SPPS Manual Procedimentos:

MONTAGEM:

Descartar guas-mes anteriores

Ir buscar uma nova ponta amarela (h 2 tipos, preciso ver
qual encaixa melhor)
Cortar a ponta amarela para se adaptar seringa
Ir buscar uma nova seringa (de 10 mL) e papel de alumnio
Cortar o filtro com um adaptador metalizado > fazer muita
fora
Introduzir o filtro na seringa com a ajuda do embolo e
pressionar com uma esptula nas laterais para garantir que fica
bem colocado
Ligar a montagem mangueira
Ir buscar uma vareta/agitador de teflon de tamanho mdio

INCHAR A RESINA:

Definir os parmetros abaixo e fazer os clculos

o Funcionalizao da resina (ex.: 0,38 mmol/g)
o Escala de sntese (ex.: 0,20 mmol)
Escala de sntese 0,20
m ( resina a pesar )=
=
=0,5263 g
Funcionalizao 0,38

Retirar a resina do congelador um pouco antes de a usar, para

que v aquecendo (congelador; gaveta 5)
o Ex.: Rink amide MBHA resin LL (100-200 mesla) CAS:
431041-83-7
Pesar diretamente para a seringa (num copo) APONTAR A
MASSA PESADA
Montar novamente
Juntar DMF at meio e agitar de vez em quando durante 30 min
Filtrar o DMF (fechar a torneira da mangueira antes de a abrir a
torneira do vcuo para fechar o sistema)
Juntar DCM at meio e agitar de vez em quando durante 30 min
Filtrar o DCM

NOTA: aproveitar os tempos de filtrao para fazer os clculos dos

aminocidos!!

DESPROTEGER A RESINA (-Fmoc):

Juntar soluo de piperidina 20% em DMF (j preparada) at

cobrir toda a resina
Filtrar
Juntar novamente piperidina e agitar de vez em quando por 20
min
Filtrar

Fazer
o
o
Fazer

sucessivas adies e filtraes de:

3x DMF
3x DCM
o teste da ninidrina (desprotegido cor azul)

NOTA: no deixar muito tempo na forma desprotegida proceder ao acoplamento

e parar, de preferncia, nesse ponto.

TESTE DA NINIDRINA:

Usar LUVAS!!
Num tubinho colocar uma pequena amostra de resina
Juntar:
o 6 gotas da soluo A
o 2 gotas da soluo B
Incubar na estufa a 100C por 2-3 minutos
Verificar mudana de cor
Lavar tubinho e passar bem por acetona

ACOPLAMENTO DE AMINOCIDOS:

Num frasquinho, pesar o Fmoc-AA-OH pretendido e o agente de

acoplamento (normalmente o HBTU)
Adicionar um pouco de DMF para ajudar a dissolver
Juntar o volume necessrio de DIEA ao frasquinho (usar a pipeta
graduada e a pompete prprias)
Adicionar mais um pouco de DMF, se necessrio (ou at DCM)
Ressuspender bem com uma pipeta de Pasteur (se no
dissolver bem, usar o sonicador)
Adicionar a mistura resina
Agitar frequentemente durante 1 hora
No final, filtrar e efetuar lavagens sucessivas de
o 3x DMF
o 3x DCM
Fazer o teste da ninidrina
Proceder desproteo (ou deixar acoplado, caso seja para
parar a sntese por longos perodos de tempo)

NOTA: medida que vai aumentando o tamanho do pptido, preciso insistir na

agitao continua, para evitar o enrolamento do pptido e a sua deposio na
seringa.

Em caso de desproteo incompleta:

- Fazer 2 tentativa com piperidina 20% durante 10 min
- No resultando, passar por piperidina a 50% durante 10 min
Inchar a resina por mais tempo (>30 min) pode ajudar a desenrolar
o pptido

CLIVAGEM:

Pesar o pptido mais resina para tubos de Falcon: cerca de

100mg/tubo
Dependendo do n de Falcons obtidos prepara-se o cocktail de
clivagem sem tiis (aprox. 1 mL por cada 100 mg fazer a
mais):
o 95% TFA (cido trifluoroactico fumega muito!)
o 2,5% gua desionizada
o 2,5% TiS (triisopropilsilano est no frigorifico)
Transferir aprox. 1 mL para cada tubo e pr em agitao
durante 2 horas
Ligar a centrifuga aps as 2 horas, para que v arrefecendo
Filtrar a resina para um Falcon grande

NOTA: primeiro lavar o funil com TFA para um Falcon grande e depois trocar de
Falcon para receber o filtrado!

Guardar o funil parte, para o caso de no ter clivado bem

Dividir o volume total que ficou no filtrado por Falcons pequenos
(aprox. 1 mL por tubo)
Perfazer com ter gelado em volumes iguais
Guardar no congelador para que precipite 30 min ou mais
Centrifugar (5 min)
Repetir o processo de adio de ter + centrifugao 1x (ou
mais, se necessrio), retirando sempre o sobrenadante para um
matraz
Armazenar os tubos de Falcon no exsicador, sob vcuo
Retirar quando estiverem secos

NOTA: num dos tubos juntar 1,5 mL de CH3COOH 10% e dissolver bem, para fazer
uma anlise por HPLC e LC-MS.

HPLC:

Verificar se tem eluente nos frascos

Verificar se o frasco dos restos no est cheio
Ligar o computador (password: Et10nam1da)
Abrir o programa EZChromElite
Ligar os botes do HPLC (de cima para baixo)
Clicar em HPLC-DAD (username: Nuno Vale; password: rioave)
Control>Instrument Status>Manual Set
Alterar o flow rate para 1 mL/min e o solvente B a 100% para
lavar a coluna com 100% ACN a presso chega a cerca de 40

Alterar o solvente B para 0% (solvente A, H 2O + TFA fica

automaticamente a 100%) a presso chega a cerca de 120
NOTA: isto se for para fazer uma corrida de 0-100 ACN (estabiliza-se sempre a
coluna com a menor percentagem de ACN com que vamos trabalhar)

Escolher
a
sequencia
que
vamos
usar
em:
File>Sequence>Open>Escolher ficheiro antigo que se saiba ter
o mtodo pretendido (ex.: Anlise 28Jan2016-CA ou
Pptidos
Na tabela que aberta, verificar os seguintes parmetros:
o Vial: posio 200 (mudar consoante o local onde se coloca
o vial)
o Volume: 30 L (se a amostra for muito concentrada
mudar para 20; se for muito diluda, mudar para 40)
o Sample ID: escrever nome da amostra
o Method: normalmente j est correto (0-100%ACN)
o Filename: apagar 1 o que estiver escrito>botao
direito>Fill down>Sample ID vai assumir o nome dado
em Sample ID
Em cima, clicar em Sequence Run>Range>Escolher linha da
tabela que queremos pr a correr>Ok
No final, para ver o cromatograma, usa-se o modo offline
(inserir novamente a password: rioave)
File>Data>Open>Escrever nome do ficheiro pretendido
Antes de desligar o HPLC, necessrio lavar a coluna com
100% ACN (para que fique menos saturada, com menor
presso)
Fechar janelas>Desligar botes de baixo para cima>Fechar o
programa>Desligar o PC

PURIFICAAO NO MPLC:

Aps definido o eluente a utilizar (por HPLC), preparar em

garrafas sempre com menos 5% do que os valores definidos
o Ex.: 20-50% ACN (HPLC) 15-45% ACN (MPLC)
Preparar o 1 eluente
o Volume total do eluente menos concentrado de 800 mL
600 mL + 200 mL extra para a estabilizao da coluna

Ex: 800 mL x 15% ACN 120 mL ACN, 680 mL H2O + 0,05%

TFA (0,400 mL)

Adicionar ao lado esquerdo do recipiente com a torneira

fechada! + Agitao
Baixar o filtro do eluente (retirado, j no existe), ligar a bomba
(POWER+ START+ Regular PRESSO) e recolher at 200 mL
para um matraz (estabilizao da coluna)
o No inicio preciso aumentar bastante o fluxo para tirar o
ar acumulado nas tubagens.
Enquanto a coluna est a estabilizar, preparar o 2 eluente
o Volume total do eluente mais concentrado de 600 mL

Ex: 600 mL x 45% ACN 270 mL ACN, 330 mL H2O + 0,05%

TFA (0,300 mL)

Acidionar ao lado direito do recipiente, com a torneira fechada!

Solubilizar o pptido em H2O ou CH3COOH 10%, sem ultrapassar
um volume mximo de 6 mL (idealmente 4 mL)
Preparar uma rack de tubos para a recolha
Aps recolher 200 mL de eluente, parar o fluxo (STOP +
POWER)
Com uma seringa, recolher o solvente que est na parte
superior da coluna e descartar para o matraz
Usar a mesma seringa para adicionar o pptido solubilizado
coluna (aplicar gota a gota para no danificar a coluna)
Se quiser, lavar o tubo de Falcon com H2O e juntar coluna
Reiniciar todos os aparelhos:
o Recolha de tubos automtica (boto atrs do aparelho +
START)
o Detetor (boto atrs do aparelho)
o Registador (boto lateral + remover tampinha do
marcador + 2 botes)
o Bomba (POWER + START) aumentar a presso no inicio,
mas cuidado com o volume de eluente nos tubos; depois
ajustar para que recolha meios tubos
o Autozero no detetor
o Agitao
Aps a recolha de 10 tubos, abrir a torneira para que os
eluentes se misturem
Acompanhar a purificao com analises no HPLC

NOTA: caso o eluente no chegue para terminar para terminar a

purificao, acrescenta-se ACN do lado direito para que o pptido saia
mais depressa.

PURGAR O SISTEMA NO HPLC:

Rodar a torneira do HPLC (em baixo)

Purgar A e B (em Instrument Status)
Estabilizar coluna