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2.

6 Aislamiento del producto de amplificacin mediante purificacin por columna


La purificacin de DNA es un paso clave en la experimentacin en Biologa Molecular. Los
mtodos de purificacin de DNA se clasifican en dos grandes categoras, segn pretendan
purificar DNA cromosmico o DNA plasmdico. La purificacin de DNA plasmdico es la base de
cualquier experimento de clonacin molecular. El problema principal que hay que resolver es la
separacin del DNA plasmdico y DNA cromosmico. [8]

La calidad de las purificaciones de cidos nucleicos se comprueba rutinariamente mediante


electroforesis en geles de agarosa. Cuando se aplica un campo elctrico a una solucin de
molculas, stas se separan de acuerdo con su tamao y carga neta. Los cidos nucleicos son
polianiones que se mueven hacia el polo positivo. Las molculas y fragmentos de molculas de
cidos nucleicos se separan de acuerdo con su tamao y conformacin, mediante electroforesis
en geles de agarosa. La agarosa es un polmero de residuos alternos de D-galactosa y 3,6anhidro-L-galactosa unidos por enlaces glicosdicos, que forma geles con poros de gran tamao.
Los cidos nucleicos que emigran a mayor velocidad en los geles de agarosa son los que
encuentran menos resistencia en su avance (los de menor tamao y de conformacin ms
compacta). Al gel de agarosa se le aade bromuro de etidio, un compuesto que se une a los
cidos nucleicos y que fluoresce cuando se ilumina con luz UV. El ADN fragmentado dificulta
la amplificacin de productos de PCR de alto peso molecular y afecta la reproducibilidad de las
tcnicas.[8]

Figura 1.- Gel de agarosa para visualizar el ADN purificado.

2.7 Secuenciacin

Las tecnologas de Secuenciacin de siguiente generacin (tambin conocida como


secuenciacin masiva paralela) estn revolucionando la habilidad de detectar diferentes
enfermedades en niveles de genoma, transcriptomico y epigeneticos. Catalogando las
mutaciones, copiando los nmeros de aberraciones y los arreglos somticos en una resolucin de
base par ahora se puede ejecutar en cuestin de semanas. Adems, secuenciacin masivamente
paralela puede utilizarse como un medio para el anlisis transcriptmico imparcial de mRNAs,
pequeos RNAs y RNAs no codificante, metilacin del genoma ensayos y ensayos de
inmunoprecipitacin de cromatina de alto rendimiento. [1]
Durante los ltimos 15 aos, las tecnologas de Sanger de electroforesis secuenciada y basada en
la fluorescencia se han utilizado extensivamente en estudios somticos y los estudios genticos
germinales. Mejoras en la instrumentacin, junto con el desarrollo de la informtica de alto
rendimiento y Bioinformtica ha reducido el costo de la secuenciacin. Sin embargo, aumentos
en el rendimiento de la secuencia de la DNA Sanger se logran mediante el uso de secuenciadores
adicionales en paralelo, debido al requisito de electroforesis o espacios adicionales para la
secuenciacin capilar de cada reaccin.Utilizando los diferentes enfoques, mtodos de
secuenciacin masiva paralela superan la limitada escalabilidad del tradicional mtodo Sanger de
secuenciacin creando micro reactores o fijando las molculas de ADN a ser secuenciadas a las
superficies slidas o granos, lo que para millones de reacciones de secuenciacin en paralelo. La
actual generacin de secuenciadores masivo y en paralelo ha llevado a un salto cuntico en
nuestra capacidad de genomas de secuencia. [2]
Quizs ms importante que el rendimiento de la secuencia proporcionada por esta tecnologa y su
relativo bajo costo en comparacin con los mtodos tradicionales de secuenciacin en el tipo de
datos que genera. En vez de lecturas largas obtenidas por una muestra de PCR amplificado, la
secuencia masiva permite obtener lecturas mas cortas (de 21 a 400 bases par aproximadamente),
pero siendo millones de ellas. [3]
La Secuenciacin de prxima generacin ya ha sido aplicado para volver a ordenar los estudios,
que han llevado a la secuencia del normal completa y genomas afectados de enfermedad de
Alzheimer y este se realiza en cuestin de semanas. Adems de la capacidad de secuencia de
DNA, secuenciacin masivamente paralela puede aplicarse a la secuencia RNA.[7]

El mtodo de secuenciacin de Sanger depende de dideoxynucleotidos (ddNTPs), un tipo de


trifosfatos de deoxynucleoside (dNTPs), que carecen de un grupo de hidroxilo 3 ' y un tomo de
hidrgeno en su lugar. Con estas bases unidas a la secuencia de ADN creciente, terminan la
replicacin pues no pueden unirse a otras bases. Para realizar la secuencia Sanger, uno aade los
primers a una solucin que contenga la informacin gentica que se secuenciara y se divide la
solucin en 4 reacciones de PCR. Cada reaccin contiene una mezcla de dNTP con uno de los
cuatro nucletidos que han sido sustituidos con ddNTP (A,T,G y C). Al final del PCT, cada una
de las 4 reacciones contiene productos de diferentes longitudes. Este es el que se tomara para el
capilar de electroforesis y detectara la secuencia. [4,6]
Ahora para la secuenciacin masiva se toma el mismo concepto de Sanger pero con una
aproximacin diferente, se basa en la tecnologa de secuenciacin por sntesis, donde se sigue la
adicin de nucletidos marcados cuando el ADN es copiado, esto mientras lo hace de forma
masiva y paralela. [5]
Existen diferentes compaas capaces de trabajar este tipo de secuenciacin pero son muy
celosos en cuanto dar la informacin tcnica de como trabaja este tipo de secuenciacin, pues
son mtodos exclusivos y patentados.

Referencias

[1]J. Reis-Filho, "Next-generation sequencing", Breast Cancer Research, vol. 11, no.
3, p. S12, 2009.
[2]E. Pettersson, J. Lundeberg and A. Ahmadian, "Generations of sequencing
technologies", Genomics, vol. 93, no. 2, pp. 105-111, 2009.
[3]J. ten Bosch and W. Grody, "Keeping Up With the Next Generation", The Journal
of Molecular Diagnostics, vol. 10, no. 6, pp. 484-492, 2008.
[4]K. Voelkerding, S. Dames and J. Durtschi, "Next-Generation Sequencing: From
Basic Research to Diagnostics", Clinical Chemistry, vol. 55, no. 4, pp. 641-658,
2009.
[5]M. Fullwood, C. Wei, E. Liu and Y. Ruan, "Next-generation DNA sequencing of
paired-end tags (PET) for transcriptome and genome analyses", Genome
Research, vol. 19, no. 4, pp. 521-532, 2009.
[6]D. Wheeler, M. Srinivasan, M. Egholm, Y. Shen, L. Chen, A. McGuire, W. He, Y.
Chen, V. Makhijani, G. Roth, X. Gomes, K. Tartaro, F. Niazi, C. Turcotte, G.
Irzyk, J. Lupski, C. Chinault, X. Song, Y. Liu, Y. Yuan, L. Nazareth, X. Qin, D.
Muzny, M. Margulies, G. Weinstock, R. Gibbs and J. Rothberg, "The complete
genome of an individual by massively parallel DNA sequencing", Nature, vol.
452, no. 7189, pp. 872-876, 2008.
[7]Z. Wang, M. Gerstein and M. Snyder, "RNA-Seq: a revolutionary tool for
transcriptomics", Nature Reviews Genetics, vol. 10, no. 1, pp. 57-63, 2009.
[8]L. Alejos Velazquez, M. Aragon Martinez and A. Cornejo Romero, "Extraccion y
purificacion de ADN", Analytical Chemistry, vol. 162, pp. 156-159, 2016.

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