GENTICA II

TEMAS 7 Y 8

MANIPULACIONES
GENTICAS
(in vitro e in vivo )
Prof. Mara Ball
Semestre A-2012

Etapas para la clonacin

de un gen de inters

Clonacin

Amplificacin
de la
secuencia de
ADN clonada

Purificacin de plsmidos

Lisis alcalina
Ultracentrifugacin

Cromatografa

Purificacin de plsmidos
Lisis alcalina

Purificacin de plsmidos

Cromatografa
Ultracentrifugacin

Vectores de clonacin
Clonacin y propagacin del ADN
gen de inters
ADNc genotecas

Manipulacin del ADN

secuenciacin
mutagnesis sitio-dirigida
Expresin
estudios de regulacin de la expresin gentica
expresin de grandes cantidades de protenas

Propiedades de los vectores

Replicacin activa, independiente del cromosoma del hospedador
Tamao pequeo (replicacin, mayor nmero de copias del
plsmido recombinante)

Marcador de seleccin en la clula receptora

Estabilidad
Sitios nicos de corte por enzimas de restriccin
Facilidad de aislamiento y purificacin

Qu determina la escogencia de un vector?

Tamao del inserto

Tamao del vector
Sitios de restriccin
Nmero de copias
Eficiencia de clonacin
Facilidad de bsqueda del inserto

Clulas receptoras

Clulas receptoras
Para replicarse, el vector debe ser introducido en una clula
receptora.
La escogencia de la clula receptora depende del vector
utilizado.
Clulas procariotas
E. coli bacteria ms utilizada.
Tiempo de generacin corto, fciles de manipular, poco costosas,
no patgenas, manipuladas genticamente para evitar
diseminacin, res-, recA-. Otras especies: Bacillus subtilis,

Pseudomonas.

Clulas eucariotas
Clulas animales en cultivo, levaduras, plantas, insectos, humanas.
Manipulacin ms compleja, costosas. Vectores deben poseer
origen de replicacin eucariota. Se utilizan para estudios de
expresin y regulacin gentica in vivo, para expresar protenas
con modificaciones post-traduccionales.

Clulas receptoras

Variantes genticas de E. coli K-12: cepas modificadas para la tecnologa

del ADN recombinante.

1. Eliminacin de los sistemas de restriccin y modificacin.

2. Modificacin de los sistemas de recombinacin para evitar rearreglos
genticos.
3. Mutacin de la actividad endonucleasa para incrementar la produccin de
plsmidos.

Los sistemas de restriccin y modificacin (RM) de E. coli K-12 se mutan

porque interfieren con la replicacin del ADN forneo en la clula receptora
(invasin por parte de fagos y plsmidos).
El sistema de RM codifica enzimas que degradan el ADN forneo que no est
metilado apropiadamente, en la secuencia 5'-AAC-(N)5-GTGC-3, la cual
podra estar presente en el ADN clonado.

Clulas receptoras

E. coli DH5: fhuA2 (argF-lacZ)U169 phoA glnV44 80 (lacZ)M15 gyrA96 recA1

relA1 endA1 thi-1 hsdR17

Transforma con alta eficiencia. Muy utilizada en experimentos de clonacin.

Mutaciones:
endA1: inactiva la endonucleasa intracelular que degrada el ADN plasmdico durante
su extraccin y purificacin.

hsdR17 : elimina la endonucleasa de restriccin EcoKI (sistema de restriccin y

modificacin). El ADN que carece de metilacin por EcoKI no va a ser degradado.

(lacZ)M15: es el alelo para el pptido Omega (complementacin alfa) necesario para

la selecccin azul-blanca en muchos vectores basados en el gen lacZ.

recA: elimina la recombinacin homloga. Reduce las deleciones, la multimerizacin

glnV44: es el nombre de SupE44: supresor amber.

de plsmidos y la insercin del plsmido en el cromosoma.

Sistemas de restriccin y modificacin del ADN

(RM)

Una endonucleasa de restriccin (R) reconoce una secuencia especfica

en el ADN e introduce una ruptura doble cadena;
La enzima de modificacin (M) metila la misma secuencia y la protege del
corte;
Juntas, forman un sistema de restriccin y modificacin (RM)

Enzimas de uso corriente en biologa molecular

Enzimas de restriccin
Ligasas
ADN y ARN polimerasas
Nucleasas
Otras

Enzimas de restriccin
Son protenas homodmericas y reconocen secuencias
de ADN palindrmicas.

Extremos cohesivos

Enzimas de restriccin

Otras enzimas de uso corriente en

biologa molecular
Ligasa: enlace fosfodister entre un extremo 3OH y un extremo
5PO4 de 2 nucletidos. E. coli, Fago T4
Transcriptasa reversa: copia ADNc a partir de ARN
Fosfatasa alcalina: retira el PO4 en 5 del ADN, ARN y
nucletidos libres. Impide la recircularizacin de los plsmidos
digeridos
Nucleasas: ADNasaI (endonucleasa), Nucleasa S1 (ADN simple
cadena,), Exonuclesas III (deleciones), RNAsas (degradan ARN),
RNAsa H (destruye ARN en hbridos ARN-ADN)

 ADN polimerasa: polimerasa, exonucleasa 3-5, exonucleasa 5-3.

Sntesis de ADN a partir de cebadores
Fragmento Klenow de la ADN pol I: no tiene actividad
exonucleasa 5-3
Transferasa terminal: adicin de desoxinucletidos a la
extremidad 3OH libre del ADN. Cola-Extremos cohesivos.
Marcaje de la extremidad 3OH de un ADN
ARN polimerasa: ADN---ARN. Sntesis de sondas altamente
marcadas
ARN ligasa: enlace fosfodister entre 2 ARN. Marcaje de
sondas de ARN

Polinucletido kinasa de T4: transfiere el PO4 en gamma de un

ATP sobre el OH en 5 de un polinucletido. Marcaje en 5 de un
ADN para secuenciamiento, sondas

Accin de la ADN ligasa

Enlace fosfodister
entre un extremo 3OH
y un extremo 5PO4
de 2 nucletidos

Accin de la fosfatasa alcalina

Retira el PO4 en 5 del ADN, ARN y nucletidos libres.
Impide la recircularizacin de los plsmidos digeridos.

Tipos de vectores
1. PLSMIDOS
Primera generacin: naturales. F, R, ColE1
Segunda generacin: pBR322
Tercera generacin: pUC, pBluescript
Cuarta generacin y otros
Fragmentos de aproximadamente 10-12 Kb

Plsmidos

Segunda
generacin
Tercera
generacin

Complementacin Alfa
El gen LacZ codifica un polipptido
de 1029 aminocidos. Este polipptido
forma un tetrmero funcional.
La polimerizacin depende de la
presencia de los 50 primeros
aminocidos (la regin N-Terminal).
La supresin de los 50 primeros
aminocidos
genera
un
pptido
(Omega o delta M15) incapaz de
polimerizar y no muestra actividad
enzimtica.

DH5: F- endA1 glnV44 thi-1 relA1 gyrA96 deoR nupG lacZdeltaM15 hsdR17

Complementacin Alfa
Si se introduce la secuencia
que
codifica
el
pptido
faltante (pptido alfa), el
pptido omega se vuelve
funcional.
Si esta secuencia es portada
por un plsmido, ocurre la
complementacin alfa .
Cepas de E. coli expresan
constitutivamente nicamente
el
pptido
Omega.
No
muestran ninguna actividad
enzimtica (Lac-).

Cuando una bacteria de tal

especie es transformada con
un plsmido capaz de realizar
la complementacin alfa, la
actividad es restaurada.

Sitio de clonacin mltiple

Digestin parcial del ADN

Digestin parcial con endonucleasas de restriccin: cortar el ADN en un grupo
pequeo de sitios de restriccin disponibles. El patrn de restriccin va a ser
diferente entre las molculas individuales resultando en una ruptura al azar
del genoma.

Esto genera una serie de

fragmentos
de
restriccin los cuales, si
se derivan del mismo
locus, pueden compartir
secuencias comunes.
Ej. Fragmento 6 se
solapa parcialmente con
el 2 y 3.

Digestin parcial del ADN

Tipos de vectores
2. FAGOS
El fago lambda tiene un tamao de ~50 kb, est constitudo de una molcula
de ADN db, se replica en E. coli en forma ltica o lisognica .

Fragmentos hasta 25 Kb

Fago

Fragmentos hasta 25 Kb
EMBL3, gt10, gt11, ZAP
Insertos pequeos (5 kb) o grandes (10-25 Kb)
Clonacin eficiente y fcil mantenimiento del ADNc y libreras
genmicas

Fcil monitoreo (screening) de grandes cantidades de clones

recombinantes (libreras)

Fago

Vector: Fago

Encapsidacin in vitro de

Encapsidacin in vitro de
Mutante no produce colas

Mutante no produce cabezas

Tipos de vectores

3. CSMIDOS

Fragmentos hasta
50 Kb

Tipos de vectores
4. CROMOSOMAS
ARTIFICIALES DE
BACTERIAS (BAC)

Fragmentos hasta
300 kb

Tipos de vectores
4. CROMOSOMAS
ARTIFICIALES DE
BACTERIAS (BAC)

Tipos de vectores
5. CROMOSOMAS
ARTIFICIALES DE
LEVADURA (YAC)

Fragmentos entre 1500

Y 2000 Kb

Clonacin en un pYAC

Tipos de vectores
6. CROMOSOMAS
ARTIFICIALES
HUMANOS (HAC)
Microcromosomas (6-10
megabases).
47 cromosomas, uno muy pequeo.
Actan como nuevo cromosoma en
la poblacin de clulas humanas.

Permiten la introduccin de
nuevos genes humanos en las
clulas.
Utilizados en terapia gnica.

Cromosomas artificiales Humanos (HAC)

Schematic diagram of the construction of the 21 pqHAC

vector.
The distal q arm was deleted from human chromosome 21 by
telomere-directed truncation at AL163204 locus. For the
site-directed insertion of the transgene of interest, a loxP
sequence was introduced at AL163203 locus on the q arm.
And then, the distal p arm was further deleted at
AL163201 locus as with the q arm deletion. Triangle
indicates artificially synthesized telomere sequence for
telomere truncation. loxP, loxP sequence.

Cromosomas artificiales Humanos (HAC)

Ejemplos de otros vectores

Vector transbordador
Origen de replicacin
procariota.
Origen de replicacin
eucariota.

Marcador de seleccin
en procariotas.
Marcador de seleccin
en eucariotas.
Promotor eucariota.

Vector transbordador
Origen de replicacin
procariota.
Origen de replicacin
eucariota.

Marcador de seleccin en
procariotas.
Marcador de seleccin en
eucariotas.
Promotor eucariota.

Vectores de expresin

Vector de expresin

Vector para clonar y expresar en clulas

de mamferos

El ori de SV40 permite

que el vector pueda
replicarse
como
un
episoma en clulas de
mamfero.
El SCM esta aguas
abajo del promotor del
citomegalovirus y aguas
arriba de las seales de
terminacin del gen
hormona de crecimiento
bovina
para
altos
niveles de expresin.

Vector de expresin en clulas de

mamferos y en bacterias

Permite altos niveles de expresin

de genes heterlogos en procariotas
y eucariotas.
Eucariotas: promotor y enhancer del
citomegalovirus
humano
para
expresin constitutiva en clulas de
mamferos.
Procariotas: expresin regulada por
el promotor hbrido T7/ lacO
Contiene
el
represor
lacI .
Expresin inducible por IPTG.
Secuencias
Shine-Dalgarno y
secuencias de mamferos Kozak en
tandem.
Cada sitio de unin al ribosoma est
a una distancia ptima del codn de
iniciacin del gen clonado, lo que
asegura una eficiente traduccin del
ARNm generado en cada sistema.

Vectores virales (clulas eucariotas)

Genotecas
Conjunto de fragmentos de ADN clonados que representan el
genoma completo de un organismo (librera Genmica) o los genes
transcritos en un tipo de clula particular (librera de ADNc).

Librera genmica, librera de expresin

Genotecas

Biblioteca genmica biblioteca de expresin.

Genotecas
Genoteca de ADN Genmico
La coleccin de clones que incluyen todas las secuencias de
ADN de una especie determinada se denomina biblioteca
de ADN genmico, o simplemente biblioteca genmica
(Genoteca).

Genoteca de ADN Complementario (ADNc)

La coleccin de clones que incluyen todas las secuencias de
ADNc de todos los ARNm de un tipo celular determinado se
denomina biblioteca de ADNc, o Biblioteca de Expresin.

Genotecas
BamHI

BamHI

Fago recombinante ADN genmico

Digestin con BamHI
Purificacin de ADN genmico
BamHI
GENOMA

EcoRI
Promotor

Exn 1

HindIII

Exn 2

BamHI

Exn 3

Pre-ARNm
ARNm
Purificacin ARNm poliA+
EcoRI
Sntesis de ADNc in vitro
Plsmido recombinante ADNc

HindIII

Librera Genmica
Los fragmentos de ADN son generados con enzimas de restriccin.
Los fragmentos obtenidos se ligan con el vector apropiado.
Se construyen generalmente en fagos vectores en lugar de plsmidos.
La eficiencia de transformacin de un fago vector es 1.000 veces
mayor que la de un plsmido.

Estimacin del tamao de libreras

genmicas
N= ln(1-P)

ln(1-f)
N=nmero requerido de clones
P=probabilidad de encontrar en la biblioteca el fragmento deseado
f=fraccin del genoma contenida en un solo clon

Organismo

Tamao
del genoma

Tipo de
Vector

Tamao
de inserto

Tamao de
la biblioteca
(clones)

Bacterias

4x106 bases

Plsmido

4kb

0.99

4.6x103

Lambda

18kb

0.99

1.0x103

Csmido

40kb

0.99

458

BAC

300kb

0.99

59

Plsmido

4kb

0.99

3.5x106

Lambda

18kb

0.99

7.7x105

Csmido

40kb

0.99

3.5x105

BAC

300kb

0.99

4.6x104

Mamferos

3x109 bases

Los valores mostrados aqu del tamao de los genomas de bacterias y mamferos son ejemplos
utilizados solo para el propsito de estos clculos. El tamao de los genomas vara ampliamente de un
organismo a otro. Los tamaos de los insertos tambin varan.

Estimacin del tamao de bibliotecas

genmicas

Ejemplo:
Genoma humano = 3.2 x 106 kbp = 3.2 x 109 bp
Vector Lambda puede aceptar insertos de aprox. 17 Kbp
N = ln (1 0.99)
ln [1 (1.7 x 104 bp inserto)
3.2 x 109 bp genoma]
N = 8.22 x 105 placas requeridas en la librera
Usualmente se hacen libreras genmicas de 2 2.5x el tamao de lo
requerido usando esta ecuacin.

Estimacin del tamao de bibliotecas

genmicas

Librera Genmica en Lambda

Librera genmica en Csmidos

Libreras de ADNc
El ARNm representa genes que son activamente transcritos
(o expresados) en algn momento dado en un tipo particular
de clula.
Biblioteca de ADNc, o Biblioteca de Expresin: la coleccin
de clones que incluyen todas las secuencias de ADNc de
todos los ARNm de un tipo celular determinado.
El ARNm eucariota: poliadenilado y con intrones que deben
ser removidos. Este es el punto de partida!

Genoteca de Expresin: Sntesis de ADNc

Tcnicas para identificar

el clon recombinante que
lleva el gen de inters
Escogencia: depende de lo que se conoce del gen de
inters (secuencia del ADN, actividad de la protena o
enzima, secuencia proteica, disponibilidad de
anticuerpos contra la protena, etc)

1. Southern blot

1. Southern blot

Bsqueda en la librera del clon de inters

con SONDAS DE ADN MARCADAS

Southern blot: colonias placas de lisis

2. Deteccin inmunolgica
mediante anticuerpos

Genoteca de expresin

3. Oligonuclotidos al azar (random primers)

4. Complementacin de funciones

Se necesita una clula hospedadora mutante para el gen que se

quiere clonar

Confirmacin de la clonacin del gen de

inters
Secuenciacin del ADN
A)
B)
C)

Maxam-Gilbert (qumico)
Sanger (Dideoxy, enzimtico)
Mtodos alternativos (pirosecuenciacin, arreglos cclicos,
hibridizacin, microelectroforesis, espectrometra de masa,
nanoporos, )

Secuenciacin del ADN

Mtodo de Sanger (Dideoxy)
Secuenciacin enzimtica.
Es posible separar molculas de ADN monocatenario con diferencias
de longitud de slo un nucletido mediante electroforesis en geles de
poliacrilamida.
Implica la sntesis de nuevas cadenas de ADN complementarias a las
del molde de una sola cadena.

Secuenciacin del ADN

Mtodo de Sanger (Dideoxy)
Utiliza
(ddATP).

dideoxyribonucletidos

trifosfatos

Bloquea la elongacin adicional porque tiene un

tomo de hidrgeno en lugar de un grupo
oxhidrilo unido al carbono 3.
La incorporacin del ddATP da origen a cadenas
que son terminadas frente a la T del molde. Esto
genera la familia A de las molculas terminadas.
La incorporacin de los otros
nucletidos genera familias C, G y T.

dideoxy

Mtodo de Sanger
(Dideoxy)

Secuenciacin

Secuenciacin

Secuenciacin

Electroferograma

Pirosecuenciacin

Es una tecnologa de determinacin de secuencia de ADN a gran escala, aplicable

a genomas completos, mediante luminescencia.

A diferencia del sistema de Sanger, capaz de resolver 67.000 bases cada hora, el
mtodo 454 puede determinar la secuencia de 20 millones en 4,5 horas, lo cual
abarata enormemente el costo del proceso.

Determinacin rpida de secuencias muy cortas.

No requiere electroforesis ni separacin de fragmentos. Ms rpida.

Slo puede generar unas pocas decenas de pares de bases por experimento. Muy
valiosa cuando se quiere generar muchas secuencias cortas lo ms rpidamente
posible.

Pirosecuenciacin
Se basa en la deteccin de la actividad de la ADN polimerasa con otra enzima
quimioluminescente.
Secuenciacin de un ADN simple cadena sintetizando la complementaria un
par de bases a cada vez, y detectando cual base es aadida en cada paso.
El molde est inmovilizado y las soluciones de A, C, G, y T son aadidas y
removidas despus de la reaccin, secuencialmente.
La luz es producida solo cuando la solucin de nucletidos complementa el
primer par de bases desapareado del molde.
La secuencia de soluciones que produce seales de quimioluminescencia lleva a
la determinacin de la secuencia del molde.

Pirosecuenciacin
Etapas del proceso:
Un cebador especfico se une a una cadena de ADN sencilla en presencia de dNTPS,
ADN polimerasa, ATP sulfurilasa, luciferasa y apirasa as como de los sustratos APS
(adenosina 5 fosfosulfato) y luciferina.
El primero de los cuatro dNTPs se aade a la reaccin. La ADN polimerasa cataliza su
incorporacin a la cadena; si este dNTP es complementario de la secuencia del ADN
molde se libera PPi en una cantidad equimolar a la cantidad de nucletido incorporado.

Pirosecuenciacin
La ATP sulfurilasa convierte cuantitativamente el PPi en ATP en presencia de APS (adenosina 5
fosfosulfato). Este ATP media la conversin de luciferina en oxiluciferina por parte de la
luciferasa, producindose luz visible en intensidad proporcional a la cantidad de ATP. Esta luz es
detectada por una cmara y se visualiza en el pirograma como un pico, siendo la altura del pico
proporcional al nmero de nucletidos incorporados.
La apirasa degrada de forma continua tanto el ATP como los dNTPs no incorporados apagando
de esta forma la emisin de luz y regenerando las condiciones para que pueda ser aadido un
nuevo nucletido en la reaccin.

Pirosecuenciacin
Su bajo costo y velocidad, que permiti a la
compaa secuenciar el cdigo de un adenovirus en
el ao 2003 en un slo da, plantea la posibilidad
de secuenciar genomas completos de forma
rutinaria, lo cual es de especial inters en
biomedicina.
El genoma de James Watson, co-descubridor de
la estructura del ADN, fue descrito y publicado
mediante esta tcnica.

Pirosecuenciacin

Anlisis de la secuencia

Aplicaciones de la secuenciacin de ADN

Deteccin de mutaciones, sitios de regulacin, promotores, sitios
de unin de protenas, etc.
Determinacin de la posible funcin de las protenas codificadas
por la secuencia en estudio.

Anlisis de ADNs fsiles.

Diagnstico de enfermedades genticas.

Identificacin de especies y control de cruces entre animales.

Mapas genticos. Localizacin de los genes en el cromosoma.
Proyecto genoma humano.

Mapeo de genes: caminando sobre el

cromosoma

PCR (Reaccin en cadena de la polimerasa)

Mtodo simple y especialmente muy rpido de multiplicar el ADN
presente en diferentes muestras biolgicas para posibilitar su
identificacin, al permitir la obtencin de millones de copias de una
determinada secuencia de ADN

Kary B. Mullis (1980)

Premio Nobel de qumica en 1993

Requerimientos para la PCR

ADN molde ( ARN)

Oligonucletidos especficos
cadena del ADN molde

complementarios

4 dNTP
ADN Polimerasa (Taq polimerasa )
Iones (Mg++)

de

cada

Etapas de una reaccin PCR clsica

Desnaturalizacin del ADN
molde (90-95C/5-60)
Hibridizacin
de
los
oligonucletidos especficos
al molde (30-70C/5-300).
Depende del primer.

Elongacin
300)

(72-75C/30-

Terminacin (72-75C/3-10)

Etapas de una reaccin PCR clsica

Amplificacin geomtrica Y=(X)n

Etapas de una reaccin PCR clsica

Anlisis del producto PCR

Variantes de la PCR

AFLP (amplified fragment length

polymorphisms)

PCR asimtrica

PCR en colonia

DD-PCR (differential display

PCR)

PCR degenerada

Host start PCR

PCR in situ

PCR inversa

PCR larga

Multiplex PCR

Nested PCR

Variantes de la PCR
PCR-Elisa
PCR-RFLP (PCR restriction fragment length polymorphism)
PCR-SSCP (PCR-single stranded conformational polymorphism)
QC-PCR (quantitative competitive-PCR)

Real time-PCR
Rep-PCR (repetitive extragenic palindromic-PCR)

RT-PCR (reverse transcriptase-PCR)

RACE (rapid amplification of cDNA ends)
RAPD (randomly amplified polymorphic DNA)

RT-PCR (reverse transcriptase-PCR)

El molde es ADNc

Real-Time PCR (PCR en tiempo real)

Utilizada para amplificar y simultneamente cuantificar de forma
absoluta el producto de la amplificacin de cido desoxirribonucleico
(ADN).
Es la metodologa ms moderna para el estudio de la expresin gnica
junto a los chip de ADN o microarreglos.
Emplea una sustancia marcada con un fluorforo que, en un
termociclador que albergue sensores para medir fluorescencia tras
excitar el fluorforo a la longitud de onda apropiada, permita medir la
tasa de generacin de uno o ms productos especficos.
Dicha medicin, se realiza luego de cada ciclo de amplificacin y es por
esto que tambin se le denomina PCR en tiempo real. En muchos casos
el molde que se emplea para la PCR cuantitativa no es desde el principio
ADN, sino que puede ser ADN complementario (ADNc), en este caso, la
tcnica es una RT-PCR cuantitativa, RT-PCR en tiempo real o RT-QPCR.

Real-Time PCR (PCR en tiempo real)

Este mtodo se basa en la deteccin de fluorescencia la cual es proporcional a la cantidad de
producto de PCR producido.
Uso de tres iniciadores. Dos normales de una reaccin de PCR. El tercero hibridizar entre los dos
anteriores
Contiene dos nucletidos modificados: en 5 un fluorocromo (normalmente 6-carboxyfluoresceina
6-FAM) y en cualquier T del iniciador se le aade 6-carboxi-tetrametil-rodamina (TAMRA).
El 6-FAM emite fluorescencia detectable por un sensor adecuado, pero cuando una molcula de
TAMRA esta cerca dicha fluorescencia es inhibida. Por tanto, el iniciador no emite fluorescencia.
Cuando la Taq polimerasa realiza la copia y llega al primer, su actividad exonucleasa lo degrada,
separando el 6-FAM del inhibidor y produciendo fluorescencia, que resultar proporcional a la
cantidad de producto generado. Dicha fluorescencia puede ser medida en cada ciclo en un aparato
adecuado.

Real-Time PCR (PCR en tiempo real)

Como el primer est unido, la Taq

polimerasa puede sintetizar la cadena
complementaria.

El colorante reportero es liberado

de la doble cadena de ADN
extendida creada por la Taq pol.
Lejos del quenching, la luz emitida
por el reportero, en un estado
excitado, es cuantificada.

Real-Time PCR (PCR en tiempo real)

Para el anlisis cuantitativo del producto,

se analiza la curva de amplificacin, la
cual est constituida por al menos tres
fases distintas: 1) fase de latencia (lag)
donde la acumulacin de producto no se
puede detectar, 2) fase exponencial y 3)
fase de saturacin.

Aplicaciones generales de la PCR en tiempo real

Determinar la carga viral, el ttulo de grmenes y contaminantes en la

comida, sangre u otro tipo de muestras, la expresin gnica en distintos
tejidos, tratamientos o estadios del desarrollo.

Adems, tiene aplicaciones clnicas muy importantes, como el

diagnstico de tumores, la respuesta a medicamentos en cnceres
humanos y el perfil de citocinas en la respuesta inmune.

PCR in situ

PCR de colonias

Aplicaciones generales de la PCR

Amplificacin para clonacin de genes de inters

Secuenciamiento del ADN

Diagnstico de enfermedades infecciosas (SIDA, Papiloma virus humano,

Hepatitis C, Tuberculosis, Chlamidia, Herpes, Malaria, etc.)

Estudio de enfermedades genticas (enfermedad de Duchenne, fibrosis

qustica, etc.)

Oncologa

Medicina legal y forense (huellas dactilares del ADN)

Estudios del ADN ancestral y sus relaciones evolutivas

Sistemtica moderna, ecologa y comportamiento animal

Estudio de la regulacin de la expresin

gentica
Niveles de expresin de genes
ARNm
Protena
Tcnicas para estudiar expresin gentica a nivel del ARN

Northern Blot
RT-PCR, PCR en tiempo real
Fusiones gnicas
MicroArray o microarreglos

Estudio de la
regulacin de la
expresin gentica
(in vitro)
ADN: Southern Blot
ARN: Northern Blot

Estudio de la regulacin de la expresin gentica

in vivo: fusiones gnicas
Genes reporteros

Gen cuyo producto es fcilmente

detectable. Se usa en construcciones
genticas para verificar la transferencia
de un transgn a una clula o tejido, o
para estudiar la actividad de promotores
y
otras
secuencias
reguladoras.

Genes reporteros
(in vivo)

Genes reporteros
lacZ (B-gal), gus (glucuronidasa), lux (luciferasa), gfp (protena
fluorescente verde GFP)

LUX

GFP

GUS

Genes reporteros
GFP

ALBA

Genes reporteros

Genes reporteros

The Jellyfish Aequorea victoria

Fusiones gnicas

Fusiones transcripcionales
Transcripcin del gen reportero bajo
el control de un promotor. GR posee
su propio sitio de iniciacin de
traduccin. Traduccin del gen
mutado se para antes del GR y se
reinicia en el GR. Dos productos:
protena truncada y protena del GR
Fusiones traduccionales
Transcripcin y traduccin del GR
bajo el control del promotor. No hay
codn de terminacin. GR no posee
sitio de iniciacin de traduccin.
Traduccin contina directamente del
gen mutado al GR. Un producto:
protena hbrida con el N-ter de la
protena del gen truncado y C-ter de
la protena del GR

Fusiones

Transcripcional
(opernica)

Traduccional
(gnica)

Fusiones gnicas
Fusiones opernicas:
Transposn derivado del fago
Mu: MudJ

Fusiones gnicas:
Transposn derivado del fago
Mu: MudK

Estudio de la regulacin de la expresin gentica

in vivo: fusiones gnicas

Microarreglos de ADN
Chip de ADN (del ingls DNA microarrays) es una superficie slida a la cual se unen
una serie de fragmentos de ADN (vidrio, plstico e incluso chips de silicio).
Los arreglos de ADN son utilizadas para analizar la expresin de genes,
monitorizndose los niveles de miles de ellos de forma simultnea.
Microarreglo de ADN: portaobjeto de vidrio en la cual se ha colocado mediante un
robot cientos de muestras de ADN, ADNc u oligonucletidos de identidad conocida y de
manera ordenada. La gota es menor de 200 micrones y en el orden de sub-nanomoles.

Expresin gnica analizada cuantitativamente mediante hibridizacin de ARNm

marcados (muestra desconocida) y ADN del microarreglo (sonda).
Los productos de PCR de dos muestras diferentes son marcados con dos fluorocromos
diferentes e hibridizados con el microarreglo.

Los fluorocromos son excitados con lser y la fluorescencia emitida evaluada.

El proceso de scanning produce una archivo de imgenes. La expresin diferencial de
los puntos a partir de la imgen es cuantificada.

Microarreglos de ADN
Cada
punto
del
microarreglo
contiene
mltiples
secuencias
idnticas de ADN.
La secuencia de ADN de cada punto
es nica.
Cada punto representa un gen.

Cientos de gotas son arregladas de

manera ordenada sobre la superficie
slida.
La localizacin precisa de cada
punto es registrada en una base de
datos de una computadora.

Biochip

Tipos de microarreglos
1. Microarreglo para anlisis de expresin: muestra inmovilizada es ADNc
derivado de ARNm de genes conocidos. Ej. Genes de un tejido normal y
de un tejido enfermo. Marca ms intensa del tejido enfermo si el gen es
sobre-expresado en la condicin enferma.
2. Microarreglo para anlisis de mutaciones: se utiliza ADN genmico.
Genes pueden diferir en un nucletido.
3. Microarreglo para hibridizacin comparativa del genoma: se utiliza
para la identificacin del aumento o disminucin de fragmentos
importantes del cromosoma (codificando genes involucrados en una
enfermedad).

Aplicaciones de los microarreglos

Estudio de la expresin gentica bajo diferentes condiciones.

Descubrimiento de nuevos genes y sus funciones.

Diagnstico de enfermedades: corazn, mentales, infecciosas y cncer

Descubrimiento de drogas (farmacogenmica): estudio de la correlacin

entre la respuesta teraputica a drogas y el perfil gentico del
paciente.

Investigacin toxicolgica (toxicogenmica): estudio de la correlacin

entre la respuesta a txicos y los cambios en el perfil gentico de los
individuos expuestos.

Anlisis de polimorfismo, mapeo de genes, estudios evolutivos.

Microarreglos de pequeas molculas y protenas estn en desarrollo.

Polimorfismo
Presencia en una poblacin de al menos dos variantes allicas de
un locus gentico
Anlisis: polimorfismo del ADN (polimorfismo genotpico) o del
producto proteico (polimorfismo fenotpico)

Marcadores Moleculares de ADN

Cualquier diferencia fenotpica controlada genticamente.

Cualquier molcula orgnica o inorgnica, caracterstica de un organismo
o proceso es un marcador.
Cualquier fragmento que se encuentre muy cerca del gen o de la
secuencia de inters y que no afecte el carcter en estudio.

Marcadores Moleculares de ADN

Revelan sitios de variacin de la secuencia de ADN.

Se basan en el anlisis de las diferencias en pequeas secuencias de

ADN entre individuos.

Tipos de Marcadores de ADN

1. Marcadores detectados por hibridacin con sondas marcadas.

RFLP (Polimorfismo de la Longitud de los Fragmentos de Restriccin)

2. Marcadores obtenidos por amplificacin mediante PCR.

RAPDs (Amplificacin Aleatoria del ADN Polimrfico)

Microsatlites (Secuencias simples repetidas SSRs)
PCR-RFLP
AFLP (Polimorfismo en la Longitud de los Fragmentos Amplificados)
ADNc-AFLP
Otros

1. Marcadores detectados por hibridacin

con sondas
RFLP (Polimorfismo de la Longitud de los Fragmentos de Restriccin)
Hibridacin diferencial entre una sonda y un fragmento de ADN
digerido con una enzima de restriccin.
El marcador es especfico de una combinacin de restriccin:sonda.
El polimorfismo en el patrn de restriccin: alteracin de 1 nucletido por
mutacin puntual (prdida o ganancia de un nuevo sitio de restriccin).

RFLP

2. Marcadores obtenidos por amplificacin

mediante PCR

RAPDs (Amplificacin Aleatoria del ADN Polimrfico)

Microsatlites (Secuencias simples repetidas SSRs)
PCR-RFLP
AFLP (Polimorfismo en la Longitud de los Fragmentos Amplificados)
ADNc-AFLP
Otros

AP-PCR (PCR con oligonucletidos arbitrarios)

AFLP (Polimorfismo de la longitud de los fragmentos amplificados)
STS (Sitios etiquetados por la secuencia)
SSLP (Polimorfismo de longitud en las secuencias discretas)
EST (Sitios etiquetados por la expresin)
CAPS (Secuencia polimrfica amplificada y cortada)
SCAR (Regiones amplificadas caracterizadas y secuenciadas)
D/TGGE (Geles de electroforesis en gradiente desnaturalizante/trmico)
SSCP (Polimorfismo de conformaciones monocatenarias)

Microsatlites

Segmentos de ADN conteniendo

repeticiones en tandem de
motivos cortos (2, 3, 4 nt)
GA, GT, GC o AGCT

Muy numerosos y dispersos por

todo el genoma
Polimorfismo multiallico

Microsatlites

PCR-RFLP
Combina la amplificacin mediante PCR y
la digestin con enzimas de restriccin.
Cebadores especficos.
Polimorfismo: inserciones, deleciones y
mutaciones puntuales que afecten a los
sitios de restriccin.
Estudios de
poblaciones.

filogenia,

gentica

de

Requiere conocimiento de la secuencia.

AFLP (Polimorfismo en la Longitud

de los Fragmentos Amplificados)
Intermedia entre RFLPs y PCR.
Polimorfismo: presencia o ausencia de bandas debido a mutaciones en los
sitios de restriccin, o en las secuencias adyacentes, inserciones o deleciones
dentro del fragmento amplificado.
Combina digestin con enzimas de restriccin del ADN con una
preamplificacin y una amplificacin selectiva de los fragmentos de
restriccin.

AFLP (Polimorfismo en la Longitud

de los Fragmentos Amplificados)

Amplificacin selectiva con

cebadores especficos
Separacin de fragmentos en
gel de poliacrilamida (secuencia)
Visualizacin de fragmentos
(deteccin).

AFLP
(Polimorfismo en
la Longitud de los
Fragmentos
Amplificados)

Marcadores Moleculares
Aplicaciones
1. Estudio de la diversidad gentica.
2. Obtencin de huellas genticas (fingerprinting) genmicas de
individuos, variedades y poblaciones.
3. Anlisis de la estructura y diversidad gentica en poblaciones naturales.
4. Establecimiento de relaciones filogenticas entre diferentes individuos y
especies.
5. Construccin de mapas genticos de alta cobertura genmica.
6. Localizacin de genes de inters econmico.
7. Mapeo de caractersticas de herencia cuantitativa QTL (Quantitative
Trait Loci ).
8. Relaciones de paternidad y parentesco.
9. Procesos que ocurren en las poblaciones: migracin, deriva gentica.

Clonacin de mamferos

DOLLY

Animales transgnicos

POLLY
Izquierda:
clon transgnico de Polly.
Se incorpor el gen para
una protena humana, el
factor IX (coagulacin)

Terapia gnica
Somtica
Germinal

Terapia gnica

In-vivo

Ex-vivo

Terapia gnica

Vectores para Terapia Gnica

Vectores para
Terapia Gnica

Vector: Adenovirus

Vectores para Terapia Gnica

replicar
recombinar

expresar

mutar

reprimir
silenciar

GEN

dominar
transmitir
detectar

multiplicar
transferir

fusionar

modificar
clonar

Microbiologa

Bioqumica
Inmunologa

Biologa
Molecular

Biologa
Celular

Vegetales

Gentica

Biotecnologa
Molecular

Drogas

Vacunas

Diagnstico

Investigacin

Ingeniera
Qumica

Animales