Qumica Biolgica 2010

TP 1: ESPECTROFOTOMETRIA

Introduccin
Al observar una solucin acuosa de un colorante a trasluz, observamos una leve coloracin, la cual se
debe a la interaccin entre las molculas del colorante y la luz que atraviesa la disolucin. Adems en
caso de tener varias soluciones de distintas concentraciones es posible determinar un gradiente de
concentracin a partir de la intensidad de la coloracin. Estas observaciones dan origen a una serie de
prcticas analticas llamada Espectrofotometra, basada

en la interaccin de las molculas y las

radiaciones electromagnticas.
Una radiacin electromagntica se puede describir como un flujo de partculas llamadas fotones, o bien
como una onda propagndose en el espacio. De esta ltima descripcin se toma el concepto de longitud
de onda, definindolo como la distancia entre dos mximos consecutivos de la onda. La longitud de onda
es inversamente proporcional a la energa de la misma, de tal manera que el espectro de radiaciones
electromagnticas abarca un amplio rango de energas, las de menor energa son las ondas de radio y las
de mayor energa son las llamadas radiacin gamma.

El estado energtico de una molcula se puede alterar por la absorcin de radiacin electromagntica a
determinada longitud de onda, lo que se puede medir para realizar un estudio cuali o cuantitativo, este
fenmeno es el fundamento de la espectrofotometra. Cuando un haz de luz incide sobre un medio
homogneo parte de la radiacin es absorbida y parte transmitida, la fraccin de luz que se absorbe y se
transmite depender de la cantidad de molculas presentes en el medio (de la concentracin) los que nos
permite cuantificar una sustancia
Las principales ventajas de la espectrofotometra son:

Sensibilidad relativa elevada.

Facilidad para realizar mediciones rpidas.
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Grado de especificidad relativamente elevado.

Para obtener la mxima sensibilidad en una determinacin debe conocerse la longitud de onda de mayor
absorcin de la sustancia analizada, que no deber coincidir con una alta absorcin de otras sustancias
presentes en la reaccin.
Sea I la intensidad de una radiacin que atraviesa un medio homogneo, parte de la radiacin es
absorbida por la muestra y otra parte es transmitida, ambas con una intensidad, i, de tal manera que se
define transmitancia de una muestra como la relacin entre la radiacin transmitida i versus la intensidad
luminosa incidente I, multiplicado x 100:
% T = ( i / I) x 100
La absorbancia es una medida de la cantidad de Energa luminosa incidente absorbida por una sustancia
en solucin. Est relacionada con Transmitancia por medio de :
A= - Log T

A= log ( 100 / %T)

La Ley de Lambert y Beer expresa que la absorbancia de una solucin es directamente proporcional al
camino recorrido por la radiacin electromagntica y a la concentracin de la solucin.
A= abc
A: absorbancia
a: absortividad especfica de cada soluto
b: distancia recorrida por el haz de luz en cm
c: concentracin de la solucin
La absortividad es la constante de proporcionalidad que nos permite igualar la ecuacin, sus unidades
dependern de b y c, ya que la absorbancia no tiene unidades; si b est en centmetros y c en moles por
litro, la absortividad estar en litros / mol centmetro y se denomina coeficiente de absorcin molar (E).
Requerimientos para poder aplicar la Ley:

- La medicin del % de T es realizada con luz monocromtica

- La medicin del % de T es realizada a una regin de absorcin del componente a estudiar.
- La referencia es elegida de tal manera que C=0 cuando T= 100% o A= 0%
- La naturaleza de la solucin debe ser tal que su transmisin responda a variaciones de C .
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Espectrofotmetro
Los aparatos de medida de la absorcin de la radiacin electromagntica se denominan
espectrofotmetros y pueden representarse de forma sencilla mediante el siguiente esquema:

La luz procedente de la fuente se hace pasar a travs del monocromador, que la desdobla en haces
monocromticos. El colimador tiene una rendija de ajuste variable, y segn su abertura se obtiene luz de
una determinada longitud de onda.La longitud de onda que se desee utilizar se selecciona variando la
posicin del monocromador. La luz que sale del colimador se hace pasar por la solucin y luego incide
sobre el fototubo, donde se detecta. La seal se enva a un registrador, el cual puede ser la escala de un
galvanmetro calibrado.

Calibracin del espectrofotmetro

Prender el equipo llevando la llave hacia arriba. Esperar 15 minutos para que los circuitos alcancen
temperatura.
Elegir la longitud de onda deseada con el selector.
Verificar 0% de T. Se realiza en modo transmitancia y colocando un cuerpo negro en reemplazo del tubo

Espectro de absorcin
Consiste en un grfico que representa el % T o la Absorbancia en funcin de la Longitud de onda a la cual
se realiza la medicin, para un amplio rango de longitudes de onda y para una misma concentracin c de
la muestra.
Permite determinar las longitudes de onda ptimas de absorcin y las concentraciones adecuadas de
trabajo. La longitud de onda optima ser aquella en el que el valor de absorbancia sea mximo
Los pasos para realizar un espectro de absorcin son:
Seleccionar la longitud de onda.
Ajustar 100 % T o 0 % A con el Blanco de reactivos.
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Reemplazar el blanco por la muestra y leer absorbancia.

Seleccionar una nueva longitud de onda y repetir las operaciones.
Graficar Absorbancia vs longitud de onda y seleccionar aquella donde la A sea mxima.

Curva de calibracin
Permite determinar la concentracin de una muestra incgnita. Consiste en medir una serie de soluciones
concentracin conocida de la sustancia de la muestra incgnita. Se grafican esos puntos y se emplea dicho
grafico para calcular la muestra problema.
Los pasos para realizar una curva de calibracin son:
Medir la A de las soluciones de concentracin conocida.
Medir la A de la muestra problema.
Graficar Absorbancia vs concentracin.
Si la sustancia cumple con la Ley de Lambert y Beer el grfico ser una recta y ser posible sacar un
factor ya que la pendiente de la recta ser la misma en todos los puntos. As se podr calcular la
concentracin de la muestra problema.
Si la sustancia no cumple la Ley, el grfico ser una curva y se extrapolar dentro de un rango apropiado
para calcular el valor de la muestra problema.

Parte experimental
Objetivos
- Aprender el uso del espectrofotmetro.
- Realizar espectro de absorcin de sustancias puras: soluciones de azul de metileno.
- Realizar una curva de calibracin para determinar la concentracin de una muestra problema de azul
de metileno.

Actividades:
1- Espectro de absorcin de solucin de azul de metileno

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Utilizar la solucin de azul de metileno de 5mg/l.Llevar a cero de absorbancia con agua destilada antes
de realizar cada lectura en el espectrofotmetro. Medir las absorbancias a distintas longitudes de onda,
con intervalos de 20 nm, desde 500 nm hasta 700 nm y cada 10 nm entre 600 y 700 nm.
Graficar curva de absorbancia versus longitud de onda.
Observar cul es la longitud de onda de mayor absorcin que se utilizar para realizar la curva de
calibracin y determinar la concentracin de una muestra problema.

2- Curva de calibracin
A partir de la solucin patrn de 5 mg/l realizar cinco diluciones: 1/2; 1/4; 1/5; 1/6; 1/8; 1/10; 1/15.
Medir sus absorbancias a la longitud de onda determinada anteriormente y graficar absorbancia versus
concentracin.
Determinar con la grfica anterior la concentracin de la muestra problema.

Problemas
1- El coeficiente de absorcin especfico de una protena es de 6 dl/g.cm. Calclese la concentracin
en mg/ml si una solucin de sta presenta una absorbancia de 0,82 en una cubeta de 1 cm .
2- Un barbitrico presenta un mximo de absorbancia a 245 nm en un medio fuertemente alcalino.
Trabajando con una celda de 1 cm de espesor se obtienen los siguientes datos:
concentracin (M)

Absorbancia

-5

0,179

4,10 x 10-5

0,356

8,20 x 10-5

0,718

-5

1,430

2,05 x 10

16,40 x 10

Determinar si cumple la ley de Lambert y Beer.

3- Calcule la concentracin de una solucin de ATP que posee una absorbancia de 0,87 a 259 nm,si el
coeficiente de absorcin molar a pH 7,0 es de 15,4 l/molcm y la longitud de paso de la cuba es de 1cm.
Cul ser la absorbancia de una solucin de ATP de concentracin 10g/L?. PM ATP: 491

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4- Una solucin que contiene 2 gr/l de una sustancia, transmite el 75% de la luz incidente en una
cubeta de 1 cm a una determinada longitud de onda. Calcular la transmitancia de una solucin que
contenga 4 gr/l y la absorbancia de una solucin que contenga 6 gr/l.

5- Al realizar un espectro de absorcin de protenas, se encontraron las siguientes absorbancias:

Longitud de onda (nm)

Abs

240

0,100

250

0,099

260

0,170

270

0,245

280

0,290

290

0,198

300

0,171

310

0,115

Graficar y determinar la longitud de onda que utilizara para medir protenas.

6- Calcular la concentracin de una muestra problema de hemoglobina sabiendo que presenta a 540
nm una absorbancia de 0,45. En la curva de calibracin se obtuvieron los siguientes datos:
Absorbancia

Concentracin ( g/ dl)

0,37

11

0,404

12

0,438

13

0,472

14

0,505

15

Determinar si el compuesto cumple con la Ley de Lambert y Beer a esa longitud de onda.
7- En una muestra de suelo se determin nitritos por un mtodo colorimtrico. La absorbancia de la
muestra a 540 nm fue de 0,52. En la curva de calibracin se encontraron los siguientes valores:
Absorbancia

Concentracin ( ug/ ml)

0,23

0,20

0,47

0,40

0,65

0,60

0,90

0,80
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Determinar la concentracin de nitritos en la muestra.

Es posible sacar un factor para determinar nitritos en prximas muestras?. Justificar.