Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra

Ano Lectivo 2007/2008

Disciplina de BIOQUMICA I
Curso de MEDICINA
1 Ano

ENSINO PRTICO E TEORICO-PRTICO

8 AULA PRTICA

Determinao da actividade enzimtica de colinesterases

Cintica enzimtica
As enzimas catalizam a maior parte das reaces das vias metablicas celulares
(anablicas e catablicas) que permitem a manuteno da sobrevida dos organismos. Com
a excepo de um pequeno grupo de molculas de RNA com actividade cataltica, todas as
enzimas so protenas.
As enzimas catalizam as reaces celulares, aumentando a sua velocidade, sem no
entanto afectarem o equilbrio da reaco (a constante de equilbrio da reaco, Keq,
mantida). Para tal, as enzimas diminuem a energia de activao das reaces. As reaces
catalizadas pelas enzimas ocorrem em locais especficos como o centro activo, um
processo energeticamente favorvel. Geralmente, o substrato liga-se enzima (por
interaces no-covalentes) ao nvel do centro activo. A formao de um complexo
substrato-enzima fundamental para a actividade enzimtica.
Assim, uma reaco enzimtica simples pode representar-se por:
E + S ES E + P ,
em que, E, S e P, representam, respectivamente, a enzima, o substrato e o produto.

A actividade das enzimas pode ser regulada atravs de cofactores ou coenzimas,

componentes que se ligam enzima (em locais diferentes do centro activo) e sem os quais
a enzima no funciona. Um cofactor que se liga enzima covalentemente designa-se por
grupo prosttico.

A velocidade inicial (V0) de uma reaco pode ser relacionada com a concentrao
de substrato, tal como representado pela curva hiperblica da Fig. 1A e pela equao de
Michaelis-Menten:

(i)

Vmax[S]
V0 =
Km + [S]

em que, V0 a velocidade inicial da reaco, Vmx a velocidade mxima da reaco, [S]

a concentrao de substrato e Km a constante de Michaelis-Menten. Km definido pelo
valor da concentrao de substrato para o qual a V0 metade da Vmx. A um valor de Km
mais baixo corresponde uma maior afinidade da enzima pelo substrato, uma vez que
necessria uma menor concentrao do substrato para se obter o mesmo valor de V0.

A equao de Michaelis-Menten (i) pode ser transformada na equao de

Lineweaver-Burk, e respectivo grfico (Fig. 1B), permitindo determinar com preciso os
valores de Km e Vmx de uma determinada reaco enzimtica.

Assim, a partir do inverso da equao de Michaelis-Menten (i) teremos:

Km + [S]

(ii)

, em que

1/V0 =
Vmax[S]
Km

(iii)

[S]

1/V0 =

Vmax[S]
(iv)

1/V0 =

Km
Vmax

Vmax[S]

[S]

(y = ax + b)

Vmax

B
1

V0

slope =

V0

V0 = Vmax

Km
Vmax

1
Vmax

Vmax
1
-1

Km

[S]

[S]

Km

Fig. 1- Representao da cintica enzimtica de acordo com a equao de Michaelis-Menten (A) e

atravs do grfico de Lineweaver-Burk ou de duplos inversos (B).

As colinesterases
Nos tecidos dos mamferos existem mltiplas colinesterases (enzimas que catalizam
a hidrlise de steres de colina) que no so especficas. Curiosamente, o interesse da sua
utilizao clnica no tem tido um paralelismo com o conhecimento da sua funo
fisiolgica, tal como acontece com a enzima fosfatase alcalina.
Nos vertebrados tm sido definidas duas actividades hidrolticas da acetilcolina:

1. Acetilcolinesterase
A acetilcolinesterase (colinesterase verdadeira ou esterase I da colina)
responsvel pela degradao da acetilcolina nas junes neuromusculares ou nos terminais
nervosos de neurnios da matria cinzenta do crebro e, ainda, em tecidos reconhecidos
como no-colinrgicos, tais como as estruturas hematopoiticas, os eritrcitos, os pulmes
e o bao, onde se desconhece a sua funo.
A biossntese da acetilcolina faz-se a partir da colina e da acetil-CoA por aco da
enzima colina acetiltransferase. A degradao da acetilcolina faz-se por hidrlise catalizada
pela acetilcolinesterase, de que resulta a colina e o cido actico (acetato). Na Fig. 2 est
representada a neurotransmisso colinrgica.

Fig. 2- Terminal nervoso colinrgico ao nvel do sistema nervoso central. A enzima colina
acetiltransferase responsvel pela sntese da acetilcolina, enquanto a acetilcolinesterase cataliza a
hidrlise daquele neurotransmissor.

2. Butirilcolinesterase
A butirilcolinesterase (acil-hidrolase das acilcolinas ou esterase II da colina)
encontra-se no plasma sanguneo, no fgado, no pncreas, no corao, na matria branca
do crebro e em quase todos os tecidos, excepto nos eritrcitos.
Desconhece-se o significado fisiolgico desta enzima, mas a determinao da sua
actividade tem uma importncia clnica muito grande ao nvel, por exemplo, da deteco da
inibio toxicolgica (ex. por insecticidas) e como marcador de insuficincia heptica.

Interesse clnico da determinao plasmtica das colinesterases

A determinao da actividade das colinesterases permite avaliar a funo heptica,

uma vez que o fgado muito rico em colinesterases. Tambm permite avaliar a intoxicao
por alguns insecticidas, pois estes diminuem no-competitivamente a sua actividade. A
determinao da actividade da butirilcolinesterase pode ainda ser til no diagnstico de
certos tumores malignos, asma brnquica e a tuberculose pulmonar.
As actividades plasmticas da acetilcolinesterase e da butirilcolinesterase podem ser
alteradas

pelas

hormonas

sexuais.

Na

juno

neuromuscular,

actividade

da

acetilcolinesterase afectada pela testosterona e pela insulina.

Mtodo de determinao da actividade das colinesterases

O iodeto de acetiltiocolina e o iodeto de butiriltiocolina so os substratos da

acetilcolinesterase e da butirilcolinesterase, respectivamente, usados no protocolo desta
aula prtica. O produto corado formado (tiocolina) reage com o cido 5-5-ditiobis-(2nitrobenzico) ou DTNB tambm designado por reagente de Ellman, um reagente dos
grupos tiol (-SH), formando um composto corado de amarelo (5-tio-2-nitrobenzico ou TNB).
A actividade colinestersica expressa-se em Unidades Internacionais (nas condies
do ensaio, 1U = 1mol x min-1 x mL-1) e calcula-se atravs da variao da absorvncia ao
longo do tempo em relao ao respectivo tubo referncia, que contm um inibidor especfico
para cada uma das colinesterases.
O BW284C51 um inibidor especfico da acetilcolinesterase; a etopropazina
inibidor da butirilcolinesterase.

Ano Lectivo 2007/2008

BIOQUMICA I
1 Ano
PROTOCOLO DE BANCADA - 8 AULA PRTICA

Procedimento experimental para determinao da actividade da acetilcolinesterase e

da butirilcolinesterase no plasma:

Grupos 1 e 2- Determinao da actividade da acetilcolinesterase (AcE) no plasma:

Reagentes
Tampo
DTNB
Etopropazina
BW
Amostra
Substrato

Referncia
2,5 ml
100 l
50 l
50 l
200 l
Incubar 5 min
100 l

Ensaio
2,55 ml
100 l
50 l
-200 l
100 l

Seguir a variao da absorvncia a 412 nm durante 5 minutos.

Absorvncia t0

Absorvncia t3

A/min

Grupos 3 e 4- Determinao da actividade da butirilcolinesterase (ButE) no plasma:

Reagentes
Tampo
DTNB
Etopropazina
Amostra
Substrato

Referncia
2,73 ml
100 l
50 l
20 l
Incubar 3 min
100 l

Ensaio
2,78 ml
100 l
-20 l
100 l

Seguir a variao da absorvncia a 412 nm durante 5 minutos.

Absorvncia t0

Absorvncia t3

A/min

NOTA: A actividade plasmtica da acetilcolinesterase muito baixa comparativamente

butirilcolinesterase, pelo que no h necessidade de a inibir no ensaio da
butirilcolinesterase.

CLCULOS
Determinar a variao de absorvncia/minuto (A/min) para cada amostra:
9

Vol ensaio (ml) x 10 x A/min

Actividade (U/l) = -------------------------------------------------Vol amostra (l) x
3

-1

-1

Nota: =13,6x10 M cm
(coeficiente de extino molar do 5-tio-2-nitrobenzico, TNB, a 412 nm, pH=8,0)

VALORES NORMAIS no Plasma:

AcE: 10,4 3,0 U/l
ButE: 5,0 2,1 kU/l