- Inhibicin de la fluorescencia (uso ms limitado).
Ventajas:
- Sensibilidad.
- Especificidad:
Mximo de absorcin.
Emisin de fluorescencia.
Inconvenientes:
- Solo aplicables a sustancias fluorescentes.

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- No mezclas: se suele utilizar acoplada a la

cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC).
C. Espectrometra de infrarrojos:
El espectro infrarrojo es la Huella Dactilar. Cada
grupo funcional tiene unas frecuencias
caractersticas llamadas Frecuencias de grupo de tal
modo que nos da informacin rpida sobre los
grupos funcionales.
Aplicacin: el anlisis toxicolgico solo se usa para
anlisis cualitativo y aunque es muy bueno para
identificar compuestos desconocidos.
Ventajas:
- No destruccin ni alteracin de la muestra.
- Espectro infrarrojo.
Inconvenientes:
- Requiere gran pureza.
- Cantidad de muestra elevada.
D. Espectrofotometra de absorcin atmica (EAA):
Es para medir los metales, y tiene 3 subtipos:
- La llama.
- La cmara de grafito.
- La generacin de hidruros.

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Cmo envi la radiacin monocromtica?

Va lmparas selectivas de cada elemento. Dentro de
ellas, tenemos cmaras de ctodo hueco que se
caracterizan por tener el ctodo del elemento que
queremos medir (de plomo, de oroetc.) o bien
lmparas de descarga.

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Inconvenientes:
Uso de lmparas especficas para cada elemento.
Para solucionar esto, existe una alternativa: ICPM
que permite medir simultneamente hasta 30
elementos.
E. Espectrofotometra de emisin de plasma (ICP):
Fundamento: Estudio de las lneas espectrales
emitidas por los tomos cuando son sometidos a
altas temperaturas. Ventaja: Anlisis simultneo de
ms de 30 elementos.
F. espectrometra de masas (MS):
Se emplea para acoplarla a otras tcnicas
instrumentales.
Gases-masas.
ICP-masas.
Porque se basa en que aquellas molculas que son
bombardeas con tomos de alta energa, van a tener
una fragmentacin caracterstica.
Ejemplo:
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IV-

TCNICAS CROMATOGRFICAS:

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Histricamente, se han ido haciendo las diferentes

tcnicas en este orden:
-

Columna.
Papel.
Paca fina.
Gases.
Lquida.

CLASIFICACIN:
Las tcnicas cromatogrficas, se clasifican:
Segn la naturaleza de la fase mvil y la fase
estacionaria:
CROMATOGRAFA LQUIDA:
Cromatografa lquido-lquido.
Cromatografa lquido-slido.
CROMATOGRAFA GASEOSA:
Cromatografa gas-lquido.
Cromatografa gas-slido.
Segn el tipo de soporte sobre el que se dispone
la fase estacionaria:
CROMATOGRAFA EN COLUMNA:
Convencional.
Cromatografa de gases.
Cromatografa lquida de alta resolucin.
CROMATOGRAFA EN PAPEL.
CROMATOGRAFA EN CAPA FINA.
Segn el tipo de interacciones entre el soluto y
la fase estacionaria:
Cromatografa de REPARTO (separacin en
funcin del coeficiente de reparto).
Cromatografa de ADSORCIN (separacin por
competencia entre las fuerzas de adsorcin del

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soluto y el eluyente por el lecho

cromatogrfico).
Cromatografa de INTERCAMBIO INICO
(separacin en funcin de la interaccin
electrosttica entre las cargas del soluto y las
existentes en la superficie del lecho
cromatogrfico).
Cromatografa de FILTRACIN SOBRE GEL
FILTRACIN (separacin segn el tamao
molecular).
Cromatografa sobre FASES QUMICAMENTE
LIGADAS (participan diversos fenmenos
adsorcin, reparto, intercambio inico, etc.
TIPO DE INTERACCIONES:
- Reparto: en funcin del coeficiente de reparto
de los componentes de la mezcla, as tendern a
disolverse ms en la fase mvil o ms en la fase
estacionaria.
- Absorcin: La mezcla tiende a absorberse sobre
la fase estacionaria o sobre la fase mvil y en
funcin de la diferencia de equilibrio de unin
fase estacionaria fase mvil de cada uno de los
componentes de la muestra, se consigue la
separacin.
- Intercambio inico: interaccionan
electrostticamente
- Filtracin sobre gel: Tenemos un gel que es la
fase estacionaria, con distintos tamaos de
poros, la mezcla de componentes atravesar los
poros a mayor o menor velocidad.
- Fases qumicamente ligadas: Es un
procedimiento que rene propiedades de las 4
interacciones vistas previamente.

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CROMATOGRAFA EN CAPA FINA (CCF):

Ventajas:
- Asequible a cualquier laboratorio, puesto que no
es cara.
- Tcnica completa.
- No requiere personal especializado ni especial
conocimiento.
Fases:
- Fase estacionaria: Ser un material poroso.
- Fase mvil: disolvente orgnico.

Adsorbentes, como SILICAGEL, SEPHADEX

Ligantes: carboximetilcelulosa, almidn,
Muestra: en etanol, cloroformo o acetona.
Desarrollo: 10-12 cm.
Localizacin de las muestras: luz UV,
reveladores.
Identificacin: Rf Relacin Frontal y Color.
Cmo sabemos que se han separado los
componentes?
Con un sistema de revelado, que puede ser:
Fsico (fluorescencia): El ms comn consiste en
aadir al absorbente un indicador fluorescente.
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Qumico: Consisten en realizar una reaccin

qumica entre un reactivo revelador y los
componentes separados.
Las sustancias se separan con esta tcnica en
funcin de su solubilidad
Identificacin: se hace mediante el color de la
mancha y por el Rf:
Rf =

Rx
Rs

Para decir que se trata de un mismo txico en una

relacin frontal deben tener el mismo Rf.

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CROMATOGRAFA DE GASES (CG):

Fases:
- Fase mvil: es un gas inerte.
- Fase estacionaria: Columna.
Sistema cromatogrfico:

Horno: Se introduce la columna.

Inyector: Sistema que nos permite inyectar la
muestra.

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Detector: ionizacin de llama o masas. Entran

las sustancias una en una, y es el que da una
seal por cada txico de la muestra.
Amplificador de la seal.
Registro. Grfica.
Sistema para regular el flujo de la fase mvil y/u
otro gas del detector.
La cromatografa de gases slo sirve para aquellos
txicos No voltiles.
Generalmente los apolares, no son voltiles. Con lo
cual, para realizar una CG, deben ser a apolares.
Los distintos componentes de la muestra viajan a
diferente velocidad por la columna en funcin de:
- Volatilidad relativa.
- Solubilidad en la fase estacionaria.
Cada componente de la muestra es detectado a un
tiempo especfico y caracterstico (en un
determinado flujo y una determinada columna) en
funcin de las condiciones de medida.

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Tiempo de retencin: tiempo transcurrido desde la

introduccin de muestra en la columna hasta que
sale de ella y es detectado.

CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA RESOLUCIN

(HPLC):

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Similitud con GC:

- Horno: no es imprescindible aunque
recomendable para termostatizar.
- Inyector: no tiene cmara volatilizacin, porque
no estamos en gases sino en lquidos. Sino que
el inyector la introduce directamente en la
columna.
- Detector (UV, fotodiodos, FD, ECD).
- Registrador: Para la obtencin del
cromatograma.
Ventajas:
-

Mayor precisin.
Mayor resolucin.
Menor tiempo de anlisis.
Requiere mnima preparacin de la muestra.
Utiliza pequeas cantidades de la muestra.
Txicos termolbiles.

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V-

TCNICAS INMUNOLGICAS:

Se basa en un principio analtico: reaccin de

antgeno con anticuerpo.
Se distinguen distintos tipos de mtodos
inmunoqumicos:
1) RIA: radioinmunoensayo
2) Enzimoinmunoanlisis (este es el ms utilizado)
3) Inhibicin de la hemaglutinacin

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RADIOINMUNOENSAYO (RIA):

El radioinmunoensayo (o abreviado RIA del ingls

Radioimmunoassay) es un tipo de inmunoensayo o
mtodo radioinmunomtrico que se basa en la
formacin especfica de los complejos antgenoanticuerpo (Ag-Ac) lo que le dota de una gran
especificidad unido a la sensibilidad de los mtodos
radiolgicos.
ENZIMOINMUNOENSAYO (EMIT):
Los enzimoinmunoensayos en general son tcnicas
muy rpidas, se hacen en pocos minutos, podemos
hacer screening. Solo apunta a determinados txicos
o frmacos, sensibilidad.

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Segn la conducta de este marcador se divide en:

- Enzimoinmunoensayo homogneo.
- Enzimoinmunoensayo heterogneo (ELISA). El
marcado puede ser antgeno o un anticuerpo
marcado con una enzima cuya actividad no se
modifica al producirse la reaccin
inmunoqumica. No es competitivo.
Es un proceso sencillo, rpido.
Se mide el incremento de la DO por producto de la
reaccin.

Tambin se han utilizado estas placas pequeas,

donde lo que se hace es, poner una tira reactiva que
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contiene los anticuerpos frente al toxico que

estamos buscando.

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