Structura Acizilor Nucleici Notiuni introductive Genetica umana studiaza ereditatea si variabilitatea fiinjelor umane. Ea este o stiinta fundamentala si aplicativa, care are un rol major in teoria si practica medicala. Genetica umana este 0 disciplina fundamentala deoarece studiaza structurile, mecanismele si legile de baza ale stocarii, transmiterii si expresiei informatiei ereditare pentru formarea, dezvoltarea si functionarea organismului uman. Genetica umana are un rol important pentru baza conceptuala a medicinii deoarece ofera © noua perspectiva medicinii modeme. dominata de biologia moleculara a celulei, genetica si imunologie. Genetica umana este disciplina clinica deoarece studiaza relatia dintre ereditate si boala sau, mai exact, rolul mutatiilor in producerea bolilor sau predispozitiei la boala Se cunose peste 19.000 de boli determinate sau conditionate genetic, care afecteaza 5-8% din nou-nascuti; ele au o mare diversitate si se regasesc in aproape toate specialitatile medicale. Genetica medicala - ca parte a geneticii umane - se ocupa de diagnosticul si ingrijirea pacientilor cu boli genetice precum si de familiile lor, prin sfat genetic. diagnostic prenatal. screening neonatal sau diagnostic presimptomatic. Relatia genotip-fenotip Prin genotip se intelege structura genetica unica si caracteristica unui individ, care se stabileste in momentul fecundari si ramane stabila in cursul dezvottari Prin termenul de fenotip se defineste totalitatea caracterelor manifeste si unui organism determinate de interactiunea genotipului cu mediul in care traieste ace! organism. Dependent de ereditate si mediu fenotipul este variabil, se poate schimba. Relatia dintre genotip si fenotip isi dezvaluie intreaga sa semnificatie atunci cdnd este analizata la nivel molecular. Termenul de genotip poate fi substituit prin insasi substratul material al genelor: molecula de ADN Caracterele fenotipice sunt determinate de proteine structurale (colagen, oseina, elastina, hemoglobina, etc) sau enzime. in acest fel relayia genotip - fenotip devine: ADN ~- PROTEINE, se traduce prin ideea fundamentala ca ADN detine si exprima informatia necesara pentru sinteza proteinelor, ce constituie suportul biochimic al caracterelor ereditare ale organismului pecifice ale Relatia ADN - proteine Expresia informatie? ereditare nu se face direct; ea este copiata prin procesul de transcriptie intr-o molecula de ARNm, care trece in citoplasma , unde are loc sinteza proteinei (translatie):Informafia genetica din molecula de ADN se poate transmite (conserva) in suecesiunea generatiilor, prin replicare semiconservativa, formindu-se molecule de ADN identice; fiecare element si etapa a relatiei poate fi influentata de mediu.ADN. ARN ADN -ul este molecula esentiala a vietii, care codifica si regleaza structura si functiile celulare, Trasaturile (caracterele) ereditare se caracterizeazA prin capacitatea de a se transmite de la o generatie la cealalta, Setul complet de informatie genetica dintr-un organism poarta numele de genom In 1865 Gregor Mendel a introdus pentru prima oara notiunea de gena/factor ereditar: fate de baza responsabila pentru detinerea si transmiterea a unei caracteristici unice. Initial s-a crezut ca proteinele poarta informatia genetica, pina la mijlocul secolului XX, id s-a descoperit ca ADN-ul este baza ereditatii, datorita faptului ca este capabil de auto-replicare. In anul 1953 James Watson si Franeis Crick (premiul Nobel , 1962) au propus un model al moleculei de ADN alcatuit din 2 catene polinucleotidice, legate complementar prin bazele azotate, infasurate intr-o elice dubla, rasucita spre dreapta. Acizii nucleici indeplinesc doua functii biologice majore: transmit informatia ereditara de la 0 generatie la alta - contin informatie pentru producerea de proteine specifice @ ADN Sediul principal al localizarii ADN-ului este nucleu! celulelor. Sediu secundar: mitocondriile @ ARN Diferitele tipuri de ARN sunt localizate in nucleu, citoplasma, mitocondrii, ribozomi Dogma centrala a geneticii Propusd de catre Francis Crick in 1958 pentru a descrie fluxul informafiei genetice in celuli.Informatia depozitatd in ADN este transferati ARN-ului (transcriptie), care mai departe o transferd proteinelor (translatie) Dogma Centrala propusi de Crick a suferit numeroase rev i in ultimii 50 de ani. ADN + ARN + proteine Transcriere Translatie transcrierea = transferul informatie geneti matrita de ADN) translatie = transferul informatiei genetice de la ARN la proteinele functionale, a caror seeventa de aminoacizi este codificata in structura ADN-ului replicarea = transferul informatiei genetice de la celula mama la celulele-fiice prin copierea ADN-ului parental cu formarea a doua molecule de ADN cu structura identica ADN-ului parental de la ADN la ARN (sinteza de ARN peDogma centrala revizuita Recombinarea~ rearanjarea materialului genetic Mutajii/Reparare = lezarea ADN ew alterarea informatiei genetice/ corectarea leziunilor ADN Revers- transcrierea = transferul informajiei genetice de la ARN la ADN Acizii nucleic Acizii nucleici sunt polinueleotide (produsi de policondensarea unor unitaji denumite nucleotide). Nucleotidele reprezinta unitatea monomerica a acizilor nucleici si sunt compuse din: = 0 baza azotata heterociclica: ine: adenina (A) si guanina (G) ne: citozina (C) si timina (T) pentru ADN citozina (C) si uracil (U) pentru ARN = 0 pentozi: = dezoxiriboza (este prezenta in ADN) = riboza (este prezenta in ARN) - fosfat Unitatea structurala fundamentala a ADN - dezoxiribonucleotidul baza azotata + dezoxiriboza (la C1 al acesteia) = NUCLEOZID grup fosfat + nucleozid (la C5 al dezoxiribozei)= NUCLEOTID exista 4 tipuri de dezoxiribonucleotide care se vor deosebi numai prin baza azotata; dezoxiriboza si gruparea fosfat sunt constante PURINE A,G PIRIMIDINE C,T,U STRUCTURA PRIMARA ADN polimerizarea nucleotidelor, in molecula de ADN se realizeaza prin legaturi covalente 31-5" fostodiester, formate intre gruparea OH a C3 al dezoxiribozei unui nucleotid si restul fosfat fixat la C5 al nucleotidului urmator se formeaza o catena liniara neramificata, continua care reprezinta structura primara a ADN.STRUCTURASECUNDARA A ADI Mai toate tipurile de acizi ribonucleici (ARN) sunt formate dintr-o singura catena polinucleotidica, in timp ce majoritatea moleculelor de ADN sunt alcatuite din doua catene polinucleotidice, avand astfel si o structura secundara. Asemenea molecule sunt dublucatenare, Formarea unor molecule de acizi nucleici dublucatenare respecta o serie de legi chimice, ce poarta numele cercetatorului care le-a deseris prima oara ~ Chargaff. Legile lui Chargaff Cele 2 catene polinucleotidice sunt complementare una fafa de cealalta unei adenine de pe una din catene ii corespunde o timina pe cealalta catena, de care se Ieaga prin 2 legaturi de hidrogen (A= T); adenina este complementara cu timina. guanina este complementara cu citozina, de care se leaga prin 3 legaturi de hidrogen (G = C). Legaturile de hidrogen permise sunt: A=T si G=C in moleculele de acizi nucleici dublucatenare dar formate dintr-o catena ADN si o catena ARN (asemenea molecule hibrid se formeaza de obicei in procesul de transcriere genetica), adeninelor din catena ADN le corespund in catena ARN molecule de uracil(2 legaturi de hidrogen: A= U). Intr-o molecula de acid nucleic d.c. purinele sunt in raport echimolar cu pirimidinele Aceasta regula este 0 consecinta a primei legi. Astfel, daca oricarei A de pe una din catene ii corespunde oT pe cealalta catena si oricarei G ii corespunde o C, atunci numarul moleculelor de adenina este egal cu numarul celor de timina, adica A= T si, respectiv, G =C. De aici, prin adunarea celor dowd ecuafii, se deduce: A+ G=T+C Deci, numarul purinelor dintr-o molecula de acid nucleic dc. este egal cu numarul pirimidinelor. Cele doua catene polinucleotidice dintr-o molecula de acid nucleic d.c. sunt antiparalele O catena polinucleotidica are doua capete: la un capat se afla carbonul din pozitia 5 (C5") al unei pentoze, iar la celalalt capat se afla carbonul din pozitia 3° (C3") al unei alte pentoze. In interiorul unei celule o asemenea catena polinucleotidica este sintetizata in aceasta directie: 5° —> 3° Cele 2 catene polinucleotidice ale unei molecule d.c. au orientare inversa una fata de cealalta: capul 5° al fiecareia corespunde cu capul 3° al celeilalte (cele 2 catene sunt antiparalele), Legea complementaritatii bazelor (A-T,G-C) In catena de ADN, pozitia unui nucleotid nu impune cu necesitate in vecinatatea sa prezenta unui anumit alt nucleotid:pozitiile adiacente pot fi ocupate de oricare din cele 4 tipuri de nucleotide, fapt esential deoarece secventa nucleotidelor in lungul catenei de ADN reprezinta informatia genetica codificata. Insa secventa nucleotidelor unei catene determina cu necesitate secventa nucleotidelor celeilalte catene. Deci cele 2 catene de ADN nu sunt identice, ci complementare si strict codeterminate. Legea complementaritatii bazelor (regula Watson - Crick) sta la baza mecanismelor prin care se realizeaza functiile genetice ale ADN : transcriptia, replicarea, repararea leziunilor,recombinarea precum si la baza tennicilor de analiza genetica. Dublul helix al ADN (structura secundara) Watson si Crick au decoperit c& structura secundara a ADN este un dublu helix —formata din doua eatene de ADN asociate prin imperecherea bazelor Inclele glucidice legate prin resturi fostat constituie scheletul exter al dublu helixului, in timp ce bazele azotate hidrofobe sunt orientate spre interior si perpendicular pe axa helixului. ADN-ul uman confine aproximatiy 3,5 x 10° “perechi de baze™. Stubilitatea ADNae este asiguratd de: = interactiunile hidrofobe dintre bazele azotate suprapuse (stivuite) de pe aceeasi catend = legtturile de hidrogen ce se stabilese intre bazele azotate de pe 0 catend si cele complementare de pe cealaltd catend, Cele doua catene de ADN sunt antiparalele. Conformatia B descrisa de Watson si Crick Este conformatia ADN in conditii fiziologice regasita predominant in celule Are helixul rotit spre dreapta Bazele azotate formeaza intre ele un unghi de rotatie de Diametrul helixului este de 20 A Distanga dintre nucleotide este de 3.4 A Numarul de baze azotate per rotagie completa de 360 ° este 10 Prezinta incizura mica si mare fn care se realizeaza interactiuni cu proteinele, esentiale in reglarea expresici informatiei genetice Structura moleculei de ADN este dinamica Conformatia A Este conformatia sub care ADN-ul se regaseste in conditii de hidratare seazuta sau in prezenta unei concentratii crescute de cationi Este regasita in duplexuri ADN-ARN, Are helixul rotit spre dreapta Bavele azotate formeaza intre ele un unghi de rotaie de 32.7° Diametrul helixului este de 23 A Distanga dintre nucleotide este de 2.6 A Numarul de baze azotate per rotatie completa este 11 Incizura mare este adanca, jar cea mica este larga Conformatia Z Poate fi intalnita in conditii fiziologice in regiunile din ADN bogate in C-G Se pare ca acesta conformatie are un rol important in reglarea transcriptiei Are helixul rotit spre stinga si conformatie in zig-zag Bazele azotate formeaza intre ele un unghi de rotatie de -30° Diametrul helixului este de 18 ADistanta dintre nucleotide este de 3.7 A Numarul de baze azotate per rotatie completa este 12 Prezinta o singura incizura minora ingusta, incizura mare find aplatizata De la ADN la cromozomi In cucariote ADN-ul este stocat in nucleu. Deoarece nu este suficient spatiu iar molecula ADN-ului este extrem de mare (lungimea ADN de la o singura celula umana e 2m!!!), ADN-ul trebuie compactat, Exist 4 nivele de compactare a ADN care conduce la o scadere de 10.000 de ori lungimii ADN. Sradeeswre DXPOWOAY er “beads-on-a-string” p ’ ve form of chromatin: sonoma den fiber of { packed nucleosomes — —_— section of ' euended tor wpm Gromenones. vi — _—— 1 entice 1400 nem metaphase e tDublul helix de ADN se infasoara in jurul unui octamer proteic format din histone- fiecare unitate de ADN spiralata de 1,75 ori in jurul unui compelx histonic se numeste nucleozom. Histonele sunt proteine bazice cu masa moleculara mica (max. 20,000), bogate in aa bazici (Arg pt.H2A, H2B si, Lys pt H3, 114). in jurul octamerului histonie (H2A H2B H3 H4)x2 este spiralat ADN-ul nucleozomic fomat din 140 perechi de baze. Nucleozomii sunt legati intre ei prin ADN internucleozomic sau ADN linker format din 30 perechi de baze).Histona 1 interactioneaza cu ADN linker, avind rol in superspiralizarea nucleozomilor. Polinucleozomul seamana cu niste “margele pe ata” (~fibrile de cromatina de 10nm ). Polinucleozomul se superspiraleaz pentru a forma structura de solenoid Solenoidul conjine 6-7 nucleozomi per tur.Pasul e de 10nm, diametrul de 30 nm Solenoidul formeaza fibrele de cromatind de 30 nm. Fibrele de cromatina se compacteaza si mai mult formand domeni in forma de bucla. ~ Aceste domenii in bucla sunt superspiralizate si organizate in structuri distincte numite cromozomi - ADN -ul uman nuclear ( genomul) consta in 23 perechi de cromozomi. Organizarea ADN nuclear Studiile au relevat faptul ca in general o gena este formata din 10000-20000 perechi de baze azotate.In genomul uman exista aproximativ 21000- de gene care codifica proteine Tipuri de ADN nuclear a)functional - ADN codant (reprezinta 1,5-2% din genom) ~ ADN noncodant (reprezinta 98-98,5% din genom) ) ca preponderenta/repetare: - ADN nerepetitiv - ADN repetitiv - moderat repetitiv = inalt repetitiv ADN codant Numarul de gene pentru proteine este mic comparativ cu marimea genomului si complexitatea organismelor umane.Complexitatea organismului uman (avand in vedere nr mic de gene) se explica prin 2 mecanisme: © genele umane produc mai multe proteine (proteomul uman este de 10 ori mai mare decat nr de gene) © cresterea importanta a ADN necodant ce contine secvente de reglare complexa a expresiei genice Distributia genelor in cromozomi este inegala atat intre cromozomi diferiti cat si intre regiuni ale aceluiasi cromozom,exista cromozomi saraci in gene - 13,18,X si Y si cromozomi mai bogati in gene 17,19,22.Regiunile subtelomerice sunt mai bogate in gene Genele codante pot fi grupate in familii sau superfamilii pe baza asemanarii structurale exonii sunt regiunile codante ale genelor care specifica fiecare anumite domenii structurale si functionale ale proteinelor. Prin mecanisme complexe o gena produce mai multe transeripte, deci mai multe proteine - nr mediu de transcripte/gena (ENCODE) :5,7 transcripte/gena ADN noncodant ~ 98% din genomul uman este reprezentat de seeventele ADN care nu codifica proteine, fiind ADN extragenic sau intergenic. Cercetari recente au stabilit ca mare parte din acest ADN (-~85%) este transcris in anumite perioade sau circumstante in timpul vietii, unele secvente au functie in reglarea sintezei proteice Exista mai multe tipuri de ADN non codant: © ADNne din structura genelor pentru proteine - cuprinde elementele reglatoare si intronii © pseudogenele - seevente de ADN inrudite cu gene cunoseute dar care si-au pierdut functia © genele ARN necodant - secvente de ADN transerise in numeroase si diverse molecule functionale de ARN necodant, care nu sunt translatate in proteine, dar intervin in reglarea acestui proces sau in alte functii biologice importante; unele sunt insa fara functie cunoscuta © secventele repetitive ADN nerepetitiv - Este reprezentat de secvente de ADN care nu se repeta in genom (60%) - 0 mica parte din ADN nerepetitiv de la nivel genic se gaseste in exoni, iar restul este necodant si se afla in introni si in regiunile extragenice, ADN repetitiv = 0 secventa nucleotidica de o anumita lungime se poate repeta de mai multe ori in molecula de ADN a unei celule = 50% din ADN-ul noncodant consta din secvente de ADN repetitiv reprezentat de secvente nucleotidice care se repeta de mai mult de 20 de ori per genom © ADN inalt repetitiv = este reprezentat de seevente de ADN foarte scurte repetate in tandem, Formeaza aproximativ 10% din genom, Repetarile in tandem reprezinta repetari adiacente ale unei secvente formate din 2 sau mai multe nucleotide si nu sunt transcrise in ARN. E de 2 tipuri: - ADN satelit format dintr-un numar mare de repetari in tandem, se pot gasi in regiuni heterocromatice, pericentromerice si la nivelul telomerelor si reprezinta un subtip de ADN alfa-satelit cu rol de legatura a heterocromatinei centromet - YNTR (variable number tandem repeats)/SSR (simple sequence repeats)© ADN moderat repetitiv Este reprezentat de seevente scurte de ADN si reprezinta 35% din genom Unele seevente de ADN repetitiv se gasesc doar intr-un loc pe un anumit eromozom, altele sunt dispersate in intregul genom. iar altele se gasesc la nivelul intronilor. Majoritatea seeventelor moderat repetitive sunt transcrise in ARN si formeaza frecvent familii de seevente inrudite, unele cu functie cunoscuta : pentru ARNr. ARNt, histone, receptori olfactivi; altele cu functie recent identificata (de exemplu secventele SINEs sau LINEs) .