Facultad de Farmacia

Qumica y Farmacia

GUA DE PRCTICO DE INMUNOLOGA

Profesor a cargo del prctico:
Caroline Weinstein
Ayudantes alumnos:
Paula Yob
Pamela Arancibia
Ayudante tcnico: Claudia Bravo
Instrucciones preliminares:
El trabajo prctico consta de 7 mdulos, las parejas de trabajo deben ir
pasando a los diferentes mdulos, siguiendo los procedimientos especificados
para cada tcnica.
1. ELISA de 3 generacin para la deteccin de Anticuerpos contra Trypanosoma
Cruzi.
2. Inmunodifusin radial.
3. Inmunoanlisis de membrana para benzodiacepinas.
4. Prueba directa de aglutinacin en placa para el diagnstico de artritis
reumatoidea.
5. Inmunotipificacin de grupo sanguneo.
6. Inmunoensayo sobre soporte slido para la deteccin de anticuerpos contra
los virus de inmunodeficiencia humana HIV-1, HIV-1 grupo O y HIV-2 (DIA).
7. Western blot. Experiencia demostrativa obligatoria.
Se solicita a los estudiantes colaborar con:
1 muestras de orina (+) benzodiazepina

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MDULO 1
ELISA (Enzime Linked InmunoadSorbent Assay) recombinante
de 3 Generacin para la deteccin de Anticuerpos contra el
Trypanosoma Cruzi (Chagatest)
Cada grupo trabajar sobre tres pocillos para realizar un control positivo, uno
negativo y una muestra problema identificada con un cdigo que debe registrar
en su bitcora de prctico. Deber informar el resultado obtenido para esta
muestra en su informe de prctico.
A) SIGNIFICACIN CLNICA:
La enfermedad de Chagas es una enfermedad producida por el Trypanosoma cruzi. El
diagnstico del laboratorio depende del estado en el que se encuentre la enfermedad.
ELISA es uno de los mtodos inmunolgicos utilizados durante la fase crnica. Se detectan
los anticuerpos contra el parsito, constituyendo por lo tanto una tcnica serolgica.
B) FUNDAMENTOS DEL MTODO: (ver figuras)
1. Tcnica cualitativa, en el soporte se encuentran inmovilizados antgenos
recombinantes, obtenindose un mtodo de 3 generacin. (Estos antgenos se
obtienen por tcnica de ADN recombinante a partir de protenas especficas de los
estadios epimastigote y tripomastigote del T. cruzi, correspondientes a zonas
altamente conservadas entre distintas cepas).
2. La muestra se diluye en el soporte, si la muestra contiene los Ac especficos, stos
formarn un complejo con los antgenos y permanecern unidos al soporte.
3. La fraccin no unida se elimina por lavado tras lo que se agregan anticuerpos antiinmunoglobulina humana conjugados con peroxidasa.
4. Si se produjo la reaccin en la primera etapa del proceso, se unir el conjugado
(anticuerpo secundario ligado a enzima).
5. Luego de un nuevo lavado se agrega el sustrato enzimtico.
6. En los casos en que se haya unido el conjugado habr aparicin de color celeste.
7. La reaccin se detiene con cido sulfrico, con lo que el color celeste vira el amarillo
8. Se lee en lector de placas ELISA a 450 nm.
9. Calcular el lmite de deteccin.

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Policubeta
sensibilizada
Conjugado
Revelador A
Revelador B
Stopper
Buffer de Lavado
Concentrado
Diluyente de
Muestra
Control (+)
Control (-)

REACTIVOS PROVISTOS
Policubeta de tiras mviles con pocillos que contienen
antgenos recombinantes de T. cruzi inmovilizados
Anti- Inmunoglobulina humana (cabra) conjugada con
peroxidasa
Perxido de hidrgeno 60 mmol/L en buffer citrato 50
mmol/L pH 3,2
Tetrametilbencidina (TMB) 0,01 mol/L en
cido
clorhdrico 0,1 N
cido sulfrico 2 N
Cloruro de sodio 1,4 mol/L en buffer fosfatos 100 mmol/L
y tensioactivo no inico 0,1 g/L
Albmina bovina en solucin fisiolgica tamponada con
buffer fosfatos pH 7,2
Dilucin de suero inactivado conteniendo anticuerpos
contra el tripanosoma cruzi.
Dilucin de suero no reactivo, inactivado.

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C) PROCEDIMIENTO:
- Constatar que todos los reactivos y muestras se encuentren a T ambiente.
- Rotular cada uno de los pocillos. En los pocillos a utilizar de la policubeta colocar:
Procedimiento
Control(+)
Control (-)
MP
Diluyente de
200 L
200 L
200 L
muestra
Control (+)
10 L
Control (-)
10 L
Muestra
10 L
MEZCLAR DANDO SUAVES GOLPES EN LOS BORDES DE LAS CUBETAS (10 seg)
Cubrir placas con papel adhesivo provisto
incubar durante 30 minutos en estufa a 37 C
Descartar el lquido de cada pocillo en recipiente para desechos biolgicos (cloro)
USAR PUNTAS DIFERENTES PARA CADA POCILLO
Buffer de Lavado
300 L
300 L
300 L
Lavar 5 veces (esperar 10 seg entre cada lavado)
Despus de cada lavado, el lquido se descartar en recipiente con cloro
Eliminar lquido residual, invirtiendo las cubetas y golpendolas contra toalla
nova. Luego:
Conjugado
1 gota (50
1 gota (50 L)
1 gota (50 L)
L)
MEZCLAR DANDO SUAVES GOLPES EN LOS BORDES DE LAS CUBETAS (10 seg)
Cubrir placas con parafilm
incubar durante 30 minutos en estufa a 37 C
Aspirar el lquido de cada pocillo y descartar en recipiente para desechos
biolgicos (cloro)
USAR PUNTAS DIFERENTES PARA CADA POCILLO
Buffer de Lavado
300 L
300 L
300 L
Lavar 5 veces (esperar 10 seg entre cada lavado)
Despus de cada lavado, el lquido se descartar en recipiente con cloro
Eliminar lquido residual, invirtiendo las cubetas y golpendolas contra toalla
nova. Luego:
Revelador A
1 gota (50
1 gota (50 L)
1 gota (50 L)
L)
Revelador B
1 gota (50
1 gota (50 L)
1 gota (50 L)
L)
Mezclar dando golpecitos durante 10 seg
Incubar a TEMPERATURA AMBIENTE por 30 minutos
Stopper
1 gota (50
1 gota (50 L)
1 gota (50 L)
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L)
Mezclar dando golpecitos durante 10 segundos
Leer en Lector de placas ELISA a 450 nm

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MDULO 2
IDR: Placas de Inmunodifusin radial para la determinacin
de Inmunoglobulinas y otras protenas en lquidos biolgicos

A) PRINCIPIO DEL MTODO:

El procedimiento consiste en una inmunoprecipitacin en agarosa entre un antgeno a
cuantificar y su anticuerpo homlogo. Se realiza incorporando uno de los 2 reactivos
inmunes (generalmente anticuerpo) uniformemente en una capa de agarosa y luego
introduciendo el otro reactivo en pocillos cavados en el gel.
El antgeno difunde radialmente en la mezcla gel-anticuerpo y se forma un disco o anillo
visible en un punto que depende de la relacin estequiomtrica antgeno- anticuerpo. A
medida que ms antgeno difunde, el anillo se redisuelve y reaparece en una distancia
mayor del pocillo. Este aumento en el dimetro de precipitacin contina hasta que
antgeno y anticuerpo reaccionan completamente.
Mientras que el precipitado se est expandiendo (16 20 horas) la relacin entre el
dimetro del anillo y el logaritmo de la concentracin de antgeno es aproximadamente
lineal.
Al completarse la reaccin, la relacin entre el dimetro al cuadrado y la concentracin es
lineal.

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B) PROCEDIMIENTO:
Cada GRUPO siembra en una de las placas de agar disponibles.
1. Abrir la placa (el agar contiene anticuerpo) para permitir que se evapore el exceso
de humedad, si lo hubiera.
2. Sembrar en orificio de la placa: 5 L de muestra problema utilizando micropipeta de
precisin (registre e informe el nmero de la muestra problema). NOTA: debe
tenerse suma precaucin al sembrar, evitando derramar muestra fuera del
pocillo, romper los bordes del mismo o introducir burbujas de aire.
3. Cerrar firmemente la placa
4. Incubar en posicin invertida en cmara hmeda (en este caso refrigerador) por 1620 horas. Conservar entre 2 y 8 C.
5. Registre en la papeleta correspondiente a su placa la posicin en que sembr.
C) LECTURA DE LOS RESULTADOS:
-

Al da siguiente o lunes DEBEN MEDIR LOS DIAMETROS DEL HALO DE DIFUSIN con
una precisin 1 mm. Esto se realiza en el Laboratorio 20 (horario a convenir). No
hacerlo perjudicar la evaluacin de su informe de prctico.
El punto final de la reaccin est indicado por la aparicin de un anillo de
bordes netos. El mismo se alcanza una vez cumplido el tiempo de
incubacin. A partir de ese momento puede efectuarse la lectura, ya que el
halo no aumentar de tamao.

IDR

Interpolar la concentracin en la tabla que se adjunta en la papeleta de las placas de

Mientras ms lejano sea el anillo de precipitacin al sitio de la
siembra, mayor ser la concentracin del analito

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D) Rangos de Referencia

ANALITO

ADULTOS

NIOS

UNIDAD

Inmunoglobulina G

600-1650

560-1500

mg/dL

Inmunoglobulina A

90-400

100-210

mg/dL

Inmunoglobulina M

75-300

40-200

mg/dL

Inmunoglobulina D

1-4.5

mg/dL

C-3

80-160

mg/dL

C-4

20-40

mg/dL

Ceruloplasmina

19-57

mg/dL

Transferrina

210-430

mg/dL

Alfa 1 Antitripsina

121-244

mg/dL

Alfa 2
macroglobulin
a

170-450

mg/dL

Apolipoprotena A1

73-169

mg/dL

Apolipoprotena B

58-138

mg/dL

Alfafetoprotena

0-10

ng/mL

PCR

0,007-0,8

mg/dL

MDULO 3
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Inmunoanlisis de membrana para benzodiazepinas (BZ0)

A) FUNDAMENTO DEL MTODO:

Tcnica de Inmunoanlisis de flujo lateral, sirve para la deteccin cualitativa de
benzodiazepinas (o sus metabolitos) con un cut-off de 300 ng/mL presente en la orina de
humanos.
1. La droga contenida en la muestra de orina compite con el conjugado de la droga
(marcada qumicamente ) que fue impregnada en la membrana de reaccin), por los
sitios limitados del anticuerpo que corresponde a un anti-BZO monoclonal
coloreado oro coloidal.
2. La mezcla se mueve hacia arriba por capilaridad y al pasar por la zona del conjugado
de droga forma una lnea visible entre el anticuerpo complejado y el conjugado. Para
un:
RESULTADO
NEGATIVO

MEMBRANA
Formacin de banda coloreada
de
precipitacin
entre
el
conjugado coloreado y el anticuerpo
complejo anti-BZO.
POSITIVO
Ausencia de banda coloreada en
la regin test, pues
la droga
contenida en la orina al estar en
mayor cantidad que en conjugado lo
desplazar de la reaccin y ocupar
los sitios del anticuerpo, sin dar color
Banda control debe aparecer siempre coloreada
tanto para un test negativo
como para uno positivo

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B) PROCEDIMIENTO:
1. Llevar las muestras a temperatura ambiente.
2. Remover la tira de su envoltorio metalizado tirando del empalme.
3. Transferir 50 L de orina en S, usando la pipeta Pasteur provista en el envase.
4. Esperar que aparezca seal en control + (no ms de 10 min)
5. Registre sus resultados.
Es importante el uso de guantes para realizar el anlisis pues las precauciones
universales sealan que toda muestra biolgica debe tratarse como si estuviera
contaminada.

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MDULO 4 Y 5
Test de Aglutinacin
La unin antgeno-anticuerpo (Ag-Ac) es una interaccin reversible en la que estn
involucrados enlaces no-covalentes. En la interaccin in vitro de un Ag con su
correspondiente Ac se distinguen 2 etapas: la interaccin primaria no visualizable y la
interaccin secundaria, que sigue a la anterior y se caracteriza por la aparicin de un
fenmeno visible como la aglutinacin o la precipitacin. Por otro lado, no siempre que se
produce la interaccin primaria Ag-Ac, se produce la interaccin secundaria, ya que, para
conseguir fenmenos visibles, son indispensables determinadas concentraciones y
caractersticas de los antgenos y anticuerpos.
Reacciones de Aglutinacin
Las reacciones de aglutinacin, involucran una interaccin secundaria entre antgenoanticuerpo (Fig, 2b) que llevar a la aparicin de un aglutinado que se visualiza como
grumos. Los principios fsico-qumicos que gobiernan la formacin de estos aglutinados son
los mismos que gobiernan la formacin de un precipitado. La gran diferencia entre las
reacciones de precipitacin y de aglutinacin son las caractersticas del antgeno: mientras
que en las reacciones de precipitacin se emplean antgenos solubles, en las reacciones de
aglutinacin el Ag o el Anticuerpo es particulado (Fig, 2a).

Con un antgeno soluble, tambin es posible disear una reaccin de aglutinacin gracias a
que es posible utilizar distintas partculas (partculas inertes o eritrocitos) y realizar una
unin qumica del antgeno soluble a dichas partculas, generando de esta manera un
antgeno particulado til para fines diagnsticos. As es posible generar un anticuerpo
particulado ligando a partculas de ltex u oro coloidal, entre otras para generar una
reaccin de aglutinacin.
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Las ventajas de las reacciones de aglutinacin desde el punto de vista de su utilidad en el

laboratorio es que son muy sencillas de realizar, no requieren ningn equipamiento para su
lectura, son rpidas y fciles de implementar. Sin embargo, cabe mencionar, que las
reacciones de aglutinacin presentan menor sensibilidad que las reacciones de interaccin
primaria tales como ELISA e inmunofluorescencia indirecta.

MDULO 4: Artritest directo.

Prueba directa de aglutinacin en placa para el diagnstico
de artritis reumatoidea
A) FUNDAMENTO DEL MTODO:
El factor reumatoideo (FR) de tipo IgM se detecta en presencia de gamma-inmunoglobulina
o fraccin II de Cohn (que en este caso es el antgeno) adsorbida sobre un soporte inerte de
ltex-poliestireno. Este antgeno se une a los FR (anti-IgG) produciendo una aglutinacin de
las partculas de ltex- poliestireno, visible macroscpicamente.
B) PRECAUCIONES:
Los reactivos provistos son para uso diagnstico in vitro. Los controles han sido
ensayados para HIV y HBV, encontrndose no reactivos. No obstante, deben ser empleados
como si se tratara de material infeccioso.
C) PROCEDIMIENTO
1. Llevar los reactivos y las muestras a temperatura ambiente antes de usar. Agitar el
reactivo de ltex antes de usar, vaciando previamente la pipeta del gotero.
2. Agregar 25 L de la muestra o control.
3. Agregar 25 L de reactivo de ltex.
4. Mezclar con un palillo descartable hasta obtener una suspensin uniforme en toda la
superficie del crculo.
5. Inmediatamente disparar un cronmetro, balancear suavemente la placa y observar
macroscpicamente el resultado bajo un haz luminoso dentro de los 2 minutos
siguientes.

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D) INTERPRETACIN DE RESULTADOS
Negativo: Suspensin homognea
Positivo:
Aglutinacin que aparece dentro de los 2 minutos.
Placa de vidrio

C+

MP
+
Andrea Flores-Enrique
Cifuentes

MDULO 5: Determinacin de grupo sanguneo

Prueba directa de aglutinacin en placa
A)
1.
2.
3.
4.
5.

PROCEDIMIENTO:
Limpie su dedo ndice con alcohol.
Pinche su dedo con lanceta utilizando el lpiz porta lanceta.
Deposite cuatro gotas de sangre sobre un portaobjetos, lo ms separadas posible.
Deje caer una gota de suero anti A, anti B, anti AB y anti RH sobre cada gota de sangre.
Mezcle por rotacin de la placa.

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Mdulo 6
Inmunoensayo sobre soporte slido para la deteccin de
anticuerpos contra los virus de inmunodeficiencia humana
HIV-1, HIV-1 grupo O y HIV-2.
A) FUNDAMENTO DEL MTODO:
1. La muestra diluida se pone en contacto con el soporte slido en forma de peine en el
cual se encuentran inmovilizados pptidos sintticos de transmembrana de HIV-1 y
HIV-2.
2. Si la muestra contiene anticuerpos anti-HIV-1, anti-HIV-1 grupo O o anti-HIV-2 se
formar un inmunocomplejo que quedar unido al soporte.
3. Luego de un lavado, se incuba el soporte con un conjugado de protena A-oro coloidal
(Revelador).
4. La protena A se une al fragmento Fc de los anticuerpos. La aparicin de una mancha
rojiza en el lugar donde se encuentran depositados los pptidos sintticos es
indicativo de que se form el inmunocomplejo y por lo tanto de la presencia en la
muestra de anticuerpos anti-HIV-1, anti-HIV-1 grupo O o anti-HIV-2.

Antgeno

REACTIVOS PROVISTOS
Soporte slido en forma de peine, conteniendo
inmovilizados en cada diente pptidos sintticos
de antgenos
de transmembrana de HIV-1 y HIV-2 (parte opaca
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Diluyente de
Muestras
Buffer de Lavado
Revelador
Control (+)
Control (-)

Antgeno
Diluyente de
Muestras
Buffer de Lavado

Revelador
Control (+)
Control (-)

del peine).
Solucin fisiolgica con tensioactivo no inico, pH
7,3.
cloruro de sodio 1,4 mol/l en buffer fosfatos 100
mmol/l y tensioactivo no inico 0,1 g/l.
Protena A de Staphylococcus aureus conjugada con
oro coloidal.
Dilucin
de suero inactivado, reactivo para
anticuerpos anti-HIV.
Dilucin de suero inactivado, no reactivo.
Instrucciones para su uso.
Listo para usar. Al cortar el sobre, tener la
precaucin de no cortar con la tijera los peines o el
sobre con desecante
listo para usar
A baja temperatura los componentes del reactivo
pueden precipitar. En tal caso, colocar en bao de
agua a 37 C unos minutos, mezclando luego por
inversin. Diluir 1+7 con agua destilada (1 parte
Buffer de Lavado concentrado + 7 partes de agua
destilada)
Tener en cuenta que al realizar la tcnica el
Buffer de Lavado se prepara una sola vez y se
utiliza en los dos lavados. Luego, debe
descartarse
la
solucin
agregndole
previamente 5 ml de hipoclorito de sodio al
5%.
Listo para usar
Listo para usar
Listo para usar

B) PRECAUCIONES:
- Todas las muestras de pacientes deben manipularse como si fueran capaces de transmitir
infeccin. Los controles se encuentran inactivados. Sin embargo, deben emplearse como si
se tratara de material infeccioso.
- Los sueros controles han sido examinados para HBsAg, encontrndose negativos. Los
lquidos de desecho pueden ser desinfectados con hipoclorito de sodio (concentracin final
5%) durante por lo menos 60 minutos.
- Si los pocillos de la policubeta no se utilizan en su totalidad, descartar el lquido de los
pocillos utilizados en un recipiente para desechos biolgicos que contenga 5% de
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hipoclorito sdico. Luego golpear la policubeta varias veces sobre papel absorbente que se
descartar como residuo biolgico y lavarla con una solucin alcohlica al 50%.
- El buffer de lavado contiene azida sdica y debe tratarse como residuo qumico peligroso.
C) CONDICIONES DE REACCIN:
- Tiempo total de reaccin: 20 minutos
- Temperatura de reaccin: temperatura ambiente (> 22 C). Si la temperatura ambiente
es menor a 22 C, realizar la reaccin en estufa a 37 C.
- Volumen de muestra: 100 l.
C) PROCEDIMIENTO:
-

Llevar a temperatura ambiente los reactivos y las muestras antes de iniciar la

prueba.
Una vez iniciado el anlisis completarlo sin interrupcin.
Procesar simultneamente control positivo (en el diente del extremo
derecho del peine) y 1 control negativo (en el diente del extremo
izquierdo del peine).

1. Colocar 2 gotas de diluyente de muestras en cada pocillo a utilizar de la

policubeta.
2. En cada uno de estos pocillos colocar 100 l de muestra o controles. (Tener la
precaucin de colocar los mismos en el fondo de los pocillos para asegurarse de no
producir salpicaduras que puedan contaminar pocillos vecinos).
3. Mezclar aspirando con la micropipeta varias veces el contenido de cada pocillo a fin
de asegurar una correcta homogeneizacin.
4. En la hilera de pocillos contigua a la utilizada para las muestras colocar 3 gotas
de revelador por pocillo a utilizar.

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Preparar el buffer de lavado como se explic en INSTRUCCIONES PARA SU USO.

Colocar el buffer de lavado en el recipiente destinado a tal fin, teniendo la
precaucin de no formar espuma. Este recipiente debe permitir que los dientes del
peine queden completamente sumergidos.
- Abrir cuidadosamente el envoltorio y extraer el nmero de peines necesarios para el
ensayo.
- Colocar la identificacin de cada muestra directamente en la parte superior del
diente correspondiente.
Importante: no tocar en ningn momento las zonas reactivas del peine ya
que esto puede ocasionar resultados errneos.
5. Colocar el peine en los pocillos de la policubeta que contienen las diluciones de
muestras y controles e incubar durante exactamente 10 minutos a temperatura
ambiente.
-

6. Extraer el peine de los pocillos y escurrir las puntas de los dientes tocando sobre
papel absorbente. No tocar el papel con la zona reactiva de los dientes.
7. Manteniendo el peine en posicin vertical con los dientes hacia abajo y la zona
reactiva de frente al operador sumergir el peine en el buffer de lavado. El lavado
debe realizarse repitiendo 10 veces un movimiento del peine constante, lento
y suave de adelante hacia atrs, sin tocar con el mismo las paredes del
recipiente.

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8. Escurrir nuevamente las puntas de los dientes como se explic anteriormente.

9. Insertar el peine en los pocillos que contengan el Revelador e incubar a temperatura
ambiente durante exactamente 10 minutos.

10.
Al finalizar la incubacin repetir el lavado como se indic ms arriba,
empleando el mismo buffer de lavado que se usara anteriormente.
11.
Colocar el peine sobre una superficie limpia con la zona reactiva hacia arriba y
dejar secar completamente antes de observar los resultados.
12.
El color de la mancha se intensifica al secarse. Efectuar la lectura de los
resultados bajo luz natural o fluorescente. No emplear lmpara incandescente.

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D) INTERPRETACIN DE RESULTADOS:
Una vez finalizada la prueba y cuando el peine se haya secado completamente, observar
los resultados sobre una superficie blanca, a ojo descubierto y con buena iluminacin.
Muestra Reactiva: Aparicin de una mancha coloreada (rosa tenue a rojo) en la zona
reactiva del peine. Siempre que este crculo est presente, an cuando el color sea de
menor intensidad que el control positivo, indica muestra reactiva.
Muestra No Reactiva: No se observa coloracin en la zona reactiva del peine.

Mdulo 7
Western blot o Inmunoblot
Fundamento
El Western Blot es una tcnica de laboratorio que permite separar e identificar la presencia
o ausencia de protenas especficas de inters. La tcnica consiste en separar una mezcla
de protenas a travs de un gel de poliacrilamida, aplicndole voltaje constante. Estas
protenas son tratadas con SDS, un detergente aninico que denatura la protena y a su vez
les otorga carga negativa, permitiendo que stas migren solo segn su peso molecular; as
mientras ms grande la protena menos movilidad tendr en el gel y mientras ms
pequea, mayor ser su desplazamiento. Luego de separadas las protenas, estas son
transferidas a una membrana que es incubada con anticuerpos especficos (anticuerpo
primario que reconoce el eptopo especfico de la protena especfica), y luego se incuba
con un anticuerpo secundario enlazado generalmente a una enzima que permita revelar la
presencia de la protena de inters.
El SDS-PAGE est formado por dos tipos de geles: el gel compactador (superior) pH 6,8;
cuya funcin es compactar las protenas de la muestra y el gel separador (inferior) pH
8,8; el que separa las protenas. Para polimerizar la acrilamida y formar el gel, se requiere
de la accin de un agente entrecruzador; la bisacrilamida, un agente iniciador y otro
catalizador,
TEMED
(N,N,N,N-tetrametilendiamina)
e
in
persulfato
(S 2O8-),
respectivamente.
Prctico: Mezclar en un tubo de centrfuga los siguientes reactivos.
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Agua ultra pura

Buffer inferior
Buffer superior
SDS 10%
Acrilamida
/bisacrilamida
Persulfato
amonio 10%**
TEMED**

Gel
inferior* L
1650
--1250
50
2000
de 50

Gel
superior L
3025
1250
--50
665

*Preparar primero el gel inferior.

**Persulfato de amonio y TEMED se
agregan al final.
*** Cada gel demora entre 30-45
min en gelificar.

50

Tratamiento de las muestras.

Las muestras deben ser diludas en
proporcin 1:1 con el buffer reductor. Este permite romper los enlaces disulfuro de la
protena, perdiendo as su estructura tridimensional. Para esto se debe preparar en un tubo
de microcentrfuga, 50 L de muestra y 50 L de buffer reductor. Llevar a bao
termorregulado a 95-100C durante 4-5 min. Las muestras estn listas para sembrar en los
pocillos.
Electroforesis: se desarrolla la electroforesis a un voltaje constante de 120 volts. Adems
de las muestras se carga un marcado de peso molecular, adecuado al tamao de la
protena de inters.
Transferencia de las protenas del gel a membrana de PVDF
Se realizar transferencia del tipo semi-seco; se prepara un sndwich en la siguiente
disposicin: papel filtro/membrana de PVDF/gel/papel filtro.
Previamente, la membrana PVDF se sumerge en metanol por 2-3 min, luego se traspasa a
buffer de transferencia 1X durante 5 min. Adems, se humedece 2 filtros en buffer de
transferencia 1x. Transferir durante 1 h a 18 volts.
Bloqueo de membrana e incubacin con anticuerpo
Bloquear la membrana previene la unin no especfica del anticuerpo primario,
disminuyendo el background del posterior revelado.
La solucin bloqueadora consiste 5 g de leche descremada disueltos en 100 mL de buffer
salino Tris-Tween 20 (TBST).
Se incuba por 1 h a 4C bajo agitacin constante. Luego de la incubacin, se lava por 5
segundos con TBTS.
Se agrega el anticuerpo primario en 5% de albmina bovina, y se deja incubando toda la
noche en agitacin constante. Se lava la membrana 3 veces con TBST durante 5 minutos
cada vez.
Se agregar el anticuerpo secundario ligado a fosfatasa alcalina diluido en
leche
descremada 5% disuelta en TBTS, se incuba por 1 hora. Luego se lava la membrana 3
veces con TBTS durante 5 minutos cada vez.
Se prepara la solucin reveladora-sustrato de fosfatasa alcalina- segn las instrucciones del
fabricante y se espera la aparicin de manchas de color prpura.
3

REFERENCIAS
Parrao, P. Primera Gua de Prctico de Inmunologa.
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Facultad de Farmacia
Qumica y Farmacia

Cifuentes, E y Flores, A. Gua de Prctico de Inmunologa. 2010.

Daz, C y Weinstein C. Gua de Prctico de Inmunologa. 2012.
Mahmood T., Chang P. (2012). Western Blot: Technique, theory, and trouble shooting. North
Am J Med Sci 4:429-34.
Manual Bio-Rad. Mini-ProteanII, electrophoresis Cell. Instruction Manual.
Lomonte B. (2009). Tcnicas de laboratorio en inmunologa clnica, 122 pp. Universidad de
Costa Rica.
PAUTA INFORME
Fecha de entrega: 28 de noviembre o 1 de diciembre va electrnica.
Extensin: 2 planas mximo en total por tcnica de tamao carta.
Tipografa: Arial 11, interlineado simple.
Portada: ttulo, integrantes, profesor, ayudantes, fecha de entrega.
CITAS: en el texto, con nmeros o autores.
REFERENCIAS (en formato indicado para tesis)
Debe desarrollar los siguientes elementos para cada mdulo. Puntaje mximo indicado entre
parentsis.
1. ELISA de 3 generacin para la deteccin de Anticuerpos contra Trypanosoma Cruzi.
A) Indique resultados obtenidos para la muestra problema (2,0)
B) Valores de Referencia (1,0)
C) Lmite de deteccin (2,0)
D) Interpretacin de resultados: tcnica y clnica (2,0)
E) Identificar limitaciones del procedimiento (2.0)
F) Explique 2 analitos que pueden ser detectados por ELISA (2.0)
G) Interferencia de frmacos o alimentos (2.0)
2. Inmunodifusin radial.
A) Informe el valor obtenido para el antgeno en estudio (1.0).
( SI EL ALUMNO NO ACUDE A VER SU RESULTADO, SE LE BAJARA LA NOTA)
B) Interpretacin de resultados: tcnica y clnica (2.0)
C) Discuta tcnicas alternativas para evaluar niveles plasmticos de Inmunoglobulinas (2.0)
3.
A)
B)
C)
D)
E)

Inmunoanlisis de membrana para benzodiacepinas.

Esquematice resultados obtenidos. (1.0)
Interpretacin de resultados: tcnica y clnica (2.0)
Explique la utilidad de estos ensayos (2.0)
Seale dos analitos que se determinan con este tipo de anlisis
Interferencia de frmacos o alimentos (2.0)

4.
A)
B)
C)

Prueba directa de aglutinacin en placa para el diagnstico de artritis reumatoidea.

Esquematice resultados obtenidos (1.0).
Interpretacin de resultados (2.0).
Explique la utilidad de estos ensayos (2.0).
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Qumica y Farmacia

5. Inmunotipificacin de grupo sanguneo.

A) Esquematice resultados obtenidos e informe su grupo sanguneo (1.0).
B) Explique los conceptos de donante universal y receptor universal. De acuerdo a su grupo
sanguneo, en qu clasificacin estn? Justifique (3.0).
6. Inmunoensayo sobre soporte slido para la deteccin de anticuerpos contra los virus de
inmunodeficiencia humana HIV-1, HIV-1 grupo O y HIV-2
A) Informe los resultados obtenidos (1.0)
B) Interpretacin de resultados: tcnica y clnica (2.0).
C) Discuta tcnicas alternativas para la deteccin de Ac contra los virus HIV, y realice un cuadro
comparativo (2.0).
D) Investigue el algoritmo que se usa en Chile para establecer el diagnstico de HIV (2.0).
E) Interferencia de frmacos o alimentos (2.0).
7.
A)
B)
C)

Western blot
Presente el ensayo en forma de diagrama (2).
Informe los resultados observados (1).
Explique la aplicacin de western blot en anlis clnico (2).

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