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RESUMEN
La campilobacteriosis genital bovina es una enfermedad venrea caracterizada por infertilidad,
mortalidad embrionaria temprana y aborto. El agente causal de esta enfermedad de transmisin
sexual es Campylobacter fetus subespecie venerealis. El reservorio natural de esta bacteria es el
prepucio de toros sanos portadores. Campylobacter fetus se divide en dos subespecies: C. fetus
subesp. venerealis y C. fetus subesp. fetus.
La campilobacteriosis genital bovina est causada por C. fetus subes. venerealis, que es una
bacteria con un tropismo pronunciado para el sistema genital del ganado bovino. La transmisin
del agente causal se produce normalmente durante el apareamiento natural, pero la presencia de
C. fetus subes. venerealis en el semen de toros portadores crnicos origina el riesgo de extender
la enfermedad por inseminacin artificial. Campylobacter fetus subesp. fetus se puede encontrar
en el tracto intestinal del ganado bovino y de otras especies animales. Su papel patgeno es
comparativamente menor que el de C. fetus subes. venerealis, aunque se asla con frecuencia de
fetos bovinos abortados, lo que demuestra que esta subespecie tiene importancia clnica en el
ganado. Campylobacter fetus subes. fetus persiste en novillas vrgenes despus de la infeccin
experimental durante al menos varias semanas y hasta 10 o ms meses.
La campilobacteriosis genital bovina se diagnostica a partir de muestras obtenidas de toros, vacas
o fetos abortados. El diagnstico se lleva a cabo por demostracin del microorganismo causante, o
de una respuesta inmune especfica contra l. En el caso de los toros, se pueden recoger
muestras de semen o de secreciones del esmegma prepucial. En las vacas, las muestras de
mucus se obtienen por succin, lavado vaginal o mediante el uso de tampones. Se pueden
examinar los rganos internos de los fetos abortados para investigar la presencia de la bacteria
mediante cultivo, y analizar preparaciones en fresco del contenido estomacal para observar al
microorganismo por microscopa de campo oscuro y de contraste de fases.
Identificacin del agente: El microorganismo es un bacilo Gram-negativo curvado en forma de
espirilo, de aproximadamente 1,5 m de largo por 0,5 m de ancho. Se puede cultivar por
incubacin microerfila a 37C por un mnimo de 3 das. La confirmacin del aislamiento y la
diferenciacin entre las subespecies de C. fetus se puede llevar a cabo por mtodos bioqumicos o
moleculares.
Tambin se puede utilizar inmunofluorescencia para identificar al microorganismo, pero esta
prueba no diferencia entre subespecies.
Se han descrito en la literatura pruebas especficas para C. fetus y para cada una de las dos
subespecies basadas en la reaccin en cadena de la polimerasa.
Pruebas serolgicas: La aglutinacin con mucus vaginal constituyen una prueba til para
poblaciones, aunque no son adecuadas para identificar animales individuales infectados. Los
animales deben ser seleccionados cuidadosamente para las pruebas, pues en manadas infectadas
se ven algunos animales libres de la infeccin. Despus de la infeccin, existe una fase adaptativa
antes de que se desarrollen los anticuerpos. Adems, las aglutininas tienden a desaparecer con el
estro.
El enzimoinmunoensayo es una prueba ms sensible, pero debe utilizarse como prueba
poblacional ms bien que para probar individuos.
477
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnstico: Una vacuna puede prepararse
con C. fetus subesp. venerealis o con C. fetus subesp. fetus, que comparte antgenos con C. fetus
subesp. venerealis. Esta vacuna se inactiva con formalina y se puede administrar con una
emulsin de aceite como adyuvante.
A. INTRODUCCIN
El gnero Campylobacter (antes incluido en el gnero Vibrio) (38) comprende muchas especies, de las que C.
fetus, C. sputorum, C. jejuni y C. coli pueden aislarse del ganado bovino. Existen dos subespecies de C. fetus: C.
fetus subesp. venerealis y C. fetus subesp. fetus. La que causa la campilobacteriosis genital bovina es C. fetus
subesp. venerealis (14, 42). Se han descrito y designado como C. fetus subesp. venerealis biotipo intermedius,
algunas variantes de C. fetus subesp. venerealis que toleran la glicina (34).
Utilizando los modelos de bandas de las protenas de clulas enteras, que aparecen mediante electroforesis en
gel de poliacrilamida (PAGE), no pueden distinguirse las dos subespecies de C. fetus (39). Mediante diferencias
antignicas, se han descrito varios serotipos de C. fetus (3, 32).
Los estudios de homologa de ADN no han podido revelar diferencias importantes entre las subespecies
venerealis y fetus (18). Sin embargo, mediante anlisis numrico de los modelos electroforticos en gel de
campo pulsante (PFGE) ha sido posible la separacin de C. fetus en dos subespecies (28). Existe un acuerdo
considerable entre los resultados de la PFGE y la identificacin basada en mtodos fenotpicos o en la reaccin
en cadena de la polimerasa (PCR). El anlisis del polimorfismo de los fragmentos de restriccin amplificados
(AFLP), recientemente desarrollado, tambin diferencia entre ambas subespecies (43), como lo hace un ensayo
de PCR de reciente aparicin (21). No obstante, segn se describe en el trabajo original, por este mtodo de
PCR no se clasifican correctamente en subespecies hasta un 10% de las cepas (21), y esta observacin se ha
confirmado en un estudio posterior (43). La diferenciacin taxonmica de C. fetus en dos subespecies est
justificada debido a las diferencias clnicas y epidemiolgicas entre ellas. Epidemiolgicamente, C. fetus subesp.
venerealis es la ms importante de las dos debido a su tropismo genital. Campylobacter fetus subesp. fetus se
puede recoger del tracto intestinal del ganado bovino y de otros animales. Su papel patognico es menor
comparado con el de C. fetus subesp. venerealis, aunque C. fetus subesp. fetus se asla con frecuencia de fetos
bovinos abortados indicando que esta subespecie tiene relevancia clnica en el ganado. Campylobacter fetus
subesp. fetus persiste en novillas vrgenes despus de infeccin experimental durante al menos varias
semanas y hasta 10 meses o ms (25, 29, 35).
B. TCNICAS DE DIAGNSTICO
1.
a)
Toma de muestras
i)
478
ii)
iii)
b)
Transporte de muestras
i)
Medio de Clark
El medio de Clark es un medio excelente, pero su preparacin es larga y difcil, lo que limita su uso
rutinario cuando hay que procesar muchas muestras. Contiene suero bovino estril ms 5-fluorouracilo
(300 g/ml), sulfato de polimixina B (100 UI/ml), verde brillante (50g/ml), cido nalidxico (3 g/ml) y
cicloheximida (100 g/ml). La mezcla se distribuye en botellas de 10 ml con tapn de goma y una
tapadera metlica con un hueco central a travs del cual se puede insertar una aguja en el tapn. Las
botellas llenas se colocan en un bao de agua a 100C. Cuando el medio se solidifica se atraviesa el
tapn de goma con una aguja hipodrmica y se reemplaza el aire interior por una mezcla de 5% de
oxgeno, 5% de dixido de carbono y 90% de nitrgeno. Este paso se realiza dentro de una jarra para
anaerobios. El medio preparado debe mantenerse durante 1 semana en un refrigerador antes de
usarlo. Su duracin es de 3 meses a 4C.
Se inyecta aproximadamente 1 ml de la muestra problema en el medio empleando una jeringa, con la
aguja atravesando el tapn de goma. La botella se mantiene aproximadamente a 18C y se enva al
laboratorio. El tiempo de transporte al laboratorio no debe superar las 48 horas.
Cuando la botella llega al laboratorio, se incuba 4 das a 37C y despus se introducen 3 ml de
solucin salina normal. Despus de agitar vigorosamente el medio se extrae 1 ml de lquido para
pruebas posteriores de aislamiento de Campylobacter en cultivo o por inmunofluoresecencia.
Medio de Lander
Se trata de caldo de Mueller-Hinton con 5 g de carbn vegetal bacteriolgico/litro, aadido antes de la
esterilizacin. Cuando se emplea, se aade a cada litro lo siguiente en condiciones estriles: dos
botellas de "suplemento para crecimiento de Campylobacter" (Oxoid), sangre hemolizada de caballo
(70 ml), vancomicina (40 mg), sulfato de polimixina B (10.00 UI), cicloheximida (100 mg), trimetoprim
(20 mg) y 5-fluorouracilo (500 mg). El medio se distribuye en volmenes de 10 ml en recipientes de
28 ml. Pueden mantenerse por lo menos durante 2 semanas a 4C.
Este medio se inocula con muestras problema despus de pasar stas por filtros de 0,65 m de
tamao de poro. Despus de incubar a 37C durante 3 das el medio se distribuye en medios de
cultivo y de aislamiento.
479
Los frotis de varias muestras se colocan en este medio de transporte y se envan en un recipiente con
aislamiento (a 18-30C) para que lleguen al laboratorio en 24-48 horas.
c)
Tratamiento de muestras
Cuando llegan al laboratorio, las muestras deben inocularse directamente en medio de cultivo o procesarse
si se requiere (por ejemplo, mediante filtracin por membrana para reducir la contaminacin).
i)
ii)
d)
Medios no selectivos
Se puede utilizar cualquier medio basado en sangre (agar Columbia, agar sangre base No. 2) como
medio no selectivo suplementado con sangre de oveja o de caballo.
ii)
480
aislamiento. No es necesario incluir ms de un control por da a menos que se utilicen diferentes lotes
de medio, en cuyo caso debe probarse cada lote.
iii)
e)
f)
Morfologa microscpica: Campylobacter fetus es mvil, aunque esta propiedad puede desaparecer
despus de subcultivos. A menudo Campylobacter fetus presenta la forma de un bacilo curvado
fino, de 0,3-0,4 m de ancho y 0,5-8,0 m de largo. En estado vivo se pueden observar
simultneamente formas cortas (en forma de coma), medias (en forma de S) y largas (helicoidales con
varias espirales). Las bacterias siempre se presentan aisladas. Los cultivos viejos pueden contener
formas cocoides.
ii)
iii)
Oxidasa
Catalasa
H2S(a)
25C
42C
Glicina 1%
NaCl
3.5%
Cefaloiina
cido
nalidxi-co
C. fetus subesp.
venerealis
V(b)
V(b)
C. jejuni
C. sputorum biotipo
sputorum
C. sputorum biotipo
faecalis
C. sputorum biotipo
paraureolyticus
(a) = En medio de triple azcar-hierro; (b) = Aunque C. fetus no pertenece a las especies termfilas de
Campylobacter, se ha descrito el crecimiento de esta especie a 42C (12, 41);
(+) = reaccin o crecimiento positivo; () = reaccin negativa o ausencia de crecimiento de la cepa en medio apropiado en
condiciones especificadas; V = resultados variables; S = sensible; R = resistente.
i)
ii)
481
y a un medio base con sangre. La incubacin se realiza bajo las condiciones atmosfricas
especificadas. En paralelo se prueban dos cepas control.
iii)
iv)
g)
Inmunofluorescencia
Esta prueba puede aplicarse para identificar el microorganismo por la tcnica directa o para confirmar la
identificacin de una cepa aislada. No diferencia entre diferentes especies (30).
i)
ii)
Preparacin de conjugados
La fraccin de IgG se separa por precipitacin con sulfato sdico. El suero se ajusta a pH 8,0 con PBS
0,1 M y se aaden 18 g de sulfato sdico anhidro por cada 100 ml. El precipitado se recoge por
centrifugacin y se redisuelve en agua destilada a su volumen original. Se re-precipita aadiendo 12 g
de sulfato sdico/100 ml. Se recoge el precipitado, se disuelve en agua destilada a la mitad de su
volumen, y se dializa frente a PBS, pH 7,2, a 4C hasta que est libre de sulfato. Se determina el
contenido en protena y se ajusta la concentracin con PBS a 1,0-1,5 g de protena por 100 ml (por
ejemplo, seroalbmina bovina). Esta solucin se ajusta a pH 9,0 con carbonato sdico 1M. Se aade
el ismero 1 de isotiocianato de fluorescena (FITC) en un volumen mnimo de carbonato sdico 0,1 M
a una concentracin final de 15 mg FITC/1,0 g de protena. Esto se agita durante 18 horas a 4C. La
mezcla se ajusta a pH 7,0 con cido clorhdrico 0,1 M y se dializa frente a PBS a 4C con frecuentes
cambios. Los restos de FITC libre se eliminan por filtracin en gel de Sephadex G25, y el producto
final se guarda a -20C o a temperatura inferior en pequeas alcuotas.
482
La dilucin de trabajo del conjugado se determina probando varias diluciones en PBS con frotis de un
cultivo de C. fetus, y seleccionando el doble de la concentracin ms baja que produce fluorescencia
brillante con estos microorganismos de ensayo. Por microscopa de alta resolucin, los
microorganismos fluorescentes tienen una morfologa tpica y frecuentemente se concentran en los
bordes del frotis.
iii)
Prueba de inmunofluorescencia
Las muestras se fijan a portaobjetos de vidrio, se tien con el antisuero conjugado con FITC, y se
examinan para presencia de microorganismos fluorescentes. La tincin se realiza en una cmara
hmeda a 37C durante 30 minutos. Los portaobjetos se lavan luego hasta eliminacin del conjugado
libre, se someten a dos lavados con PBS (10 minutos cada lavado), y se montan con glicerol
tamponado (80% [v/v] de glicerol: 20% de tampn fosfato 0,1 M, pH 8,0).
Los cubreobjetos se sellan para evitar el secado y los portaobjetos se examinan en un microscopio de
luz ultravioleta.
h)
2.
Las pruebas para anticuerpos incluyen la prueba de aglutinacin del mucus vaginal y el enzimoinmunoensayo
(ELISA).
a)
483
salino. Luego se ponen 0,5 ml de la muestra problema en el primer y segundo tubo. Se mezcla el contenido
del segundo tubo y se transfiere 0,5 ml al tercer tubo. Se mezcla el contenido del tercer tubo y se eliminan
0,5 ml. A continuacin, se aade a cada tubo 0,5 ml de una dilucin estandarizada del antgeno y se
mezcla bien. Despus de incubar a 37C durante 18 horas, las pruebas se observan con luz oblicua sobre
un fondo negro. Cada dilucin se valora como sigue:
Agua clara
75% claridad
50% claridad
25% claridad
No claridad
=
=
=
=
=
++++
+++
++
+
-
Se debera realizar al mismo tiempo una titulacin de un control positivo utilizando el mismo mtodo que
para determinar el ttulo de un antgeno frente a un antisuero positivo conocido. El antgeno se utiliza a la
misma dilucin estandarizada frente a diluciones del suero positivo. Los resultados se pueden validar si se
obtiene el ttulo esperado utilizando las muestras de control positivo.
Un resultado positivo es aquel en el que se produce el 50% de aglutinacin en el tercer tubo (dilucin 1/80),
o despus si se usan ms de tres tubos. La reaccin es dudosa si hay menos evidencia de aglutinacin. Se
considera que la prueba del mucus es til para el diagnstico de la campilobacteriosis genital, pero debe
resaltarse que la interpretacin de los resultados ha de hacerse a nivel poblacional. Para utilizar mejor la
prueba es necesario seleccionar con cuidado los animales, ya que incluso en poblaciones con una extensa
infeccin es probable que algunos animales escapen a la infeccin. Hay un perodo variable de adaptacin
entre la infeccin y el desarrollo de una prueba de aglutinacin positiva, y en la fase del estro las aglutininas
tienden a desaparecer del mucus parcialmente o por completo, aunque pueden presentarse a altas
concentraciones en otras fases del ciclo. En cualquier caso, los ttulos de aglutinacin tienden a
desaparecer con el tiempo.
b)
Enzimoinmunoensayo
Se dispone de un ELISA para detectar anticuerpos secretorios IgA especficos de antgeno en el mucus
vaginal despus de el aborto debido a C. fetus subesp. venerealis (17, 19). Estos anticuerpos son
duraderos, y su concentracin permanece constante en el mucus vaginal durante varios meses (22).
El muestreo inicial puede realizarse despus del primer perodo involucional (normalmente 1 semana
despus del aborto) cuando el mucus se hace ms claro.
Se ha descrito recientemente un ELISA para detectar la respuesta srica humoral de IgG despus de la
vacunacin (33).
Se crece Campylobacter fetus subesp. venerealis en agar con 7-10% de sangre en condiciones
microaerbicas a 37C durante 3 das. Las placas se analizan para pureza y se transfieren colonias a 0,5%
de formol salino durante 1 hora, se centrifuga a 17.000 g, se lava dos veces con PBS, pH 7,5, y se
resuspende a continuacin en tampn carbonato 0,05 M, pH 9,6. La absorbancia final se ajusta a 0,21 a
610 nm. Se dejan durante la noche a 4C placas de poliestireno para microtitulacin de fondo plano
antigenizadas con 10 l de antgeno, que se guardan luego a -20C. Antes de uso, las placas se lavan dos
veces con agua destilada y despus se elimina la humedad de ellas con cuidado.
484
Procedimiento de la prueba
i)
Se aade a cada pocillo el mucus vaginal diluido (100l) y la placa se incuba durante 2 horas a 37C.
ii)
Se lavan las placas como antes y se aaden 100 l de IgA anti-bovina de conejo.
iii)
Despus de una incubacin de 2 horas a 37C, se lavan las placas y se aaden a cada pocillo 100 l
de IgG anti-conejo de cabra conjugada a peroxidasa de rbano.
iv)
Despus de otras 2 horas de incubacin a 37C, se lavan las placas y se aaden 100 l de substrato
(cido 5 amino-saliclico [0,8 mg/l], pH 6,0, activado inmediatamente por la adicin de 2% de perxido
de hidrgeno [H2O2]).
v)
Las placas se dejan a temperatura ambiente durante 30 minutos y se detiene la reaccin aadiendo
50 l de hidrxido sdico (NaOH) 3 M. La absorbancia se mide en un lector ELISA a 450 nm.
vi)
Interpretacin de los resultados: cada muestra se prueba en duplicado, y en cada placa se incluye
controles positivos y negativos. Las medidas de absorbancia de las muestras problema se corrigen
para las medidas de absorbancia de los controles positivos y negativos segn la frmula siguiente:
Absorbancia muestra- Absorbancia control negativo
Resultado = ________________________________________________
Absorbancia control positivo - Absorbancia control negativo
100
1.
Control de inculos
a)
b)
Mtodo de cultivo
El crecimiento inicial del inculo tiene lugar en medio slido. ste consiste en un medio basal al que se
aade 0,16% de Bacto agar. El medio basal se compone de 2,8% de caldo de Brucella, 0,5% de extracto de
levadura, 1,2% de succinato sdico, y 0.001% de cloruro clcico. El cultivo inicial se mantiene 3 das a 37C
en una atmsfera de 5% de CO2, 5% de O2 y 90% de N2. El cultivo se pasa a tubos adicionales con medio
semislido y se incuba durante 48 horas. El material resultante se utiliza para produccin de vacuna.
c)
2.
Mtodo de produccin
El material de siembra se cultiva en medio lquido formado por medio basal al que se aade 0,025% de
tioglicolato sdico. Estos cultivos se incuban durante 24 horas a 37C con agitacin a 80 rpm. Se recogen los
lquidos y se aade formaldehdo a una concentracin final de 0,2%.
485
La vacuna se mezcla con un adyuvante de emulsin de aceite para alargar el perodo de inmunidad.
3.
Se debe comprobar la identidad del microorganismo por cultivo e identificacin, as como la ausencia de
microorganismos contaminantes.
4.
Control de lotes
a)
Esterilidad
Las pruebas para esterilidad y ausencia de contaminacin del material biolgico se pueden encontrar en el
captulo I.1.5.
b)
Inocuidad
El proceso de inactivacin debe ser completo. Esto se comprueba inoculando el equivalente de una dosis
en el mismo medio y bajo las mismas condiciones que las utilizadas en el proceso de produccin. Este
cultivo se incuba 72 horas en las mismas condiciones, despus de las cuales no debe haber evidencia de
crecimiento bacteriano. El producto final debe estar libre de contaminantes bacterianos y fngicos viables,
utilizando mtodos adecuados de cultivo.
Se inoculan dos cobayas con 2 ml del producto, intramuscular o subcutneamente. No debe haber una
reaccin adversa atribuible a la vacuna durante un perodo de observacin de 7 das despus de la
inoculacin.
c)
Potencia
La potencia de la vacuna puede medirse por seroconversin en conejos. Se miden sus ttulos sricos
mediante inmunofluorescencia o por la prueba de aglutinacin en tubo. Se vacunan subcutneamente, con
la mitad de la dosis utilizada en el ganado bovino, cinco conejos que sean serolgicamente negativos a una
dilucin 1/100 del suero, en dos ocasiones separadas por 14 das. Como mnimo, el suero de cuatro de los
cinco ratones, recogido 14 das despus de la segunda vacunacin, debe mostrar un incremento en el ttulo
de al menos cuatro veces.
5.
a)
Inocuidad
Ver Seccin C.4.b.
b)
Potencia
Ver Seccin C.4.c.
Agradecimiento
Partes de este captulo derivan del captulo sobre campilobacteriosis genital bovina de ediciones previas de este
Material o estn basados en l.
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