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a PGI o baja O han sido elucidado y, aunque las vas difieren en varios aspectos, en ambas
vas, la liberacin de ATP intracelular requiere aumentos en monofosfato de adenosina
cclico (cAMP). En todas las clulas, los niveles de cAMP se determinan por la velocidad
de sntesis por ciclasas y la degradacin ciclasas por las fosfodiesterasas (PDE) [6]. En las
vas de sealizacin O IGP y bajas en los eritrocitos humanos, la fosfodiesterasa
responsable de la degradacin de cAMP es una va espec fi co isoforma de PDE3 (Fig. 1)
[7]. Si se requieren incrementos en cAMP para la liberacin de ATP a partir de eritrocitos,
la inhibicin de la PDE que degrada nucletidos cclicos que podra rescatar baja liberacin
de ATP inducida O-a partir de eritrocitos DM2 [3]. De hecho, se demostr que la
incubacin de los eritrocitos DM2 con un inhibidor selectivo de PDE3 (cilostazol) restaur
la liberacin de ATP cuando estas clulas fueron expuestas a baja O [3]. La importancia de
la restauracin de esta respuesta fisiolgica a baja O se ilustra por el hallazgo que el
cilostazol tambin restaur la capacidad de los eritrocitos DM2 para estimular la dilatacin
de los aislados arteriolas musculares esquelticas expuestas a la reduccin de O
extraluminal, un modelo de aumento de la necesidad tejido O [3] . Aunque estos estudios
han proporcionado un fuerte apoyo para el uso de inhibidores de la PDE3 en DM2, la
administracin oral o intravenosa de estos medicamentos se ha asociado con los efectos
secundarios no deseados de arritmias cardacas y el empeoramiento de la insuficiencia
cardaca [8]. Por lo tanto, el uso de inhibidores de la PDE3 en DM2 no ha sido
ampliamente adoptado. La ejecucin selectiva de los inhibidores de PDE3 a los eritrocitos
en pacientes con DM2 puede aliviar los efectos secundarios mientras que proporciona los
beneficios de la restauracin de la liberacin de ATP en respuesta a bajos niveles de
oxgeno. Aqu mostramos los resultados de los estudios de viabilidad realizados para
desarrollar liposomas que podran ofrecer los inhibidores de PDE3 directamente a los
eritrocitos. Este enfoque podra permitir el uso de estos frmacos en el tratamiento de la
enfermedad vascular asociada-DM2 evitando al mismo tiempo efectos secundarios
cardiacos no deseados.
Los liposomas se han utilizado para encapsular una amplia gama de insoluble en agua
(lipfilo) o frmacos hidrfilos [9-12]. Orientacin tejidos espec fi cos utilizando
liposomas ha sido difcil, en parte porque los liposomas interactan ampliamente con
componentes de la sangre, incluyendo los eritrocitos [13-16]. Sin embargo, este reto para
los vehculos de reparto basadas en liposomas a los tejidos es una clara ventaja para su
entrega a los eritrocitos. Aqu mostramos que dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC) liposomas
formulados con cilostazol pueden ser tomados por los eritrocitos y que cilostazol liposomaentregado aumenta la liberacin de ATP a partir de eritrocitos DM2.
Materiales y mtodos
2.1. Preparacin de liposomas
Los liposomas unilamelares fueron preparados por el mtodo de extrusin [17]. DMPC (20
mg) se aadi a una solucin de cilostazol 2 mM (0,71 mg) en un / cloroformo (50/50)
mezcla de metanol. El disolvente se evapor con una corriente de argn purificado para
formar un fi lm de lpidos / drogas en las paredes de un tubo de cultivo. La pelcula de
lpido se sec adicionalmente bajo vaco durante 60 min para eliminar las trazas de
cloroformo y metanol. La pelcula seca se hidrat con 1 ml de solucin tampn (en mM:
4,7 KCl, 2,0 CaCl, 140,5 NaCl, 1,2 MgSO, 21,4 NaHCO, pH 7,4 a 37 C), dando una
dispersin de vesculas multilamelares. La solucin se extruye a travs de una membrana de
policarbonato con poros de 0,1 micras utilizando un Avanti Mini-Extrusora (Avanti Polar
Lipids). Se prepararon muestras de liposomas de control siguiendo el mismo procedimiento
pero sin cilostazol.
0.2. anlisis DLS
ndice de dimetro hidrodinmico y la polidispersidad (PDI) mediciones se realizaron en un
Malvern Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, Reino Unido). El
lser de helio-nen, 4 mW, que funciona a 633 nm, con el ngulo de dispersin fi ja en 173
, y la temperatura a 25 C. 80 muestras mu l se colocaron en cubetas desechables sin
dilucin (70 l, 8,5 mm de altura del centro Marca UV-cubetas micro). Cada punto de datos
fue un promedio de 10 exploraciones.
2.3. El anlisis por HPLC de cilostazol en liposomas
Una parte alcuota de solucin de liposomas (50 l) se diluy con metanol
(aproximadamente 1:20) y la solucin se analiz usando un HPLC equipado con un
detector UV y una columna de fase inversa (C18, 3,9? 150 mm2) con metanol como el fase
mvil. Cuando la tasa de flujo se estableci a 0,5 ml / min, el tiempo de retencin para
cilostazol fue de aproximadamente 1,5 min. Las muestras se recogieron durante la
preparacin de liposomas de la siguiente manera: Ejemplo 1: una solucin madre de
cilostazol en metanol (muestra de referencia); Muestra 2: una mezcla de lpidos con
cilostazol en metanol; Muestra 3: liposomas con cilostazol inmediatamente despus de la
hidratacin y extrusin; Muestra 4: liposomas con cilostazol pasa a travs de la columna
Sephadex G50. Todas las muestras mostraron resultados similares. El hallazgo de que los
resultados de los primeros 3 pasos eran idnticos dentro del error experimental se interpreta
en el sentido de que todo el cilostazol se incorpor en los liposomas. El resultado para la
Muestra 4 igual 87-95% de la cantidad medida en la Muestra 3. Ningn frmaco se
observ en el eluyente despus se recogieron los liposomas.
2.4. LCMS determinacin de liposomas en los eritrocitos
Los fosfolpidos se extrajeron de los eritrocitos utilizando el mtodo de Bligh y Dyer [18].
Se retir la capa de cloroformo-metanol, se sec y se resuspendi en 1,5 ml de metanol. Se
utiliz el anlisis LCMS para detectar la presencia de cilostazol y los lpidos de los
liposomas en las membranas de eritrocitos despus de la incubacin.
2.5. Estabilidad de liposomas cargados con cilostazol
Las muestras de liposomas DMPC cargados con cilostazol se prepararon como se ha
descrito anteriormente y se incubaron a 4 C. Cada 24 h, una alcuota fue tomada para el
anlisis DLS de tamao medio y la distribucin del tamao de los liposomas. DLS
mediciones se realizaron como se ha descrito anteriormente. Estabilidad de las muestras se
control durante una semana.
2.6. El aislamiento de eritrocitos humanos
La sangre completa se obtuvo de voluntarios sanos (n15) y los pacientes con diabetes tipo
2 (DM2, n6) por puncin venosa y se recoge en una jeringa que contiene 500 unidades de
heparina. La sangre se centrifug a 500 g durante 10 min a 4 C. El plasma, capa
leucocitaria, y menos de 1% de la masa de eritrocitos se eliminaron por aspiracin y se
descartaron. Los eritrocitos empaquetados se resuspendieron y se lavaron tres veces en un
tampn fisiolgico que contiene (en mM) 21,0 tris (hidroximetil) aminometano, 4,7 KCl,
2,0 CaCl2, 140,5 NaCl, 1,2 MgSO4, y 5,5 de glucosa con 0,5% fraccin de albmina de
suero bovino V, fi nal pH 7,4. Los eritrocitos se prepararon en el da de uso.
2.7. Medicin de ATP
Eritrocitos lavados se diluyeron a un hematocrito del 20% en el tampn fisiolgico. ATP se
midi por la tcnica de luciferina-luciferasa [19]. Brevemente, una muestra de 200 ml de la
suspensin de eritrocitos (0,04% de hematocrito) se inyect en una cubeta que contiene 100
ml de 10 mg / mL fi crudo re extracto de linterna y fl (Sigma, St. Louis, MO) y 100 ml de
0,5 mg / mL D -luciferin (Research Products International, Mt. Prospect, IL). La luz
emitida se detect utilizando un luminmetro (Turner Designs, Sunnyvale, CA). Una curva
estndar de ATP fue generado en el da de cada estudio. Los niveles de ATP son reportados
como nanomoles por 4? 108 eritrocitos.
2.8. La medicin de la hemoglobina libre
Para excluir la presencia de signi fi cativa hemlisis en los estudios donde se midi la
liberacin de ATP, las muestras se centrifugaron a 500 g durante 10 min a 4 C. La
presencia de hemoglobina libre en el sobrenadante se determin por absorcin de luz a una
longitud de onda de 405 nm [20]
2.9. Determinacin del efecto del anlogo de la prostaciclina, UT-15C, sobre la liberacin
de ATP a partir de eritrocitos humanos sanos en presencia de liposomas o liposomas que
contienen cilostazol en blanco
liposomas, concluimos que los liposomas de DOPC no eran un vehculo eficaz para la
entrega cilostazol, muy probablemente debido a las interacciones ineficaz o lenta con la
membrana de los eritrocitos. Para facilitar la fusin de liposomas con eritrocitos, hemos
probado dos fosfolpidos saturados con la temperatura de la fase de transicin por debajo
del rango fisiolgico, DMPC (24 C) y DLPC (? 2 C). En los experimentos de control, se
encontr que DLPC provoc cambios sustanciales en la morfologa de los eritrocitos sobre
breve incubacin. En contraste, los liposomas de DMPC no mostraron ningn efecto
adverso sobre la morfologa de los eritrocitos. Es importante destacar que la incubacin de
los eritrocitos humanos sanos con DMPC contienen signi cilostazol signi fi aument
inducida por UT-15C liberacin de ATP (Fig. 2B).
Tambin probamos liposomas hechos de DPPC que tenan ya cadenas de hidrocarburos y
una temperatura de transicin de fase ms alta (41 C). Aunque vimos ningn efecto
adverso de estos liposomas en la morfologa de los eritrocitos, no observamos aumentos en
la liberacin de ATP a partir de eritrocitos en respuesta a baja tensin O lo que sugiere que
el cilostazol no fue entregado efectivamente a por liposomas DPPC. Estos hallazgos estn
de acuerdo con un informe publicado con anterioridad a la entrega de los productos
farmacuticos bicapa asociada a eritrocitos [22].
Se utiliz el anlisis LCMS para detectar la presencia de cilostazol y los lpidos de los
liposomas en las membranas de los eritrocitos despus de la incubacin. En estos
experimentos, los eritrocitos se incubaron con liposomas cilostazol-cargado entonces
lavadas para eliminar los liposomas libres y cualesquiera molculas en la solucin tampn.
Los eritrocitos se sometieron a lisis hipotnica. La hemoglobina y otros componentes
citoplasmticos fueron descartados despus de la centrifugacin. Los lpidos y otros
componentes hidrfobos de la pastilla se extrajeron con cloroformo. Los extractos se
secaron para medir la cantidad de residuo seco, y los componentes slidos se disolvieron en
metanol y se analizaron por espectrometra de masas. Fig. 2C muestra el espectro de masas
de los eritrocitos antes de la incubacin con liposomas cilostazol-cargado.
Los lpidos de una membrana de los eritrocitos se detectan tpicamente en la regin de m / z
entre 600 y 860. La regin por debajo de m / z600 est dominado por metabolitos de
lpidos, principalmente 1-lisofosfatidilcolinas (liso-PC). Una membrana de los eritrocitos se
compone de varios lpidos que difieren en el tipo de grupo de cabeza (es decir,
fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina) y en su longitud de cadena de acilo
y la saturacin de nivel [23,24]. Estos lpidos dan lugar a una firma compleja en el espectro
de masas (Fig. 2C). Los lpidos de los liposomas, sin embargo, pueden ser fcilmente
detectados y identi fi cado en las membranas de eritrocitos basada en valores m / z
caractersticos. En ionizacin por electrospray, tres iones cuasi molecular diferentes se
crean a partir de una molcula debido a la asociacin de una molcula con HTH, Na, o K,
resultando en tres diferentes picos caractersticos en el espectro de masas. DMPC picos
aparecen a m / z 678.5, 700.5, y 716.5, y los picos cilostazol son visibles en m / z 392.1 y
408.1 (Fig. 2D). Stoll et al. [22] mostr que los cortos lpidos longitud de cadena de acilo
tienen una mayor afinidad a cualquiera de incorporar en las membranas de los eritrocitos o
se adhieren a ella en comparacin con los de largo acilo lpidos longitud de la cadena. La
presencia de ambas molculas de DMPC y cilostazol en los eritrocitos sin ambigedad con
fi rms entrega exitosa de cilostazol a los eritrocitos con la ayuda de liposomas.
Se examin la estabilidad de los liposomas cargados con cilostazol. Datos DLS (Fig. 3)
muestran ningn cambio en el tamao medio y la distribucin del tamao de los liposomas
durante una semana de almacenamiento a 4 C. La fusin de liposomas, la razn principal
de su inestabilidad, se manifestara en el aumento del tamao medio y la ampliacin de la
distribucin de tamaos. La falta de cambio en estos parmetros (Fig. 3) indica la
estabilidad de los liposomas. Los experimentos en la entrega de cilostazol a los eritrocitos
se describen a continuacin se llevaron a cabo en diferentes momentos despus de la
preparacin de los liposomas cargados con cilostazol, entre varias horas y una semana sin
diferencia medible. La estabilidad de los liposomas de DMPC cilostazol-cargado es similar
a la estabilidad de los liposomas de DMPC en blanco se inform anteriormente [21].
3.2. Impacto de cilostazol liposomas emitido el comunicado de ATP a partir de eritrocitos
humanos y DM2 saludables
Estudios previos demostraron que la incubacin de DM2 eritrocitos con cilostazol restaura
la liberacin de ATP en respuesta a baja tensin de O2 [1]. Para evaluar la capacidad de los
liposomas que contienen cilostazol-para rescatar similarmente baja liberacin de ATP
inducida O-DM2 de los eritrocitos, las clulas de los seres humanos y los seres humanos
con DM2 sanos fueron incubadas con liposomas preparados a partir de DMPC con o sin
cilostazol.
En primer lugar, en una serie de experimentos de control, se determin que los eritrocitos
sanos no se ven afectados negativamente por liposomas DMPC y que responden a
cilostazol liposomas entregado. Cuando se incubaron con liposomas que no contienen
cilostazol, eritrocitos humanos sanos liberan ATP cuando se expone a la reduccin de la
tensin O (Fig. 4A). La liberacin de ATP era el mismo como se ha observado previamente
para eritrocitos sanos en ausencia de cualquier tratamiento. Es importante destacar que
estas clulas tambin liberan ATP en respuesta a este estmulo 2 cuando se incubaron con
liposomas que contienen cilostazol. Estos hallazgos ilustran que los liposomas de DMPC
cargadas con el inhibidor de PDE3 no tuvieron ningn efecto adverso en los eritrocitos
humanos sanos. Como se mencion anteriormente, el efecto de los liposomas en los
eritrocitos es-lpido especfico.
Eritrocitos DM2 no liberan ATP cuando se expone a la reduccin de O2 en presencia de
liposomas en blanco (Fig. 4B). Este resultado es idntico al comportamiento normal de los
eritrocitos en DM2 reducida entorno O [1]. Cuando se incubaron con liposomas que
contienen cilostazol, este estmulo result en la liberacin de ATP que no era diferente de la
cantidad liberada a partir de eritrocitos humanos sanos en las mismas condiciones (Fig. 4A
y B). Este hallazgo es similar a los resultados previamente publicados que demuestran que
la incubacin de DM2 eritrocitos con cilostazol en solucin. Ese estudio demostr que la
incubacin de eritrocitos con DM2 cilostazol (100 mM) result en un 105 745% de
aumento en la liberacin de ATP cuando las clulas fueron expuestas a baja tensin de
oxgeno [3]. Aqu nos muestran que la exposicin de la DM2 eritrocitos a los liposomas
cargados con cilostazol tambin rescata baja liberacin de ATP inducida por el oxgeno y
que los aumentos es 107 720% (po0.05, Fig. 4). Por lo tanto, los resultados presentados
aqu establecen que (1) la entrega mediada por liposomas de inhibidores de PDE3 a los
eritrocitos de seres humanos con DM2 restaura la respuesta fisiolgica a la exposicin a
bajo O2 y (2) la magnitud del rescate es similar a la observada cuando cilostazol es
incubaron directamente con estas clulas [3]. Combinado con experimentos que muestran la
retencin de cilostazol en liposomas, estos estudios confirman la entrega liposomal exitosa
de cilostazol y demostrar la factibilidad de lograr la administracin dirigida de los
inhibidores de PDE a los eritrocitos.
En resumen, hemos demostrado la entrega exitosa de cilostazol, un inhibidor de la PDE3, a
los eritrocitos, usando liposomas como vehculos. La eficiencia de la entrega de cilostazol a
los eritrocitos es sensible a la formulacin de liposomas. El uso de liposomas DMPC,
hemos sido capaces de lograr la entrega cuantitativa de cilostazol. Es importante destacar
que, cilostazol liposoma-entregado rescat la capacidad de los eritrocitos de seres humanos
con DM2 para liberar ATP en respuesta a bajo O. Orientacin de los eritrocitos para la
entrega de inhibidores de PDE3 podra tener signi fi no puede importancia de traslacin en
el tratamiento de la DM2.
Tradicionalmente, las formulaciones de liposomas para la administracin de frmacos
fueron diseados para prolongar el tiempo de circulacin de los medicamentos y para
minimizar sus interacciones con los componentes de la sangre. Aqu hemos explotado el
potencial para la interaccin de los liposomas con eritrocitos a nuestro favor. Los efectos
sistmicos de los inhibidores de PDE3 han limitado su utilidad en DM2 [8]. La
administracin dirigida de estos frmacos a los eritrocitos sera minimizar sus efectos
secundarios no deseados y representa un nuevo enfoque para el tratamiento de la
enfermedad vascular y la curacin de heridas retardada asociada con DM2.
referencia uncited
[25].
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la Fundacin Nacional de Ciencia (CHE-1.316.680 y CHE1522525), la Asociacin Americana de Diabetes, y el Fondo de Investigacin Presidencial
de la Universidad de Saint Louis. Damos las gracias a J. L. Sprague de inspiracin.