Estudio global del patrn de protenas citoplasmticas de Oenococcus oeni en

presencia de etanol
Nair Olgun*1,2, Marie Champomier-Vergs2, Patricia Anglade2, Fabienne Baraige2, Isabel Araque1, Albert
Bordons1, Cristina Reguant1, Monique Zagorec2
1 Dept.

Bioq.. y Biotecnol., Univ. Rovira i Virgili, Tarragona, Espaa. Tel. 977 558 853. ntolguin@gmail.com
Unit Flore Lactique et Environnement Carn UR309, INRA, 78350 Jouy-en-Josas, France.

Resumen
Oenococcus oeni es la principal especie involucrada en la fermentacin malolctica (FML), la cual en ocasiones se puede
desarrollar espontneamente. Sin embargo, tambin se recurre al uso de cultivos estrteres con el objetivo de tener un mayor
control sobre la misma. No obstante, la induccin de la FML no es siempre exitosa debido a la prdida de viabilidad de las
clulas inoculadas, las cuales se ven afectadas por las condiciones del medio (porcentaje de etanol, SO2, pH, etc.). Para poder
mejorar el proceso de seleccin de cepas destinadas a la produccin de cultivos estrteres, es necesario comprender los
mecanismos involucrados en la adaptacin celular a las condiciones del vino. El objetivo de este trabajo fue evaluar la evolucin
de la sntesis de protenas citoplasmticas de O. oeni PSU-1 durante su crecimiento en presencia o ausencia de etanol
utilizando la electroforesis en dos dimensiones (2D), como tcnica a nivel protemico.
Palabras clave: Oenococcus oeni, fermentacin malolctica, electroforesis 2D, protemica, adaptacin celular.

1. Introduccin
La fermentacin malolctica (FML) es un proceso microbiolgico muchas veces deseado en el
vino debido a que disminuye la acidez total, incrementa la estabilidad microbiolgica y mejora la calidad
organolptica general como consecuencia de la aparicin de compuestos beneficiosos derivados de las
distintas rutas metablicas [1].
Se sabe que Oenococcus oeni es la principal bacteria responsable de la FML y aunque la misma
puede desarrollarse espontneamente, en ocasiones se recurre al uso de cultivos estrteres con el
objetivo de tener un mayor control sobre la misma. No obstante, la induccin de la FML no es siempre
exitosa debido a la prdida de viabilidad de las clulas, las cuales se ven afectadas por las condiciones del
medio (porcentaje de etanol, SO2, pH, etc.). Por ello, es necesaria la optimizacin de los cultivos
iniciadores de la FML, as como su desarrollo en el vino. Para conseguirlo, es imprescindible un mayor
conocimiento sobre las complejas interacciones que existen entre la bacteria y el medio en el cual se
desarrolla.
Algunos trabajos han examinado los efectos del etanol sobre las clulas de O. oeni hallando que
el mismo acta provocando un desorden en la membrana citoplasmtica [3,4]. De la misma forma, se han
encontrado alteraciones en los patrones protenicos tanto citoplasmticos como a nivel de membrana y
pared celular al someter a las clulas a distintas concentraciones de etanol [4].
El objetivo de este trabajo fue evaluar la evolucin de la sntesis de protenas citoplasmticas de
O. oeni PSU-1 durante su crecimiento en presencia o ausencia de etanol utilizando la electroforesis en dos
dimensiones (2D), como tcnica a nivel protemico.

2. Materiales y Mtodos
2.1. Condiciones de crecimiento
O. oeni PSU-1 fue cultivada a 30C en frascos de 2 litros conteniendo el medio MRS lquido
suplementado con cido DL-mlico (8 g l-1) y fructosa (5 g l-1) a pH5. Cuando los cultivos alcanzaron una
DO600nm 1 (fase exponencial avanzada), fueron separados en dos frascos estriles. Inmediatamente, se
aadi 12% (v/v) de etanol a uno de los frascos y 12% de agua al otro. El desarrollo de la poblacin fue
determinado mediante absorbancia a 600nm, as como tambin mediante el recuento de viables en medio
MRS slido suplementado. El mismo proceso se realiz con cada uno de los tres cultivos independientes.
2.2. Anlisis de las muestras
Se tomaron muestras de cada cultivo (con etanol o agua) a diferentes tiempos (1, 3 y 5 h). Una
muestra correspondiente a tiempo 0 h fue tomada a partir del frasco de 2 l previo a la adicin de
etanol/agua. Cada muestra fue centrifugada y resuspendida en Tris-HCl 10mM, pH8 y congelada a -80C
hasta el momento del anlisis. Posteriormente, se obtuvieron los extractos celulares a partir de los pellets
y se procedi al anlisis de protenas totales segn lo descrito por Snchez y col. [2]. El anlisis de imagen
fue realizado utilizando Prodigy SameSpots software (Nonlinear Dynamics), considerando al menos 3
imgenes de cada tiempo y condicin. Se tom el tiempo 0 h como imagen de referencia a partir de la cual
se compar el volumen de los spots en cada condicin y en cada tiempo. Se consider una diferencia en
la cantidad de protena cuando la media del volumen de cada spot a partir de los triplicados vari al menos
2 veces y con un nivel de significancia de P < 0.05.
3. Resultados y Conclusiones
3.1. Crecimiento de O. oeni en presencia de etanol
Con el objetivo de comprobar la diferencia en el desarrollo de la poblacin en cada condicin, as
como la cantidad de clulas a partir de las cuales se obtendra el extracto protenico, se obtuvieron
medidas de absorbancia y viabilidad. Los datos de viabilidad muestran una disminucin de alrededor de
102 UFC ml-1 en dicha muestra con respecto a la condicin agua. La poblacin inicial de 1x1010 UFC ml-1,
llega a valores de 1.3x1010 UFC ml-1 en presencia de agua y 1.2x108 UFC ml-1 en presencia de etanol a las
5 h de cultivo.
3.2. Evolucin de la sntesis proteica
Para comprender los mecanismos involucrados en la respuesta al shock etanlico, se estudi la
evolucin de la sntesis de protenas luego de aadir 12% de etanol a una poblacin de O. oeni a fin de
fase exponencial de crecimiento. Se tomaron dos tipos de muestras como patrones de referencia o
blancos: i) tiempo 0 h (antes de aadir etanol), y ii) realizando el mismo tratamiento a un cultivo al cual se
le agreg 12% de agua. De esta forma, se pudo comparar tanto la cintica de la sntesis proteica en cada
una de las dos condiciones, como la diferencia entre una condicin y la otra en cada punto de muestra.

Figura 1. Comparacin de los geles obtenidos a tiempo 3h: A, en presencia de agua; B, en presencia de etanol.

De la misma forma, comprobamos poca variacin de la sntesis proteica cuando se realiz el

anlisis cintico en MRS (12% agua), slo 3 spots tuvieron una variacin significativa (Fig 2A). Por otro
lado, a partir de las muestras tomadas en presencia de etanol, observamos que tras el shock etanlico 49
spots se tuvieron una expresin diferencial significativa (Fig 2B). La mayora present un patrn similar:
menor expresin luego de una hora y estabilizacin posterior (Fig 3). Estos spots sern identificados con el
objetivo de conocer qu funciones varan tras el shock etanlico.

Figura 2. Resultado del anlisis de imagen: A, en presencia de agua; B, en presencia de etanol.

A partir de los geles obtenidos, inicialmente se contrastaron aquellos pertenecientes a las

muestras en presencia de etanol con los geles pertenecientes a las muestras en presencia de agua (Fig
1). En cada uno de los tiempos comparados, se observ una diferencia significativa en cuanto al volumen
de los spots. Es decir que existe una diferencia en cuanto a la sntesis de protenas en O. oeni cuando se
encuentra en presencia de etanol.

Figura 3. Evolucin de la expresin proteica en presencia de etanol. Se han tomado 5 spots a modo de ejemplo (ID = nmero de identificacin
arbitrario segn el software utilizado).

4. Bibliografa
[1] Ribreau-Gayon, P.; Dubourdieu, D.; Donche, B. ; Lonvaud, A. 1998. 1. Microbiologie du vin. Vinifications. En : Trait
dnologie. Ed. La Vigne, Dunod. Paris. ISBN : 9782100037667.
[2] Snchez, B.; Champomier-Vergs, M.C.; Anglade, P.; Baraige, F. ; de los Reyes-Gaviln, C.G. ; Margolles, A. ; Zagorec, M.
2005. Proteomic analysis og global changes in protein expression during bile salt exposure of Bifidobacterium longum
NCIMB 8809. J. Bacteriol. 187(16): 5799-5808.
[3] Da Silveira, M.G.; San Romao, M.V.; Loureiro-Dias, M.C.; Rombouts, F.M.; Abee, T. 2002. Flow cytometric assessment of
membrane integrity of etanol-stressed Oenococcus oeni cells. Appl. Environ. Microbiol. 68: 6087-6093.
[4] Graa Silveira, M.; Baumgartner, M.; Rombouts, F.M.; Abee, T. 2004. Effect of adaptation to ethanol on cytoplasmic and
membrane protein profiles of Oenococcus oeni. Appl. Environ. Micorbiol. 70(5): 2748-2755.

5. Agradecimientos
Este trabajo ha sido financiado por el proyecto AGL2006-03700ALI del Ministerio de Educacin y Ciencia. Nair Olgun agradece
a la Generalitat por su beca predoctoral. Tambin agradece el apoyo y colaboracin del Dr. Christian Beauvallet durante el
desarrollo de este trabajo.