Enzimologa - Inhibidores

Inhibicin reversible
La inhibicin de la actividad enzimtica es un proceso de enorme importancia
biolgica. Muchos caminos metablicos son regulados a travs de la inhibicin
selectiva de una o ms de las enzimas que los componen. Adems de este efecto
fisiolgico, la inhibicin puede presentar efectos perjudiciales, en el caso de
muchas intoxicaciones, o beneficiosas, en el caso de los medicamentos que se
comportan como inhibidores. Precisamente el uso teraputico de los inhibidores es
un estmulo para el estudio a fondo de los procesos de inhibicin de enzimas.
La inhibicin es la disminucin de la actividad enzimtica por algn agente
qumico, un ligando, a diferencia de la desnaturalizacin, que es el cese
permanente de la actividad enzimtica por un agente fsico o qumico.
La inhibicin reversible est caracterizada por un equilibrio entre la enzima y el
inhibidor, definido ste por una constante de equilibrio que mide la afinidad de la
enzima (E) por el inhibidor (I). La inhibicin reversible implica que desaparece el
efecto inhibitorio si se remueve el inhibidor, y que va a existir inhibicin en su
presencia en un grado que depende de la concentracin del I.
La inhibicin puede apreciarse como una disminucin de VMAX o aumento de Km
solamente, o por una combinacin de efectos sobre ambos.
Inhibicin competitiva
a. Totalmente competitiva
En la Inhibicin competitiva el sustrato (S) y el I compiten por la enzima libre,
pudiendo unirse uno o el otro, pero no ambos simultneamente, hay una
interaccin mutuamente excluyente del S y de I con la enzima. La unin de E a I
conduce a la formacin de un complejo no productivo.
kp
k+1
E + S ES E + P
k-1
k+2
E + I EI
k-2

La constante de disociacin para el inhibidor se define como:

Ki =

[E][]I = k 2
[EI] k + 2

Ac es claro que el grado de inhibicin depende de la relacin de

concentracin entre S e I. Eventualmente, todo el I puede ser desplazado de la
enzima si se aumenta suficientemente la [S], llegando a VMAX pero a costa de una
mayor [S], o sea que aumenta el valor de Km aparente (Kmapp).

Enzimologa - Inhibidores

Las formas en que un I puede interactuar con una enzima para dar inhibicin
competitiva son varias.
El ejemplo ms comn es el de un ligando que posee una estructura
anloga, muy parecida a la del sustrato, pudiendo interactuar directamente con el
sitio cataltico:

X
I

Ejemplos de inhibidores competitivos por analoga con el sustrato:

COOH
H 2C

CH2

COOH

FAD FADH2
Succinato
deshidrogenasa

succinato
COOH
H2 C
COOH

malonato

COOH

H 2N

H2N

HOOC

H2NO2S

COOH

fumarato
El oxalato es un inhibidor
competitivo de la
succinato
deshidrogenasa, una
enzima del ciclo de los
cidos tricarboxlicos

Sulfanilamida

PABA

Las sulfanilamidas son antibiticos

sintticos. Son inhibidores competitivos
de la sntesis de folato en bacterias
(inhiben a la dihidrofolato sintetasa),
uno de cuyos precursores es el c. paminobenzoico.

Otra posibilidad es que el I cause un impedimento estrico con la unin del S

unindose en un sitio diferente al sitio activo:

X
I

Enzimologa - Inhibidores

o bien que la unin del I cause un cambio conformacional tal que se

modifique la afinidad de la E por el S. As, estaramos en presencia de una
interaccin de tipo alostrico.

S
I

Ejemplo de este tipo de inhibidores son los acilsulfatos y acilfosfonatos que

inhiben de forma alostrica y competitiva a la actividad de fosfolpido fosfatasa
asociada a algunas epoxido hidrolasas.
Determinacin de la ecuacin de velocidad

Ks
kp
E + S ES E + P
+
k-1
I

Ki =

Ki

[E][]I = k 2
[EI] k + 2

EI
v = kp [ES]
[E]t est distribuido en 3 especies: [E], [ES] y [EI].
Por lo tanto
[E]t = [E] + [ES] + [EI]
dividiendo la ecuacin anterior por [E]t
k p [ES ]
v
=
[E]t [E] + [ES ] + [EI]
como
[ES ] = [S] [E]
Ks

[EI] = I [E]
KI

Enzimologa - Inhibidores

Entonces, pasando kp al primer miembro y reemplazando [ES] y [EI] queda:

[S] [E]

v
Ks
=
[
S
I
k p [E ]t [E ] + ] [E ] + []
[E]
Ks
Ki
Simplificando [E] y reordenando:
v=

[S] * Vmax

[]I
1 + + [S ]

Ki

K i

Es claro de esta ecuacin que al tender [I] a 0 la ecuacin se convierte en la

Michaelis Menten. Si E posee una alta afinidad por I, es decir una Ki baja, el efecto
se logra con bajas [I]. Por otro lado, al tender [S] a , el denominador tiende a ser
igual a [S] y v tiende a VMAX. Es decir, a alta [S] se revierte la inhibicin,
alcanzando la VMAX.
Los grficos van a adoptar la siguiente forma:

v
Vmax

Vmax/2

1/v

Km

Kmapp

[I1]

[S]

[]I 1
1
1
Km
=
+
(1 + )
v Vmax Vmax
K I [S ]

1/[S]

-1/Km

-1/Km

1+

[I1]
Ki

Enzimologa - Inhibidores

b. Parcialmente competitiva

Ks

ES

E
Ki

EI

kp
E+P

Ks

Ki

ESI

kp
EI + P

En este caso, el S y el inhibidor no son v

mutuamente excluyentes del sitio cataltico,
el complejo EI puede unir S (con menor
afinidad) y el complejo ES puede unir I
(con menor afinidad tambin) para dar el
complejo ternario ESI. El complejo ESI
parcial
puede descomponerse para dar el
producto, con la misma velocidad que en
ausencia del I.
total
Da el mismo tipo de grficos que la pura o
[I]
totalmente competitiva.
Se distingue entre ambas graficando la
velocidad obtenida a diferentes concentraciones de inhibidor y con una
concentracin de S no saturante. En el caso de que sea total, la inhibicin a muy
alta [I] lleva la actividad a 0. Si es parcial, aunque la enzima est saturada con I, al
descomponerse ESi va a haber una velocidad residual que se mantiene aunque se
aumente mucho [I].
Inhibicin no competitiva

No se afecta la unin de S con E, pero se ve alterada VMAX. Hay dos posibilidades:

a - EIS no se descompone en EI + P y la velocidad es la que corresponde a la
ruptura de ES (en este caso el efecto del inhibidor es reducir la cantidad de
enzima activa).
b - EIS se descompone a una velocidad menor y la velocidad es la resultante de la
suma de ambas reacciones.

Enzimologa - Inhibidores

a. No competitiva completamente

kp
E+P

k+1
ES
k-1

k-5 k+5

EI

k+4
ESI
k-4

k-3 k+3

De este esquema es claro que la velocidad disminuye la bajar la [ES], del cual
depende la velocidad final observada.
En condiciones de equilibrio existen slo 2 constantes de equilibrio a considerar
dado que, por definicin, la combinacin e S o I no afecta la afinidad de la enzima
por el otro.
As,
KS =

k -1 k 4
=
k +1 k + 4

KI =

k -3 k 5
=
k +3 k +5

v = kp [ES]
y
k p [ES ]
v
=
[E]t [E] + [ES ] + [ESI] + [EI]

considerando que la concentracin de los complejos es:

[ES ] = [S] [E]

[EI] = I [E]
KI

Ks

[ESI] = [S] [EI] = [S][]I [E]

KS

reemplazando en la ecuacin anterior:

v
=
k p [E ]t

v
Vmax

[S] [E]
Ks

[E] + [S] [E] + []I [E] + [S][]I [E]

Ks

Ki

[S]

K SK i

[S]
Ks
=
[S] + []I + [S][]I Ks(1 + []I ) + [S](1 + []I )
1+
K s K i K SK i
Ki
Ki

K IK S

Enzimologa - Inhibidores

[S] * Vmax /(1 + []I )

Ki
v=
Ks + [S]
As, llevando [I] a v tiende a 0 y esto no se puede revertir incrementando [S].
Los dobles recprocos toman esta forma:

(1 +

[]I )

KI
[]I 1
1
Km
=
+
(1 + )
v
Vmax
Vmax
K I [S ]

1/v

app

1/Vmax = 1 +

[I1]
Ki

[I1]

)V

max

-1/Km

1/[S]

El anlisis de estado estacionario da ecuaciones que contienen el cuadrado de las

concentraciones de S e I y en consecuencia los doble recprocos no son lineales.
b. Parcialmente no competitiva

Se da cuando ESI se descompone en EI + P, siendo la velocidad

v = k [ES] + k [ESI]

EI

kp
E+P

k-5 k+5

k-3 k+3

k+1
ES

k-1
k+4
ESI
k-4

kp
EI + P

Enzimologa - Inhibidores

En este caso en exceso de inhibidor la velocidad tiende a un mnimo distinto de 0.

La enzima con inhibidor unido puede unir S tambin, pero la descomposicin del
complejo ESI transcurre a una velocidad menor.
Inhibicin mixta
a. Totalmente mixta
La inhibicin mixta se caracteriza por grficos doble recprocos que se intersectan
no sobre un eje sino en algn cuadrante. VMAX siempre va a disminuir, mientras
que Km puede subir o bajar.
Este tipo de inhibicin puede aparecer por distintas razones y de varias maneras.
El caso particular que se presenta aqu es el de una inhibicin mixta con
asociacin de inhibicin no competitiva pura y parcialmente competitiva para
enzimas que obedecen a cinticas de equilibrio.
Se asume que estn afectadas las afinidades de E y EI por el sustrato y que ESI
es inactivo.
KS
ES

KI

kp
E+P

KI

KS
ESI

EI

Este esquema es similar al observado para la inhibicin parcialmente competitiva,

excepto que ESi no se descompone y entonces
V = k [ES]
Resolviendo como antes llegamos a la ecuacin:
Vmax
v=

Vmax
KS
[]I
[]I
(1 + ) + (1 + )
[S] Ki
KI

(1 +

v=

[]I )

K I

[]I
(1 + )
KS
Ki
1+
*
[S] (1 + []I )
K I

Enzimologa - Inhibidores

Los grficos doble recprocos muestran que las intersecciones tanto en el eje x
como en el y varan con la adicin de I. Los grficos se intersectan en el segundo
o tercer cuadrantes.
[I3]

1/v

app

1/Vmax = 1 +

[I3]
Ki

)V

max

> [I2] > [I1]

[I3]
Esta situacin se da cuando Ki> Ki
porque entonces Km se va a
incrementar cuando suba la [I].

[I2]
[I1]

1/[S]

1/v
Ki> Ki

1/[S]
Inhibicin acompetitiva

Enzimologa - Inhibidores

10

Un inhibidor acompetitivo es aquel que se define cinticamente como el que

afecta a Km y VMAX en un mismo grado. Hay ms de una manera en que esto
puede ocurrir. Una de ellas aparece cuando una enzima que presenta cintica de
estado estacionario posee una k-1 << k+2 (o kp). Entonces Km, que es igual a (k-1 +
k+2)/k+1 tiene a ser igual a k+2/k+1 al tornarse k-1 despreciable frente a k+2.
De esta manera, un inhibidor que afecte a a k+2 (y por lo tanto a VMAX) va a
afectar a Km proporcionalmente, al desplazar las concentraciones del estado
estacionario.
En forma ms general, podemos asumir que I se combina slo con el complejo
ES y que no reacciona para dar P.
k+2
E+P

k+1

ES

k-1

KI

ESI
As, disminuye [ES] y por consiguiente baja VMAX pero tambin Km, ya que se
secuestra complejo ES y se desplaza el equilibrio en el sentido de su formacin,
en apariencia aumenta la afinidad.
La resolucin de la ecuacin de velocidad da:
([E]t - [ES] - [ESI])*[S] = Ks [ES]
[ES][I] = Ki [ESI]
v = k+2 [ES]
Vmax

[]I )
KI
v=
K
1
1+ m *
[S] (1 + []I )
KI
(1 +

El mismo factor afecta tanto a VMAX como a Km. rearreglando tenemos:

v=

Vmax

[]I )
Km
+ (1 +
[S]
KI

[]I
1
1
Km 1
(1 + ) +
=
v Vmax
KI
Vmax [S ]

Enzimologa - Inhibidores

11

Como queda claro de la ecuacin recproca, al graficar a diferentes [I] se

obtendr una familia de rectas con la misma pendiente y diferentes coordenadas
al origen

1/v

[I3]

> [I2] > [I1]

[I3]
[I2]
[I1]

1/[S]

En la inhibicin parcialmente acompetitiva ESI puede descomponerse y los

dobles recprocos se cortan en el primer cuadrante.

1/v

1/[S]

Enzimologa - Inhibidores

12

Determinacin del valor de Ki

Se utilizan grficos secundarios, cuyos datos provienen de los datos primarios

de v vs. [S] a distintas [I].
Grficos de Dixon

Se grafica 1/v versus la concentracin de I a diferentes concentraciones de S.

100

[I]4

1/v

80

[I]3
60

[I]2

v2 40

S3

1/v1
1/v2

[I]1

v1
20

0
0

[S]1 [S]2

[S]3

[S]

[S]4

[I]1

-Ki

[I]2

[I]3

[I]4

[I]

En la inhibicin no competitiva las lneas se juntan sobre el eje x dando el

valor de KI. En la inhibicin acompetitiva, se obtiene un conjunto de lneas
1/v
No Competitivo

S1

Acompetitivo

1/v

S2 > S1 > S0
S0

S2 > S1

S1
S2
Soo

S2

-Ki

[I]

-Ki

[I]

paralelas que tienden a aglomerarse a medida que aumenta la [S]. El valor de

KI se obtiene por aproximacin trabajando con concentraciones muy altas de S.

Enzimologa - Inhibidores

13

En la inhibicin competitiva se observa una familia de rectas que se

intersectan sobre el segundo cuadrante, en un punto cuya abscisa determina Ki. Al
tender la [S] a la recta se hace horizontal, lo que indica que la velocidad no vara
con la concentracin de I, ya que la enzima se halla saturada por el S y en
consecuencia no es inhibida. As, un grfico de las pendientes de estas rectas
versus 1/[S] tiene su origen en 0.

-Ki Competitivo

1/v

S1

pendiente

S2
S2 > S1

-Ki

Soo

[I]

1/[S]

La inhibicin mixta presenta cruzamiento de rectas en el segundo o tercer

cuadrante, con una interseccin cuya abscisa determina el valor de KI.

1/v
Mixto

S1

Mixto

S2

1/v

S1

S2
S2 > S1

S2 > S1

-Ki
[I]

-Ki

[I]

Si bien en algn caso puede presentarse un resultado anlogo al de la

inhibicin competitiva, graficando la pendiente versus 1/[S] se verifica que la lnea
no parte del origen en este caso, dado que por ms que se aumente la [S] la
inhibicin no desaparece totalmente y la pendiente a muy alta [S] nunca llega a ser
0.

pendiente

1/[S]

Enzimologa - Inhibidores

14

Grficos de Cornish Bowden

Se grafica [S]/v versus [I]. Si hubiera alguna duda usando Dixon del tipo de
inhibicin en el caso de un inhibidor competitivo o mixto, en este caso queda claro
al resultar paralelas las rectas obtenidas en el caso de la inhibicin competitiva,
mientras que se mantiene el perfil en el caso de un inhibidor mixto.
[S]/v
No Competitivo

S2 > S1

[S]/v
Competitivo

S1

S2

S2 > S1

S1

S2

-Ki

[I]

-Ki

1/v

S2

Mixto

S1

Mixto

1/v

[I]

S2

S1
S2 > S1

S2 > S1

-Ki

-Ki

[I]

Acompetitivo

1/v

S2

S1
S2 > S1

-Ki

[I]

[I]