Manual de - MICROBIOLOGIA Equipo 4

Universidad Veracruzana
Facultad de Bioanlisis
Microbiologa General
MANUAL DE PRCTICAS DE LABORATORIO
Catedrtico: Edith Pozos Mestizo
Equipo 4:
Brenda Ivonne Arenas Caiceros
Luis Alberto Cabrera Corts
Jess Daniel Vasquez Rodriguez
Xalapa, Ver. Martes 29 de noviembre de 2016
Microbiologa general
Prcticas de laboratorio
PRCTICA # 1 MICROSCOPIA
INTRODUCCION
El objetivo de esta prctica es que el alumno aprenda las principales tcnicas de la
microscopia usadas en el laboratorio de microbiologa.
El microscopio es un instrumento que permite observar a los organismos que son
demasiado pequeos para observarlos a simple vista.
El microscopio fue inventado por zacharias Janssen en 1590. En 1665 William
Harvey observa la circulacin sangunea en los capilares con ayuda de un
microscopio pero fue hasta el siglo XVII donde Anton Van Leeuwenhoek utilizo
microscopios fabricados por l y describi por primera vez a los protozoos,
bacterias y glbulos rojos.
OBSERVACIONES
Los microscopios tienen diferentes aumentos est el de 5X que es el panormico,
el de 10X, el de 40X y el de 100X que es el objetivo de inmersin, este ltimo
objetivo se utiliza con el aceite de inmersin para no daar el lente y para que la
luz no se desve hacia otro lado as se puede observar con mayor claridad. Cuenta
tambin con una lmpara que da luz a la muestra para observarla mejor.
CONCLUSIN
El microscopio es uno de los principales instrumentos dentro del laboratorio de
microbiologa, ya que con l se observan los diferentes microorganismos y las
caractersticas que los diferencian.
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PRCTICA # 2
MORFOLOGIA DE LOS MICROORGANISMOS
(bacterias, levaduras, hongos y protozoarios)
INTRODUCCIN
El alumno debe aprender la morfologa de cada uno de los microorganismos para
poder identificarlos, no solo por la morfologa sino con diversas pruebas.
Cada microorganismo se diferencia por su
morfologa y por las pruebas a las que
reaccionan las bacterias, por ejemplo son
observadas y clasificadas por la tincin de
Gram, en cambio algas y protozoarios se
observan sin la necesidad de aplicarles una
tincin.
CONCLUSIN
En esta prctica se observaron las
principales diferencias entre los diferentes
microorganismos y cules son las tcnicas con las que se observan.
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PRCTICA # 3
PREPARACIN DEL MEDIO DE CULTIVO
INTRODUCCIN
En esta prctica el alumno aprender a preparar el medio de cultivo en el que se
desarrollaran las bacterias para su posterior estudio. El medio debe cumplir con
ciertas especificaciones y caractersticas fsicas como el pH, que este estril, la
concentracin de agar y otros factores que influyen para que los microorganismos
se puedan desarrollar.
OBSERVACIONES
En esta prctica se prepar el medio de cultivo de soya y
tripticaseina para despus hacer el cultivo de microorganismos.
Primero se pes la cantidad necesaria del medio para 250 ml
despus en un matraz Erlenmeyer se deposit el medio con solo
100 ml de agua destilada, cuando la solucin tena una
coloracin pareja se agregaron los 150 ml restantes, se llev a
calentar al mechero mientras se agitaba para que se disolviera
bien el medio. Una vez que haba hervido tomo una coloracin
amarilla transparente.
Por ltimo se dej enfriar y se introdujo en 4 tubos de ensayo 4
ml con una pipeta y una pequea muestra se llev para ver que
el pH fuera el adecuado para los microrganismos.
CONCLUSIN
En
la
cultivo
de
donde
algunos
sesin
de
laboratorio
se
aprendi a preparar el medio de
soya
y
tripticaseina
para
posteriormente hacer la siembra
bacterias, adems de ser
importante porque ah es en
se vern las caractersticas
morfolgicas y coloniales de
microrganismos.
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PRCTICA # 4
CULTIVO DE MICROORGANISMOS
INTRODUCCION
En esta prctica el alumno aprender las
tcnicas ms comunes de para sembrar
bacterias en diferentes medios de cultivo.
OBSERVACIONES
Se utiliz el medio agar soya y tripticaseina
para sembrar las bacterias que se nos
dieron, las bacterias que se utilizaron
fueron E. Coli, Ps. Aeroginosa y
Stafilococo Aureus. Se tom el asa estril,
se tom una parte de la sepa y se
sembraron haciendo una estra cruzada en
el medio una vez terminando sembrar se
esterilizo de nuevo el asa y se repiti el
procedimiento para cada microorganismo.
Ejemplo de la siembra.
CONCLUSIN
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Esta prctica es muy importante ya que con ella se aprendieron las tcnicas para
sembrar a los microorganismos en un medio slido, para despus poder observar
las caractersticas coloniales de estos microorganismos.
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PACTICA 5
MORFOLOGIA COLONIAL
INTRODUCCIN
El alumno aprender las diferentes caractersticas de la morfologa colonial
utilizadas en la identificacin de las bacterias.
Las colonias son agrupaciones formadas a partir de la reproduccin de una unidad
formadora de colonias sobre un medio slido y aunque los tamaos pueden variar
generalmente pueden verse a simple vista.
La unidad formadora de colonias es el nmero mnimo de clulas separables en la
superficie, o dentro de un medio de agar semislido que da lugar al desarrollo de
una colonia visible del orden de decenas de millones de clulas descendientes.
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TERMINOS DESCRIPTIVOS PARA LA MORFOLOGIA DE LAS COLONIAS EN

UNA SUPERFISIE DE UN MEDIO SOLIDO
Forma
Circular
Irregular
Rizoide
Puntiforme
Elevacin
Plana
Convexa
Elevada
Borde
Entero
Lobulado
Ondulado
Filamentoso
Superficie
Lisa
Rugosa
Plegada
Consistencia
Cremosa
Membranosa
CONCLUSIN
Dependiendo de la bacteria es la forma de la colonia y aprender cmo es que se
ven en los diferentes medios cada bacteria es importante para su estudio y su
identificacin para saber qu tipo de bacteria es la que se cultiv.
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PRCTICA # 6 TECNICAS DE TINCIN

Tincin Simple
Introduccin
Se entiende por tincin (o coloracin) simple al teido de los microorganismos
aplicando slo una solucin colorante.
Se usa un nico colorante, que siempre es de tipo bsico. Se utilizan solamente
para incrementar el contraste; todas las clulas absorbern el colorante y
quedarn teidas del mismo color.
El azul de metileno, cuyo nombre cientfico es Cloruro de Metiltionina, es un
colorante que se usa para tratar una enfermedad llamada metahemoglobinemia. El
azul de metileno se usa como tintura para teir ciertas partes del cuerpo antes o
durante la ciruga. Esta sustancia tiene forma de cristales o polvo cristalino y
presenta un color verde oscuro, con brillo bronceado. Es inodoro y estable al aire.
Sus soluciones en agua o en alcohol son de color azul profundo.
Fundamento
La coloracin con azul de metileno tie a todas las bacterias por igual.
Se utiliza el colorante para teir las estructuras presentes en el citoplasma de la
bacteria.
No es diferencial porque cuando se tien microorganismos con ste colorante tie
a todos por igual, se comporta de la misma forma con una bacteria u otra.
Procedimiento:
1. Extensin: Poner una gota de agua en el portaobjetos y extender en ella la
muestra utilizando el asa de siembra.
2. Fijacin: Pasar el portaobjetos varias veces por encima de la llama del mechero
de alcohol, sin permitir que llegue a hervir, hasta que se seque.
3. Aadir Azul de metileno y esperar 2 minutos
4. Lavar con agua
5. Secar
6. Observar primero con el objetivo 40; luego se aade aceite de inmersin y se
observa con el objetivo 100
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Tincin Diferencial
Tincin diferencial de Gram: Introduccin
Esta tincin se denominada as por el bacterilogo dans Christian Gram, quien la
desarroll en 44. Sobre la base de su reaccin a la tincin de Gram, las bacterias
pueden dividirse en dos grupos, grampositivas y gramnegativas (en este caso, los
trminos positivo y negativo no
tiene nada que ver con carga elctrico, sino simplemente designan dos grupos
morfolgicos distintos de bacterias).
Fundamento
Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tien de forma distinta debido a las
diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la
clula bacteriana sirve para
dar su tamao y forma al organismo as como para prevenir la lisis osmtica. El
material de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el peptidoglicano. La
pared de la clula gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas
interconectadas de peptidoglicano as como algo de cido teicoico.
Generalmente, 80%-90% de la pared de la clula gram-positiva es peptidoglicano.
La pared de la clula gram-negativa, por otro lado, contiene una capa mucho ms
delgada, nicamente de peptidoglicano y est rodeada por una membrana exterior
compuesta de fosfolpidos, lipopolisacridos, y lipoprotenas. Slo 10% - 20% de la
pared de la clula gram-negativa es peptidoglicano.
Descripcin de la tincin de GRAM:
Las clulas fijadas al calor sobre un portaobjetos se tien, primero con una
solucin de cristal violeta (otros colorantes bsicos no son tan efectivos) y son
lavadas despus para quitar el exceso de colorante. En este estado, todas las
clulas, tanto las grampositivas como las gramnegativas, estn teidas de azul.
El portaobjetos se cubre entonces con una solucin de yodo-yoduro potsico. El
ingrediente activo es aqu el I2; el KI simplemente hace soluble el I2 en agua. El I2
entra en las clulas y forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta.
De nuevo tanto las clulas grampositivas como las gramnegativas se encuentran
en la misma situacin.
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Se lleva a cabo despus la decoloracin, usando una mezcla de alcohol-acetona,

sustancias en las que es soluble el complejo I2-cristal violeta.
Algunos organismos (grampositivos) no se decoloran, mientras que otros
(gramnegativos) lo hacen. La diferencia esencial entre esos dos tipos de clulas
est por tanto en su resistencia a la decoloracin; esta resistencia se debe
probablemente al hecho de que en el caso de bacterias gram-negativas, la mezcla
de alcohol/acetona es un solvente lipdico y disuelve la membrana exterior de la
pared de la clula (y tambin puede daar la membrana citoplsmica a la que se
une peptidoglicano). La delgada capa de peptidoglicano es incapaz de retener el
de complejo cristal violeta-yodo y la clula se decolora. Las clulas grampositivas,
a causa de sus paredes celulares ms espesas (tienen ms peptidoglicano y
menos lpido), no son permeables al
disolvente, provocando que el de complejo cristal violeta-yodo quede atrapado
dentro de la pared celular. Despus de la decoloracin las clulas grampositivas
son todava azules, pero las gramnegativas son incoloras.Para poner de
manifiesto las clulas gramnegativas se utiliza
una coloracin de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la
safranina o la fucsina bsica. Despus de la coloracin de contraste las clulas
gramnegativas son rojas, mientras que las grampositivas permanecen azules.
Procedimiento
Descripta en forma breve, la secuencia de la tincin es la siguiente:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
El Frotis fijado con calor se tie 1 min con Violeta Cristal.

Se lava con agua, se cubre con solucin Yodada durante 1 - 2 min.
Se lava de nuevo con agua.
Decolorar con mezcla alcohol etlico/acetona.
Escurrir y cubrir con Safranina (color de contraste) durante 1 2 min.
Lavar y secar.
OBSERVACIONES
Se hizo un frotis de E. Coli y Stafilococo Aureus y un frotis de las dos
bacterias combinadas que se fij al calor, una vez que se sec se llev al
puente para aplicar los colorantes para aprender la clasificacin de las
bacterias como Gram positivas y Gram negativas.
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Los frotis una vez teidos se llevaron a observar al microscopio.
E. Coli (Gram negativa)
S. Aureus (Gram positiva)
frotis combinado
CONCLUSIN
De gran importancia en Microbiologa porque permite diferenciar dos grandes
grupos de bacterias Gram positivas y Gram negativas, segn se comporten ante
esta tincin. El fundamento radica en la diferente estructura de la pared celular de
ambos grupos: las bacterias Gram positivas tienen una gruesa capa de
peptidoglicano en su pared, mientras que las bacterias Gram negativas tienen una
capa de peptidoglicano ms fina y una capa lipopolisacardica externa que no
puede atrapar el colorante. Las bacterias Gram positivas se tien de color azul o
violeta y las Gram negativas se ponen de color rosado
PRCTICA # 7
ANLISIS MICROBIOLOGICO DEL AGUA
Agua para consumo humano a granel, a la que no contiene materia extraa, ni contaminantes,
ya sean qumicos, fsicos o microbiolgicos, que causen efectos nocivos a la salud, que es
suministrada en presencia del consumidor.
Agua para consumo humano preenvasada, a la de cualquier origen, que no contiene materia
extraa, ni contaminantes, ya sean qumicos, fsicos o microbiolgicos, que causen efectos nocivos
a la salud, para su comercializacin se presenta al consumidor en envases cerrados, incluyndose
entre otras: al agua de manantial, agua mineral, agua mineralizada.
Especificaciones sanitarias de producto.
Los productos objeto de este ordenamiento, deben cumplir con las siguientes especificaciones:
La materia prima al inicio del proceso de los productos objeto de esta Norma, debe cumplir como
mnimo con las especificaciones sanitarias que se establecen en la NOM-127-SSA1-1994. En caso
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de no ser as, el producto terminado adems de cumplir con las especificaciones que se establecen
en esta norma, debe cumplir con los lmites mximos para bario, cromo y plaguicidas que se
establecen en la norma arriba citada.
Organolpticas y fsicas.
Especificacin
Olor
Inodoro
Sabor
Inspido
Lmite Mximo
Color
15 unidades de color verdadero * en

la escala de platino cobalto
Turbiedad
5 Unidades de UNT
*Unicamente el producido por slidos disueltos en el agua.

Microbiolgicas.
Especificacin
Coliformes totales
Lmite mximo
< 1,1NMP/100mL
RESULTADOS Y OBSERVACIONES:
PRUEBA PRESUNTIVA:
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Placa con agar soya y tripticaseina:

Placa 1
2 colonias
Placa 2
1 colonias
N de colonias
totales
Color de colonias
Amarillo, crema
Color
Crema
predominante
Borde
Redondo
Textura
Cremosa
Forma
Circular
Elevacin
Convexa
Forma
Circular
Tamao
1-2 milmetros
Placa 1 (2)+ placa 2 (1) / 2 =3
Crema
Crema
Redondo
Cremosa
Circular
convexa
circular
1-2 milmetros
N UFC= 3 UFC.
Tubos de caldo lactosado
tubos
viracio
n
Turbid
ez
Gas
Pelcul
a
Tubo 1
Si
Tubo 2
si
Tubo 3
no
Tubo 4
si
Tubo 5
si
Tubo 6
no
Si
Si
si
si
si
si
Si
no
no
si
no
si
si
no
si
si
no
si
PRUEBA CONFIRMATORIA
Tubos con c.b.v. brillante:
Tubos
Viracio
n
Turbid
ez
Gas
pelcul
a
Tubo 1
No
Tubo 2
No
Tubo 3
Si
Tubo 4
No
Tubo 5
No
Tubo 6
Si
Si
No
No
Si
Si
Si
Si
No
Si
No
No
No
No
Si
Si
Si
No
Si
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PRCTICA # 8
PRESIN OSMOTICA
Introduccin
En esta prctica se vio el crecimiento de dos bacterias E. coli y estafilococos
aureus
para ver cul era el que creca mejor en un medio con altas
concentraciones de NaCl y cual no.
Para esta prctica haba que revisar que es la presin osmtica, la cual se define
como el fenmeno resultante de la diferencia de la concentracin de sales a travs
de una membrana plasmtica. Se trata de una de las caractersticas a tener en
cuenta en las relaciones de los lquidos que constituye el medio interno de los
seres vivos ya que la membrana regula la entrada y salida de soluto al medio
extracelular que la rodea ejerciendo una barrera de control.
Procedimiento
Para la prctica se sembraron las dos bacterias en diferentes tubos (4 para cada
una) con caldo nutritivo el primero, para de ah tomar azadas y sembrar en los
dems tubos a los que se agregaron diferentes cantidades de NaCl para ver el
crecimiento de las bacterias con las diferentes concentraciones, con las siguientes
cantidades
Numero de tubos
# de tubo
0
Caldo ms 0 ml
NaCl
Caldo
2 ml
nutritivo
1
1 ml
2
1ml
3
1 ml
4
0 ml
1 ml
2 ml
5 ml
2ml
Una vez sembradas las bacterias se encubaron para ver su crecimiento

Resultados
Las bacterias que si haban crecido en el medio con sal fueron estafilococos
aureus porque E. coli no se desarroll en el medio con sal, ya que esta bacteria no
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puede crecer con grandes cantidades de sal a su alrededor por el tipo de

membrana que tiene a diferencia de estafilococos aureus
que si puede
desarrollarse en medios con una gran cantidad de sal.
Los resultados de la turbidez estn en el siguiente cuadro.
Numero de tubos
# de tubo
0
Caldo ms 0 ml
NaCl
Caldo
2 ml
nutritivo
E. coli
Turbio
Estafilococo
s aureus
Turbio
1
1 ml
2
1ml
3
1 ml
4
0 ml
1 ml
2 ml
5 ml
2ml
Sin
turbidez
Turbio
Poca
turbidez
Turbio
Poca
turbidez
Turbio
Turbio
Turbio
Como se puede observar en los resultado de la tabal anterior la concentracin de

sal afecto ms a E. coli que a estafilococos aureus.
Conclusin
La bacteria E. coli se ve ms afectada por la presin osmtica debido a la
membrana que tiene a diferencia de estafilococos aureus no se ve afectada en su
crecimiento ya que si puede crecen en grandes concentraciones de sal.
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Prctica 9
Efecto de la temperatura
INTRODUCCIN
La temperatura es un factor abitico que regula procesos vitales para los
organismos vivos, as como tambin afecta las propiedades qumicas y fsicas de
otros factores abiticos en un ecosistema.
Las bacterias se agrupan en tres categoras, basandose en la temperatura
adecuada para su crecimiento: psicrfilos, mesfilos y termfilos. Filos en griego
significa "amante de".
Psicro significa baja temperatura. Las bacterias psicrfilos son bacterias que
crecen mejor en temperaturas bajas, como 32 a 68 F (0 a 20 C). Ejemplos de
bacterias psicrfilos son las tpicas bacterias del suelo como Arthrobacter y
Psychrobacter. Arthrobacter es una bacteria que ayuda a neutralizar los efectos
txicos de algunos plaguicidas y la nicotina, pero Psychrobacter es una de las
causas de enfermedades como la meningitis.
Meso significa "moderado o medio". Las bacterias mesfilas crecen mejor en
temperaturas entre tibia y clidas, o 77 a 113 F (25 a 45 C).
Las bacterias termfilas (termo significa "caliente o calor"), crecen mejor en
temperaturas calientes o 122 a 158 F (50 a 70 C). Ejemplos de bacterias
termfilas son flavothermus Bacillus y Thermus aquaticus. Flavothermus Bacillus
es una bacteria formadora de esporas que se encuentran en los suelos. Thermus
aquaticus vive en el agua caliente. Se trata de una bacteria importantes que ayuda
a los humanos, las plantas y los animales, a recodificar y reproducir el cdigo de
ADN y ARN con precisin.
Hyper significa "arriba". Las bacterias Hyperthermophilic crecern en temperaturas
muy calientes, de 158 a 230 F (70 a 110 C).
OBSERVACIONES
Se inocularon 4 cajas Petri agar soya, por cada bacteria a estudiar, dichas
bacterias fueron E.coli, y Ps. Aeruginosa.
Cada bacteria fue cultivada a las siguientes temperaturas: 4, 25, 37 y 60 C. Es
decir se cultiv cada par de cajas correspondiente a la temperatura, de las dos
distintas bacterias, durante 48 horas.
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Al haber transcurrido ese tiempo, revisamos las cajas notando que en las
correspondientes a 4 C y a 60 C no hubo crecimiento bacteriano, mientras que
en las de 25 C y 37 C si crecieron abundantemente las colonias bacterianas.
Es importante resaltar que se not un crecimiento mayor de E. coli en la
temperatura de 25 C, en relacin con la de 37 C en donde tambin hubo
crecimiento pero no fue tan abundante como en la primera, esto en caso contrario
al crecimiento de la Ps. Aeruginosa, que creci ms a la temperatura de 37 C en
comparacin con el crecimiento observado a 25 C.
Al terminar la revisin de todas las placas volvimos a incubar a 37 C las placas
que anteriormente haban sido sometidas a las temperaturas de 4 C y 60 C, para
verificar si a la temperatura ptima ejerca un efecto de desarrollo en las bacterias
analizadas.
CONCLUSIN
Las bacterias E. coli y PS Aeruginosa se encuentran dentro del grupo de bacterias
mesfilas, por lo cual no hubo crecimiento bacteriano en las temperaturas de 4 C
y 60 C, es decir a los extremos de fro o caliente no existe desarrollo bacteriano
para este grupo de bacterias.
Por otro lado, podemos concluir con que la temperatura de 4 C para estas
bacterias cumple con una funcin bacteriosttica, mientras que la temperatura a
60 C funge como bactericida, ya que al revisar por segunda ocasin las cajas
incubadas a 37 C, se observ crecimiento en las que al principio fueron
sometidas a 4 C, sin embargo las que haban sido incubadas por primera vez a
60 C ya no mostraron desarrollo colonial.
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Ps. Aeruginosa a 37C
E. Coli a 37C
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PRCTICA #10
Pruebas bioqumicas
Medio de Citrato de Simmons Sustrato: Citrato de sodio. Va: Varias
dependientes del pH del medio. Producto: Acetato/formato en condiciones
alcalinas y Acetato, CO 2, lactato/Acetona y CO 2 en condiciones cidas.
Indicador: Azul de bromotimol. Un microorganismo que puede utilizar el citrato
como nica fuente de carbono tambin utiliza las sales de amonio del medio como
nica fuente de nitrgeno. La extraccin de nitrgeno de las sales de amonio
producen amoniaco y se alcaliniza el medio virando el indicador al alcalino.
Medio SIM (Sulfhdrico Indol Movilidad) Medio SIM (medio semislido)
Sustratos: Tiosulfato o grupos SH de la cistena y triptfano. Enzimas: Tiosulfato
reductasa, cistena desulfurilasa y tiptofanasa. Producto: H2S e Indol. Revelador:
Sales de Fe2+ y p-Dimetilaminobenzaldehdo (DMABA).
En presencia de tiosulfato en el medio o la degradacin de protenas liberando
aminocidos azufrados, algunos microorganismos forman H2S gaseoso por medio
de las enzimas tiosulfato reductasa y cistena desulfurilasa. El gas incoloro H2S
reacciona con el citrato de amonio frrico para producir un precipitado negro
insoluble de sulfuro ferroso metlico.
Medio SIM (Sulfhdrico Indol Movilidad) El medio de cultivo tiene consistencia
semislida por lo que la movilidad se observa por el crecimiento del
microorganismo en todo el tubo, ms all de la zona de inoculacin (picadura).
Los microorganismos inmviles solo crecern en la zona inoculada.
Prueba positiva. Las enzimas triptofanasas oxidan el triptfano para formar tres
metabolitos: indol, metil indol y cido indolactico. Los reactivos de Erhlich o
Kovacs contienen DMABA que reacciona con el indol producido formado un
compuesto quinnico color violeta, que se observa por la aparicin de un anillo en
la superficie del medio.
Medio MIO
Medio usado para la identificacin de Enterobacteriaceae en base a su movilidad,
actividad de ornitina decarboxilasa y produccin de indol.
Fundamento
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Medio de cultivo semislido, altamente nutritivo debido a la presencia de extracto

de levadura, peptona y triptena. Adems, la triptena aporta grandes cantidades
de triptofano, sustrato de la enzima triptofanasa, para la realizacin de la prueba
del indol. La dextrosa es el hidrato de carbono fermentable, la ornitina es el
sustrato para la deteccin de la enzima ornitina decarboxilasa, el prpura de
bromocresol es el indicador de pH, que en medio alcalino es de color prpura y en
medio cido es amarillo.
Por su composicin, es posible detectar 3 reacciones en un mismo tubo:
movilidad, presencia de ornitina decarboxilasa e indol.
La movilidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o por crecimiento que
difunde mas all de la lnea de inoculacin.
La reaccin positiva a la ornitina est dada por un color prpura del medio. Debido
a la fermentacin de la glucosa se reduce el pH produciendo una condicin cida y
originando que el indicador de pH prpura de bromocresol vire al amarillo. La
presencia de acidez, otorga condiciones ptimas para la actividad de la enzima
ornitina decarboxilasa, la cual decarboxila la ornitina presente. Por
decarboxilacin, se alcaliniza el medio, con el consecuente viraje del indicador
hacia el color prpura.
El indol, es producido a partir del triptofano por los microorganismos que contienen
la enzima triptofanasa. El desarrollo de un color rojo luego de agregar unas gotas
de reactivo de Kovacs o de Erlich, indica un resultado positivo.
Ureasa Caldo urea o agar urea de Cristensen. Sustrato: Urea. Enzima:
Ureasa. Producto: Amonaco. Indicador: Rojo de fenol. La hidrlisis de la urea por
la enzima ureasa libera dos molculas de amoniaco que alcaliniza el medio,
entonces se vira el indicador de pH, en el caso del rojo de fenol una prueba
positiva es color bugambilia.
TSI Agar
Medio universalmente empleado para la diferenciacin de enterobacterias, en
base a la fermentacin de glucosa, lactosa, sacarosa y a la produccin de cido
sulfhdrico. Caractersticas del medio: Medio preparado: rojo.
Fundamento
En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los
nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa, sacarosa y glucosa
son los hidratos de carbono fermentables. El tiosulfato de sodio es el sustrato
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necesario para la produccin de cido sulfhdrico, el sulfato de hierro y amonio, es

la fuente de iones Fe3+ , los cuales se combinan con el cido sulfhdrico y
producen sulfuro de hierro, de color negro. El rojo de fenol es el indicador de pH, y
el cloruro de sodio mantiene el balance osmtico.
Por fermentacin de azcares, se producen cidos, que se detectan por medio del
indicador rojo de fenol,el cual vira al color amarillo en medio cido. El tiosulfato de
sodio se reduce a sulfuro de hidrgeno el que reacciona luego con una sal de
hierro proporcionando el tpico sulfuro de hierro de color negro.
Siembra: A partir de un cultivo puro, sembrar en TSI, picando el fondo y
extendiendo sobre la superficie del medio.
Incubacin: A 35-37C durante 24 horas, en aerobiosis.
Resultados:
1-Pico alcalino/fondo cido (pico rojo/fondo amarillo): el microorganismo
solamente fermenta la glucosa.
2-Pico cido/fondo cido (pico amarillo/fondo amarillo): el microorganismo
fermenta glucosa, lactosa y/o sacarosa.
3-Pico alcalino/fondo alcalino (pico rojo/fondo rojo): el microorganismo es no
fermentador de azcares.
4-La presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo, indica que el
microorganismo produce gas.
5-El ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo produce cido
sulfhdrico.
Lisina Hierro Agar.
Medio de cultivo utilizado para diferenciar microorganismos, especialmente
Salmonella spp., basado en la decarboxilacin / desaminacin de la lisina y en la
produccin de cido sulfhdrico.
Fundamento
En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes
para el desarrollo bacteriano. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y la
lisina es el sustrato utilizado para detectar la presencia de las enzimas
decarboxilasa y deaminasa. El citrato de hierro y amonio, y el tiosulfato de sodio,
son los indicadores de la produccin de cido sulfhdrico. El purpura de
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bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de color amarillo a pH igual o menor

a 5.2, y de color violeta a pH igual o mayor a 6.8.
Por decarboxilacin de la lisina, se produce la amina cadaverina, que alcaliniza el
medio y esto produce el viraje del indicador al color violeta. La decarboxilacin de
la lisina, tiene lugar en medio cido, por lo que es necesario que la glucosa sea
previamente fermentada.
Los microorganismos que no producen lisina decarboxilasa, pero que son
fermentadores de la glucosa, producen un viraje de la totalidad del medio de
cultivo al amarillo, pero a las 24 hs de incubacin se observa el pico de color
violeta debido al consumo de las peptonas, y el fondo amarillo.
La produccin de sulfuro de hidrgeno, se visualiza por el ennegrecimiento del
medio debido a la formacin de sulfuro de hierro.
Las cepas de los gneros Proteus, Providencia y algunas cepas de Morganella,
desaminan la lisina, esto produce un cido alfa-ceto-carbnico, el cual, con la sal
de hierro y bajo la influencia del oxgeno forma un color rojizo en la superficie del
medio.
Siembra: Por puncin profunda con aguja de inoculacin.
Incubacin: En aerobiosis, durante 24 horas a 35-37 C.
Resultados
1- Decarboxilacin de la lisina:
-Prueba Positiva: Pico violeta/fondo violeta.
-Prueba Negativa: Pico violeta/fondo amarillo.
2-Desaminacin de la lisina:
Pico rojizo/fondo amarillo. Esto sucede con cepas del gnero Proteus, Providencia
y alguna cepas de Morganella spp.
3-Produccin de cido sulfhdrico:
-Prueba positiva: Ennegrecimiento del medio (especialmente en el lmite del pico y
fondo)
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Prctica 11 Pruebas enzimticas

INTRODUCCIN
Catalasa. La catalasa es un enzima presente en la mayora de los
microorganismos que poseen citocromos. Las bacterias que sintetizan catalasa
hidrolizan el perxido de hidrgeno en agua y oxigeno gaseoso que se libera en
forma de burbujas. El principal objetivo de esta prueba es separar Micrococacceae
(positiva) de Streptococcus spp. y Enterococcus spp. (Negativa).
Oxidasa. Esta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas oxidasas. La
reaccin de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromo oxidasa
que activa la oxidacin del citocromo el cual es reducido por el oxgeno molecular
producindose agua o perxido de hidrgeno segn la especie bacteriana. El
oxgeno acta por tanto como aceptor final de electrones en la cadena
transportadora de electrones. Por lo general, el sistema citocromo oxidasa slo se
encuentra en las bacterias aerobias, algunas anaerobias facultativas y,
excepcionalmente, en alguna microaerfila (Vibrio fetus), pero las bacterias
anaerobias estrictas carecen de actividad oxidasa. Asimismo, la presencia de
oxidasa va ligada a la produccin de catalasa, ya que sta degrada el perxido de
hidrgeno que se produce como consecuencia de la reduccin del oxgeno y cuya
acumulacin es txica.
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Coagulasa. Permite determinar la capacidad de coagular el plasma por la accin

de la enzima coagulasa. Se utiliza para diferenciar S. aureus (coagulasa positivo)
de otras especies de Staphylococcus. La prueba de la coagulasa en tubo se
puede leer tras incubacin de 4h, pero si es negativa debe incubarse hasta 24h.
OBSERVACIONES
Catalasa
La prueba se realiz con la cepa Estafilococo aureus y con E. coli.
Material y reactivos Portaobjetos. H2O2 de 10 volmenes Cultivos en fase
exponencial de bacterias. Asas e hilos de siembra. Pipetas Pasteur
Mtodo
1. Colocar una gota de agua oxigenada sobre un portaobjetos con
ayuda de una pipeta Pasteur.
2. Suspender la bacteria
3.Detectar la formacin de burbujas
A) Negativo
B) Positivo
Oxidasa
La prueba se realiz con la cepa Ps. aeruginosa
Material y reactivos Papel de filtro cortado (trozos de 3x 1 cm); Placas de Petri;
Reactivo de oxidasa: Solucin al 1% de NNN'N', tetrametil, 1-4 fenilendiamina en
agua destilada. El reactivo de oxidasa es bastante txico, manejar con precaucin.
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Se altera por la luz y el oxgeno, por lo que debe ser de preparacin extempornea
y protegerse envolvindolo con papel negro
Mtodo
1-Poner un trozo de papel de filtro sobre una de las tapaderas de una
placa de Petri. 2-Aadir una gota del reactivo de oxidasa.
3-. Depositar sobre el reactivo masa bacteriana (actuar de forma rpida y
con un asa de platino nueva o con un palillo de dientes)
Resultado La reaccin positiva la indica un color azul-violeta intenso antes de
10 segundos
Coagulasa
La coagulasa es una protena producida por varios microorganismos que permite
la conversin del fibringeno en fibrina. En el laboratorio, se usa para distinguir
entre diferentes tipos de Staphylococcus. Un resultado de coagulasa positivo
indica que la muestra contiene Staphylococcus aureus. Esta protena tambin es
producida por Yersinia pestis.
La coagulasa reacciona con la protrombina en la sangre. El complejo resultante se
llama estafilotrombina, y permite que la enzima proteasa convierta el fibringeno
en fibrina. Esto hace que se coagule la sangre. La coagulasa est estrechamente
relacionada con la superficie de la bacteria S. aureus y puede revestir su superficie
con fibrina al entrar en contacto con la sangre.
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Coagulasa positiva
Coagulasa negativa
CONCLUSIN
Catalasa
La prueba dio positivo para S. aureus, negativo para E. coli
Oxidasa
L prueba fue positiva en Ps. Aeruginosa.
Coagulasa
Esta prueba se realiza en caso de querer realizar una confirmacin de que la
bacteria estudiada sea S. aureus y no S. epidermidis o cualquier otro Estafilococo
no patgeno.
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Manual de - MICROBIOLOGIA Equipo 4

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Universidad Veracruzana

Xalapa, Ver. Martes 29 de noviembre de 2016

TERMINOS DESCRIPTIVOS PARA LA MORFOLOGIA DE LAS COLONIAS EN

PRCTICA # 6 TECNICAS DE TINCIN

Se lleva a cabo despus la decoloracin, usando una mezcla de alcohol-acetona,

El Frotis fijado con calor se tie 1 min con Violeta Cristal.

Los frotis una vez teidos se llevaron a observar al microscopio.

E. Coli (Gram negativa)

S. Aureus (Gram positiva)

15 unidades de color verdadero * en

*Unicamente el producido por slidos disueltos en el agua.

Placa con agar soya y tripticaseina:

Una vez sembradas las bacterias se encubaron para ver su crecimiento

puede crecer con grandes cantidades de sal a su alrededor por el tipo de

Como se puede observar en los resultado de la tabal anterior la concentracin de

Ps. Aeruginosa a 37C

Medio de cultivo semislido, altamente nutritivo debido a la presencia de extracto

necesario para la produccin de cido sulfhdrico, el sulfato de hierro y amonio, es

bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de color amarillo a pH igual o menor

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Coagulasa. Permite determinar la capacidad de coagular el plasma por la accin

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