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FACULTAD DE QUMICA
MANUAL DE PRCTICAS
LABORATORIO DE BIOLOGA CELULAR.
SEMESTRE 4TO
NDICE
MANUAL DE PRCTICAS DE LABORATORIO.
BIOLOGA CELULAR.
Evaluacin:
Asistencia mnima para aprobar el curso: 80%
Examen final 50%
Bitcora: 50% (tareas, discusin, puntualidad proyecto final y asistencia).
Material Didctico:
Libros
Ttulo: The Cell: A Molecular Approach
Autores: Geoffrey M. Cooper, Robert E. Hausman
Edicin: 6
Editorial: Sinauer Associates, Incorporated (2013).
ISBN: 0878939644, 9780878939640
Ttulo: Evolution
Autores: Nicholas H. Barton, Derek E.G. Briggs, Jonathan A. Eisen, David B. Goldstein,
Nipam H. Patel.
Edicin: 1
Editorial: CSH Press (2007).
ISBN: 978-087969684-9
Revistas
Nature Cell Biology
http://www.nature.com/ncb/index.html
Nature Reviews Molecular Cell Biology
http://www.nature.com/nrm/index.html
Nature Reviews Micr obiology
http://www.nature.com/nrmicro/index.html
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
6. Enumera las actividades que debes realizar antes y despus de cada sesin de
prctica.
7. Indica los pasos a seguir cuando un cultivo bacteriano se derrama sobre una
superficie.
8. Indica el lugar en que se deben depositar los siguientes materiales para su
desecho:
a) Guantes y cofias
b) Colorantes
c) Objetos de vidrio rotos
d) Cajas de Petri de plstico
9. Definir los siguientes conceptos:
a) Esterilizacin
b) Desinfeccin
10. Describe las caractersticas principales en una bitcora del estudiante.
BIBLIOGRAFA
RESULTADOS/DISCUSIN
CONCLUSIONES
PRINCIPALES FUNDAMENTOS TCNICOS (describir los principios de las
tcnicas discutidas y empleadas en la prctica).
BIBLIOGRAFA
PROCEDIMIENTO
Preparacin de medios de cultivo.
o Agar soya tripticasa:
Medios de cultivo para identificacin (siembra).
1. Con asa bacteriolgica estril, trabajar siempre a la llama del mechero, tomar una
mnima muestra.
2. Sembrar con cuidado sobre la superficie tersa del medio.
3. Incubar las placas en posicin invertida a 37C en aerobiosis.
Al trmino de 18-24 horas de incubacin, examinar el cultivo.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
1. Siembra directa
1. Realizar el cdigo de identificacin de las muestras a tomar (etiquetar el material a
utilizar).
2. Colocar el hisopo en la solucin salina, de tal manera que quede sumergido.
3. Sacar el hisopo de la solucin salina y pasarlo por la superficie seleccionada para
muestrear.
4. En una caja Petri con agar, pasar el hisopo sobre la superficie, de tal manera que
quede sembrada la muestra tomada (en estra).
5. Cerrar la caja de Petri y colocar en incubacin a 37C.
6. Observar y anotar lo sucedido a las 18-24 horas de incubacin. (Color, forma,
textura, brillo, niveles).
RESULTADOS/DISCUSIN
CONCLUSIONES
PRINCIPALES FUNDAMENTOS TCNICOS (describir los principios de las
tcnicas discutidas y empleadas en la prctica).
BIBLIOGRAFA
Reactivo
Tris
cido Brico
EDTA
0.5M,
pH=8
H2O destilada.
1 lt
108g
55g
40ml
10L
1.08 kg
550g
400ml
20 L
2.16 kg
1.1kg
800ml
Cbp 1L
Cbp 10L
Cbp 20L
Sanitas.
Marcador indeleble.
PROCEDIMIENTO
2. Preparacin de gel de agarosa.
1. USAR GUANTES
2. Pesar agarosa para preparar geles a 2 condiciones: a) 1 % y b) 2% en 35ml de
buffer TBE.
3. Colocar la agarosa en matraces de 100ml.
4. Adicionar 35ml de buffer TBE a cada matraz.
5. Homogeneizar.
6. Calentar a ebullicin hasta observar una solucin incolora y homognea.
7. Con precaucin retirar el matraz caliente y templar (no enfriar ya que inicia el
proceso de polimerizacin).
8. Agregar 2l de bromuro de etidio.
9. Homogeneizar.
10. Verter sobre la cmara de electroforesis horizontal.
11. Colocar el peine (para formar los micropozos, en dnde irn las muestras).
12. Esperar de 15-30 minutos para la polimerizacin.
13. Con cuidado quitar el peine del gel.
3. Electroforesis de ADN
1. Llenar la cmara de electroforesis hasta el nivel MAX. con buffer TBE de tal
manera que cubra la superficie del gel de agarosa.
2. Diluir las muestras con buffer de carga.
3. Con una micropipeta cargar en el primer pozo el Marcador de Peso Molecular y
posteriormente las muestras y colocarlas en los siguientes pozos.
4. Colocar la tapa de la cmara de electroforesis para que quede correctamente
ensamblada.
5. Conectar a la fuente de poder.
6. Encender la fuente de poder, determinar los parmetros de Voltaje y Tiempo
segn lo establecido por el profesor.
7. Al finalizar, poner STOP a la fuente de poder y apagar.
8. Con cuidado retirar el gel de la cmara de electroforesis
9. Colocar el gel en la placa del transiluminador ultravioleta (MiniBis).
10. Seguir las indicaciones para el anlisis de las bandas presentes en el gel.
11. Una vez obtenida la evidencia del gel, desechar ste correctamente (bolsa roja).
4. Preparacin
de
PROCEDIMIENTO).
Gel separador 10%
Agua destilada (mL)
Tris-HCl 1.5 M pH 8,8(mL)
Acrilamida/Bisacrilamida
gel
4.04
2.5
3.3
de
poliacrilamida
(MATERIALES
3.05
1.25
0.65
30%(mL)
SDS 10% (L)
TEMED (L)
Persulfato de amonio 10% (L)
Persulfato de amonio:
100mg
Persulfato de
amonio
1ml
Agua destilada
Mantener en refrigeracin
mximo 3 das.
Buffer de carga SDSPAGE
(solucin
concentrada 2x):
10 ml Tris-HCl 0.5 M pH
6,8(mL)
16 ml Solucin de SDS
10%
50 mg Azul de bromofenol,
12 ml Glicerol
4 ml Agua destilada.
Mantener a temperatura
ambiente
(<2
meses).
Agregar 0.2mL de 1mercaptoetanol a 4.2mL.
TBS 10
2.42 g de Tris-HCl (20 mM)
8 g de NaCl (137 mM)
Ajustar el pH a 7.6
Aforar a 1 litro
100
20
40
30%(mL)
SDS 10% (L)
TEMED (L)
Persulfato de amonio 10% (L)
50
4
40
Solucin Fijadora
Solucin de desteido
500 ml
Metanol
70 ml cido actico glacial
430 ml
Agua
destilada.
200 ml
Metanol
100 ml
Etanol
50 ml cido actico
650 ml agua, guardar a
temperatura ambiente.
TBS-Tween 20 0.05%
1.0 ml Tween 20 en 1000 ml
de TBS.
5. Electroforesis de protena.
Preparacin de muestras.
1. A partir de la extraccin con buffer de lisis RIPA
2. Calcular la cantidad de muestra de acuerdo a la concentracin de protena deseada
previamente cuantificada con RA+S, RB.
3. A la cantidad de muestra requerida se ajusta con RIPA y se agrega la misma
cantidad de Loading Buffer con B.mercapto (950 ul LB + 50ul BM).
4. Dar un spin, calentar las muestras de 80-85 (realmente no hay diferencia) 5 minutos y
dar spin.
5. Cargar cada muestra en su pozo correspondiente del gel (se puede usar la gua para
cargar correctamente en cada pozo y evitar que se salga la muestra, se puede cargar
de 20-30 ul por muestra)
6. Usar marcador de peso molecular de 10-15 ul (se recomienda para los geles de menor
concentracin usar 10ul y aumentar cantidad en geles de mayor concentracin).
Electroforesis
1. Primer tiempo a 100 volts 30 minutos (asegurarse que estn siempre en la misma
polaridad)
2. Segundo tiempo para un gel de 10% 100 volts 2 hrs y 150 v 15 minutos.
6. Fijacin de las protenas
Solucin Fijadora
70ml Metanol
70 ml cido actico glacial
430ml Agua destilada.
1. Retirar el gel de los vidrios y colocarlo en un recipiente hermtico de plstico de un
tamao adecuado (12-15 cm x 12-15 cm).
2. Colocar aproximadamente 15 ml de solucin fijadora, cubriendo completamente el
gel, incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos.
3. Pasar a la tincin del gel.
7. Tincin de gel (azul de Coommassie)
Solucin de teido
1. En un recipiente hermtico de plstico, limpio, colocar el gel y aadir 50 mL de la
solucin de tincin (azul de comassie)
2. Incubar en agitacin a 22C durante 1 hora.
3. Desechar correctamente la solucin de teido. Tener cuidado de NO tirar el gel.
8. Visualizacin del gel el transiluminador.
9. Desteido del gel.
Solucin de desteido
200 ml Metanol
100 ml Etanol
50 ml cido actico
659ml agua destilada
Guardar a temperatura ambiente.
1. Colocar de 10-15ml de solucin de desteido en agitacin a temperatura ambiente
durante 10 minutos.
2. Repetir el paso uno 5 veces hasta que aparezcan las bandas teidas de azul y el
fondo casi transparente.
RESULTADOS/DISCUSIN
CONCLUSIONES
TBE (ingredientes):
AGAROSA:
TINCIN DE GEL CON BROMURO DE ETIDIO, O SYBR Green (Gold)
BIBLIOGRAFA
COOPER G. HOUSMAN R. 2004. Coopers: La clula. Editorial Marban.
Madrid, Espaa.
GREEN M., SAMBROOK. 2012. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold
Spring Harbor Laboratory. 4th edition. New York, USA.
ONDARZA R., Biologa Moderna. 2002. Trillas. 10 edicin. Mxico.
MANIATIS T., FRITSCH, E., SAMBROOK J. 1982. Molecular cloning, a
laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory. New York, USA.
WATSON J., BAKER T., BELL S., LEWIS A. 2007. Molegular biology of the
gene. Benjamin Cummings. 6th edition. USA.
GENMICO
(CUANTIFICACIN,
INTRODUCCIN
La extraccin y purificacin de cidos nucleicos constituye la primera etapa de la mayora
de los estudios de biologa molecular y de todas las tcnicas de recombinacin de ADN.
En este caso, los mtodos de extraccin permiten obtener cidos nucleicos purificados a
partir de diversas fuentes para despus realizar anlisis especficos de modificaciones
genticas mediante la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). La calidad y la pureza
de los cidos nucleicos son dos de los elementos ms importantes en ese tipo de
anlisis. Si se desea obtener cidos nucleicos muy purificados, que no contengan
contaminantes inhibidores, es preciso aplicar mtodos de extraccin adecuados.
Dada la gran variedad de mtodos de extraccin y purificacin de cidos nucleicos
existentes, la eleccin de la tcnica ms adecuada suele efectuarse conforme a los
criterios siguientes:
cido nucleico diana;
Organismo fuente;
Material inicial (tejido, hoja, semilla, material transformado, etc.);
Resultados deseados (rendimiento, pureza, tiempo que requiere la purificacin);
Uso posterior (PCR, clonacin, etiquetado, transferencia, RT-PCR, sntesis de
ADNc, etc.).
OBJETIVO
A partir de la muestra obtenida en la prctica # 4, realizar la extraccin del ADN genmico
con el uso del KIT (QUIAGEN) y del mtodo de FENOL-CLOROFORMO, comprendiendo
los fundamentos que implican el aislamiento y purificacin del ADN genmico de
bacterias. As mismo determinar la calidad y el rendimiento de la extraccin a travs de
una electroforesis en gel de agarosa.
FUNDAMENTO. Definido en clase y desarrollado por el alumno.
MATERIALES
Guantes
Buffer TBE 1X
Reactivo
Tris
cido Brico
EDTA
0.5M,
pH=8
H2O destilada.
1 lt
108g
55g
40ml
10L
1.08 kg
550g
400ml
20 L
2.16 kg
1.1kg
800ml
Cbp 1L
Cbp 10L
Cbp 20L
Bromuro de etidio.
Transiluminador
(MiniBis)
Sanitas.
Marcador indeleble.
ultravioleta
PROCEDIMIENTO
10. Extraccin y purificacin de ADN genmico (KIT QUIAGEN)
1. Centrifugar 1.5ml de cultivo bacteriano a 8000 rpm durante 8 minutos.
2. Desechar el sobrenadante y agregar 200l de Buffer ASL.
3. Homogeneizar en el vrtex a mxima velocidad hasta disolver el pellet formado.
4. Centrifugar 1000rpm durante 1 minuto.
5. Colocar en el termoblock a 95C durante 10 minutos.
6. Agregar 25 l de proteasa K y agitar con la punta.
7. Agregar :::: l de buffer AL.
8. Homogeneizar en el vrtex.
9. Colocar en el termoblock a 56C durante 15 minutos.
10. Agregar 200 l de etanol y homogeneizar en el vrtex.
11. Vaciar a columnas y centrifugar a 8000 rpm durante 4 minutos.
12. Pasar el sobrenadante a un tubo contenedor.
13. Agregar 500 l de buffer AW1.
14. Centrifugar a 8000rpm durante 1 minuto (si no pasa toda la solucin, repetir).
15. Agregar 500 l de buffer AW2.
16. Centrifugar 13,500rpm durante 3 minutos.
17. Desechar el lquido, secar el tubo contenedor sobre una sanita y volver a colocarlo.
18. Centrifugar a 13,500 rpm durante 1 minuto para secar la columna.
19. Pasar la columnaa un tubo eppendorf.
20. Agregar 200 l de buffer AE.
21. Incubar durante 2 minutos a temperatura ambiente.
22. Centrifugar 11,000 rpm durante 2 minutos.
23. Cuantificar el ADN recuperado o guardar a -20C.
24. Realizar electroforesis del ADN recuperado.
25. Limpiar con etanol la centrifuga y el rea de trabajo.
11. Extraccin y purificacin de ADN genmico (Fenol-cloroformo).
1. Iniciar con 100-200l de volumen (de ser necesario, adicionar agua estril).
2. Aadir a la muestra de ADN 1 volumen de fenol:cloroformo (1:1) y mezclar por
inversin 3 veces.
3. Centrifugar a 12,000rpm durante 10 minutos.
4. Tomar la fase superior en un tubo nuevo sin tocar la interfase.
5. Agregar 1 volumentes de etanol fro (-20C) y 1/10 de acetato de sodio 3M.
6. Agitar y colocar a -20C durante 30 minutos.
RESULTADOS/DISCUSIN
CONCLUSIONES
PRINCIPALES FUNDAMENTOS TCNICOS (describir los principios de las
tcnicas discutidas y empleadas en la prctica).
Describir las etapas en la extraccin de ADN (Reactivo utilizado y fundamento).
Lisis de clulas o virus.
Degradacin de la fraccin proteica asociada al ADN.
Purificacin:
o Precipitacin
o Lavado del Pellet.
o Recuperacin
BIBLIOGRAFA
COOPER G. HOUSMAN R. 2004. Coopers: La clula. Editorial Marban. Madrid,
Espaa.
GREEN M., SAMBROOK. 2012. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold
Spring Harbor Laboratory. 4th edition. New York, USA.
ONDARZA R., Biologa Moderna. 2002. Trillas. 10 edicin. Mxico.
MANIATIS T., FRITSCH, E., SAMBROOK J. 1982. Molecular cloning, a laboratory
manual. Cold Spring Harbor Laboratory. New York, USA.
WATSON J., BAKER T., BELL S., LEWIS A. 2007. Molegular biology of the gene.
Benjamin Cummings. 6th edition. USA.
MATERIALES
ADN Extrado de la prctica # 4.
Master Mix.
Microtubos para PCR (200l).
Guantes
Buffer TBE 1X
Reactivo
Tris
cido Brico
EDTA 0.5M, pH=8
H2O destilada.
1 lt
108g
55g
40ml
Cbp 1L
10L
1.08 kg
550g
400ml
Cbp 10L
20 L
2.16 kg
1.1kg
800ml
Cbp 20L
Fuente de poder.
Peine de 14 pozos.
Buffer de carga
Bromuro de etidio.
Transiluminador ultravioleta (MiniBis)
Sanitas.
Marcador.
PROCEDIMIENTO
14. Amplificacin ADN por PCR.
1. Limpiar todo el material a utilizar (etanol al 70%) antes de colocarlo dentro de la
campana de extraccin.
2. Introducir el material a la campana y organizar para tener mayor control de
manipulacin.
3. Preparar un master-mix dependiendo del nmero de reacciones a realizar. ste
incluye:
a. Amortiguador (Buffer)
b. dNTPs
Master Mix
c. Taq Polimerasa.
d. MgCl2
e. Primers F y R
f. Agua grado molecular.
4. Se seleccionan las muestras
5. Se preparan la cantidad especfica de tubos de PCR 200 l para la PCR y en cada
uno se colocan 15l del Master Mix.
6. Colocar 2l de ADN en el orden indicado.
7. Colocar en 2 tubos extras 15 l de Master-Mix sin ADN (sern los controles
negativos).
8. Homogeneizar por pipeteo.
9. Colocar los tubos en el termociclador bajo las siguientes condiciones:
a. 94C (3 minutos)
b. 94C (1 minuto)
32 ciclos
c. 53C (30 segundos)
d. 72C (1 minuto)
e. 72C (7 minutos)
f. 4 (infinito)
15. Electroforesis de producto de PCR.
1. Pesar agarosa para preparar un gel al 2% en 35ml de buffer TBE.
2. Colocar la agarosa en matraces de 100ml.
3. Adicionar 35ml de buffer TBE a cada matraz.
4. Homogeneizar.
5. Calentar a ebullicin hasta observar una solucin incolora y homognea.
6. Con precaucin retirar el matraz caliente y templar (no enfriar ya que inicia el
proceso de polimerizacin).
7. Agregar 2l de bromuro de etidio.
8. Homogeneizar.
9. Verter sobre la cmara de electroforesis horizontal.
10. Colocar el peine (para formar los micropozos, en dnde irn las muestras).
BIBLIOGRAFA
EGUIARTE L., SOUZA V., AGUIRRE X. 2007. Ecologa Molecular. Instituto
nacional de ecologa. Mxico DF.
TAMAYO DE DIOS L, IBARRA C, VELASQUILLO C. 2013. Fundamentos de la
reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) y de la PCR en tiempo real.
Tecnologa en salud. Vol 2. Nm 2. Pp 70-78.
WATSON J., BAKER T., BELL S., LEWIS A. 2007. Molegular biology of the
gene.
Benjamin
Cummings.
6th
edition.
USA.
MATERIALES
Guantes
Kit (NOMBRE)
Buffer TBE 1X
Reactivo
Tris
cido Brico
EDTA 0.5M, pH=8
H2O destilada.
1 lt
108g
55g
40ml
Cbp 1L
10L
1.08 kg
550g
400ml
Cbp 10L
20 L
2.16 kg
1.1kg
800ml
Cbp 20L
Peine de 14 pozos.
Buffer de carga
Bromuro de etidio.
Transiluminador
(MiniBis)
Sanitas.
Marcador.
ultravioleta
PROCEDIMIENTO
Extraccin de ADN desde un gel de agarosa.
1. Usar guantes y lentes de proteccin.
2. Visualizar la banda de inters en el gel de agarosa teido con bromuro de etidio,
en un cuarto oscuro en una caja de luz ultravioleta.
3. Con una hoja de bistir cortar alrededor de la banda.
MATERIALES
Guantes
Enzima(s) de restriccin.
Termoblock.
ADN extrado y purificado.
Buffer TBE 1X
Reactivo
1 lt
Tris
108g
cido Brico
55g
EDTA 0.5M, pH=8
40ml
H2O destilada.
Cbp 1L
Matraz Erlenmeyer de 150ml
Micropipeta de 2 l y 20 l
Agua destilada
Alcohol 70%
Agarosa
Puntas (10 l y 20l).
Cmara de electroforesis.
Fuente de poder.
10L
1.08 kg
550g
400ml
Cbp 10L
20 L
2.16 kg
1.1kg
800ml
Cbp 20L
Peine de 14 pozos.
Buffer de carga
Bromuro de etidio.
Transiluminador
(MiniBis)
Sanitas.
Marcador.
ultravioleta
PROCEDIMIENTO
1. Se emplean enzimas de restriccin que generalmente se encuentran a
10U/l.
2. En promedio se requiere: 3U de enzima/g de DNA a cortar, evitando que
la canridad de enzima en la reaccin sea mayor de 10% del volumen final,
porque contiene glicerol que puede inhibir la reaccin.
BIBLIOGRAFA